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방법 논문

의식 쥐에 주입 및 무선 막전위의 기록 및 Visual 사건 관련 전위

8.7K 조회수

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DOI:

10.3791/54160

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2016년 6월 29일

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1Department of Optometry and Vision Sciences, University of Melbourne, 2Pfizer Neusentis

이 논문에서

요약

우리는 녹음이 마취 교란없이 실시하고 있습니다 인간의 조건에 더 유사하다 눈 (전위도