이 기사에서는 소수성 표면을 친수성으로 변경하는 단백질 기반 나노 입자 생산을 위한 프로토콜을 제시합니다. 생성된 나노입자는 글리아딘-시아노아크릴레이트 이중블록 공중합체의 집합체입니다. 생성된 나노입자를 스프레이 코팅하면 대상 물질의 표면이 친수성 표면으로 변합니다.
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이 논문에서
요약
초록
이 문서는 간단한 스프레이 코팅함으로써 친수성으로 소수성 표면을 변경 단백질 계 나노 입자의 생산을위한 프로토콜을 제공한다. 이러한 나노 입자는 곡류 단백질 (글 리아 딘) 분자의 표면 상에 알킬, 시아 노 아크릴 레이트의 중합 반응에 의해 제조된다. 시아 노 아크릴 레이트는 알킬기가 물질의 표면에인가 될 때 즉각적으로 RT에서 중합 단량체이다. 그 중합 반응은 수분을 포함하는 표면에 약 염기성 또는 구핵 종의 미량으로 개시된다. 중합 후에 니트릴 기는 폴리 (알킬 시아 노 아크릴 레이트)의 중추이기 때문에, 중합 된 알킬 시아 노 아크릴 레이트는 오브젝트 물질과 강한 친 화성을 나타낸다. 그들은 시아 노 아크릴 레이트의 중합을 개시 할 수 아민 그룹을 포함하기 때문에 단백질이 중합 개시제로서 작동합니다. 응집 된 단백질은 개시제로서 사용되는 경우, 단백질 응집물은 소수성 둘러싸여폴리 (알킬 시아 노 아크릴 레이트) 알킬, 시아 노 아크릴 레이트의 중합 반응 후의 체인. 실험 조건을 제어함으로써, 나노 미터 범위의 입자가 제조된다. 생성 된 나노 입자를 용이하게 유리, 금속, 플라스틱, 목재, 피혁, 직물을 포함하여 대부분의 재료의 표면에 흡착. 재료의 표면이 생성 된 나노 입자 현탁액을 분무하고, 물로 세정하는 경우, 나노 입자의 미셀 구조의 형태를 변경하고, 친수성 단백질은 공기에 노출된다. 그 결과, 나노 입자 표면에 코팅 된 친수성으로 변화시킨다.
서론
이 기사의 목표는 간단한 스프레이로 재료의 습윤 특성을 수정하는 나노 입자 현탁액의 준비 프로토콜을 보여주는 것입니다. 제시된 나노 입자 현탁액은 알킬 시아 노 아크릴 레이트1 및 시리얼 단백질 인 글리아딘2,3으로 만들어집니다. 제조 과정에서 단백질 응집체는 수성 에탄올4에서 형성됩니다. 단량체(알킬 시아노아크릴레이트)와의 후속 반응은 선형 고분자 사슬[폴리(알킬 시아노아크릴레이트)]으로 둘러싸인 단백질 코어로 구성된 나노 입자를 생성합니다.5.
Poly(alkyl cyanocrylate)는 생분해성이며 에멀젼 중합을 통한 나노 입자 생산에 사용되었습니다6. 이 반응은 물에서 해리된 수산기 또는 반응 매질7의 다른 친핵성 그룹에 의해 자발적으로 시작됩니다. 이 기사에 제시된 반응의 경우, 단백질 응집체 표면의 아민기는 알킬 시아 노 아크릴 레이트 단량체5,8의 중합 반응을 시작합니다. 이 반응의 결과로, 반응 매질에서 나노 입자가 형성됩니다. 나노 입자의 핵심은 단백질 응집체이고 외층은 폴리(알킬 시아노아크릴레이트)(PACA) 사슬입니다. 준비된 나노 입자는 대부분의 재료(보다 정확하게는 PACA가 흡착할 수 있는 모든 재료)에 강한 친화력을 가지며 표면에 부착되어 나노미터 규모의 얇은 코팅을 형성합니다. 간단한 스프레이 코팅으로 재료의 표면이 친수성으로 즉시 바뀝니다.
Gliadin은 밀의 배유에 있는 글루텐의 주요 분획 중 하나입니다. 글리아딘은 주로 분자량이 약 28,000 - 55,000인 단량체 단백질입니다. 수소 결합, 이온 결합 및 소수성 결합과 같은 비공유 결합은 글리아딘2의 응집을 담당합니다. 이 기사에서는 글리아딘이 반응물로 선택되었지만 다른 많은 단백질도 동일한 목적으로 사용할 수 있습니다. 그러나, 응집을 유도하기 위한 조건은 사용하고자 하는 단백질의 종류에 따라 달라지기 때문에 반응 조건을 적절하게 수정해야 한다8. 다른 단백질에 비해 글리아딘은 더 쉽게 구할 수 있고 정제가 간단하며 생산 비용이 저렴합니다. 에틸 시아노아크릴레이트(ECA)가 제시된 반응에 대한 단량체로 선택되지만, 동일한 반응에 다른 알킬 시아노아크릴레이트도 사용할 수 있습니다. ECA를 선택하는 이유는 저렴한 비용으로 쉽게 구할 수 있기 때문입니다.
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프로토콜
1. 탈지 상업 글 리아 딘
- 눈금 실린더 아세톤 150 ㎖를 측정하고 250 mL의 삼각 플라스크에 붓는다.
- RT에서 자석 교반기 스핀 막대로 교반하면서 상업적 글 리아 딘 분말 30g을 추가한다. 알루미늄 호일로 플라스크의 입구를 밀봉하고, 후드에서 O / N 감동을 계속.
- 필터 종이와 솔루션을 여과.
- 신선한 아세톤 (약 50 ㎖)로 여과 액을 씻으십시오. 10 분은 아세톤 배출 할 수 있도록 방치하자.
- 이러한 세포 배양 사각 접시로 큰 접시 아래 여과지와 함께 여과 전송. 잔류 아세톤의 증발 속도를 느리게하는 큰 필터 종이 전체 접시를 커버.
- 여과 액은 후드 O의 /의 N 완전히 건조하도록 허용합니다. 실온에서 밀폐 용기에 탈지 글 리아 딘을 저장합니다.
정제 된 글 리아 딘 2. 준비
- WA 150㎖의 측정눈금 실린더 터와 1,000 ㎖의 삼각 플라스크에 붓는다.
- 엉망 실린더와 무수 에탄올 350 ml의 측정과 동일한 1,000 ㎖의 삼각 플라스크에 붓는다. 더 버블이 혼합 용액으로부터 발생되지 않을 때까지 스핀 바 - (1,000 RPM 800) 격렬하게 교반 하였다.
- 교반하면서, 탈지 상업 글 리아 딘 분말 20g을 추가합니다. 중간에 공기가 들어 덩어리의 형성을 피하기 위해 한번에 소량으로 글 리아 딘을 추가한다. O / N 교반에 보관하십시오.
- 1,000 ml의 혼란 실린더에 전체 솔루션을 전송합니다. 이틀 동안 서 보자. 이 시간 동안, 불순물들은 상기 실린더의 바닥에 침전 될 것이다.
- 피펫으로 회전 증발기에 뜨는을 전송하고, 가능한 한 상층 액에서 에탄올을 제거합니다. 에탄올의 비율이 감소함에 따라, 글 리아 딘 집계과 솔루션에 표시됩니다.
- 메탄올 회전 / 침지하여 솔루션을 포함 글 리아 딘 집계를 고정/ 드라이 아이스 혼합물 및 동결 건조 진공 -70 ° C에서. 동결 건조하기 전에, 전체 솔루션은 액체없이 고정되어 있는지 확인합니다.
주 : 동결 건조 된 글 리아 딘이 다공성 고체를 형성 할 것이다. - 박격포와 유 봉 동결 건조 글 리아 딘을 분쇄하고, 고급 전원 (<0.5 mm)를 얻기 위해 커피 분쇄기로 분쇄. 실온에서 밀폐 용기 및 저장에 제품을 전송합니다.
글 리아 딘과 ECA 3. 중합 반응
- 무게 밸런스, 용기의 섬광 유리 병을 (부피가 약 20 ml의 경우) 놓습니다. scitillation 유리 병에 3.2 g 증류수 및 6.8 g 무수 에탄올을 추가합니다.
- 유리 병에 자기 스핀 바 (20 × 3mm)를 넣어 자석 교반기로의 섬광 유리 병을 이동하고 적극적으로 저어 - 공기 거품이 에탄올 혼합물로부터 생성되지 않을 때까지 (800 1,000 RPM을).
- 교반하면서 유리 병에 4 N 염산 40 μl를 추가합니다. STI는 동안 유리 병에 글 리아 딘 20mg을 추가 rring와 글 리아 딘의 분말을 완전히 에탄올의 혼합물에 용해 될 때까지 교반을 계속.
- 1,000 rpm으로 - 교반 속도가 여전히 800 동안 ECA 100 ㎕ - 확인한 후 글 리아 딘 솔루션은 육안에 분명하다, 천천히 (80)를 추가합니다.
- 500 rpm으로 교반 속도를 낮추고, 그리고 1 시간 동안 계속 교반 하였다. 반응이 진행됨에 따라, 중합 반응이 진행 중임을 나타내는 탁도를 관찰한다.
- 반응이 종료되면, 원심 분리 튜브에 용액을 전송하고, 상기 튜브의 무게 균형. 20 분 동안 10,000 × g으로의 반응 생성물을 원심 분리기. 이 기간 동안, 측면 제품 침전물과 나노 입자는 supernantant에 남아 있습니다. 부산물의 주요 성분은 PACA 단독 중합체이다.
- 원심 분리 후, 섬광 유리 병 (또는 밀폐 용기)에 피펫으로 제조 된 나노 입자 현탁액 (뜨는)를 전송하고 실온에서 보관합니다.
- 20 ㎖ 섬광 유리 병에 3.2 g의 물과 6.8 g 무수 에탄올을 혼합하여 68 중량 % 에탄올 10 g을 준비하고 더 거품이 혼합 용액에서 생성되지 않을 때까지 저어.
- 교반하면서 혼합 용액에 4 N 염산 40 μl를 추가합니다. 교반하면서 제조 된 에탄올 용액에 나노 입자 현탁액의 50 μl를 추가합니다.
- 상기 제조 된 샘플 용액을 사용하여 동적 광산란 (DLS)을 가진 나노 입자의 크기를 측정하고, 제조자의 지시에 따른다.
주 : 최종 제품의 크기가 작은 200nm 이하이어야한다. 이 200nm보다 큰 경우, 제품이 장기간 안정적 일 수 없다. 채용 된 ECA 신선한하지 않을 경우 더 큰 나노 입자가 생성된다.
제품 5. 시험
- 그러한 손 거울 유리판을 준비한다. 비누 물 유리 기판의 표면을 세척 할 것. 아르 자형흐르는 물과 유리 기판의 표면 INSE. 세척 된 표면을 건조하거나 다음 단계 건조하지 않고 사용합니다.
- 유리판의 일부에 3.6에서 수득 한 나노 입자 현탁액)을 스프레이하고, 즉시 흐르는 물 표면을 씻어 낸다.
- 유리판의 표면에 순수를 분무. 코팅되지 않은 표면이 분명하다 동안 코팅 (나노 입자 현탁액을 분무) 표면 유지 물 층을 준수하십시오.
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결과
나노 입자는 다양한 반응 조건으로 제조 할 수있다. 글 리아 딘 양식은 에탄올 함량 (5)의 넓은 범위에서 집계. 그러나, 응집체의 크기는 추가 층 (예., 중합 ECA)이이 집합에 추가되기 때문에 가능한 한 작게 할 필요가 있고,이 프로세스는 최종 크기가 더 크게된다. 입자의 최종 크기가 너무 크면, 입자가 불안정하고 쉽게 침전된다. 따라서, 68 % 에탄올 수용액을 반응 매체 (4)로 선택되었다. 제조 된 나노 입자의 크기는 수백 나노 미터 정도이다. 다음과 같이 생성 된 나노 입자와 친수성 코팅을위한 작동 메커니즘이다.
재료의 코팅 (68 % 에탄올에 현탁)이 나노 입자 현탁액을 물로 세척 한 다음 타겟 재료의 표면에 분사된다. 때 유모는 에탄올의 표면 장력이 매우 낮기 때문에 에탄올에...
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토론
나노입자 현탁액 생산에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 정제된 글리아딘에 불순물이 포함되어 있으면 ECA와의 반응으로 부산물이 생성됩니다. 이러한 원치 않는 생성물은 원심분리 단계에서 반응 매질에서 제거될 수 있지만 주요 생성물의 수율을 낮춥니다. 실험 단계 2.3) 중에 제조된 글리아딘 용액이 2일 후에도 상청액과 침전물 사이의 명확한 분리를 나타내지 않으면 용액을 더 오래 방치해야 합니다. ECA의 유통기한이 제한되어 있기 때문에 신선한 ECA를 사용하는 것이 가장 중요합니다.
오래된 ECA에서 부분적으로 중합된 ECA는 현탁 매질에서 안정하지 않은 더 큰 크기의 나노입자를 생성합니다. 각 반응물의 농도를 수정할 수 있습니다. 그러나 최종 제품의 크기와 안정성은 수정에 의해 영향을 받습니다. 따라서 생성된 나노입자가 응집체를 형성하는지 여부를 확인할 필요가 있습니다. 광학 현미경은 응집체의 크기가 수 마이크로미터 범위에 있기 때문에 이러한 목적으로 사용될 수 있습니다. ...
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공개 사항
이 간행물에서 상표명 또는 상업용 제품에 대한 언급은 특정 정보를 제공하기 위한 목적으로만 사용되며 미국 농무부의 추천 또는 보증을 의미하지 않습니다. USDA는 기회 균등 제공자이자 고용주입니다.
감사의 글
전문가 기술 지원 씨 제이슨 아드 킨스에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 에틸 시아노아크릴레이트(ECA) 단량체 | K& R International (Laguna Niguel, CA) | I-1605 | 모든 순수 ECA를 사용할 수 있습니다. |
| Gliadin | MGP Ingredients, Inc (Atchison, KS) | Gliadin 회사의 선물은 Sigma-Aldrich (cat # : G3375-25G)에서 구입할 수 있습니다. 글리아딘 대신, 모든 상업용 글루텐을 사용할 수 있습니다. | |
| HCl | Any | 모든 시약 등급 화학 물질을 사용할 수 있습니다. | |
| 아세톤: | 모든 | 시약 등급의 화학 물질을 사용할 수 있습니다. | |
| 메탄올 | 임의 | , 모든 시약 등급 화학 물질을 사용할 수 있습니다. | |
| 에탄올 (100 %) | 임의 | 모든 시약 등급의 화학 물질을 사용할 수 있습니다. | |
| 여과지 | : 10cm | 이상의 모든 등급 여과지를 사용할 수 있습니다. | |
| 세포 배양 사각형 접시 | 중 20 | × 20cm 이상의 어떤 요리라도 사용할 수 있습니다. | |
| 커피 그라인더 | Any | 모든 커피 그라인더를 사용할 수 있습니다. | |
| 회전 증발기 | 모든 | 회전 증발기를 사용할 수 있습니다. | |
| 동결 건조기 | Any | -70에 도달할 수 있는 모든 동결 건조기 ° C를 사용할 수 있습니다. | |
| 원심분리기 | Any | 1,000 x g를 도포할 수 있는 모든 원심분리기를 사용할 수 있습니다. | |
| 자석 교반기 | 모든 | 스핀 바를 1,000rpm으로 돌릴 수 있는 모든 자석 교반기를 사용할 수 있습니다. | |
| 동적 광 산란(DLS) | Brookhaven Instruments Corporation | NanoBrook Omni Zeta 전위 분석기 | 모든 회사의 DLS를 사용할 수 있습니다. |
| 주사 전자 현미경 (SEM) | Carl Zeiss Inc. | 모든 SEM을 사용할 수 있습니다. | |
| 동적 접촉각 (DCA) | Thermo Cahn Instruments | 모든 DCA를 사용할 수 있습니다. |
참고문헌
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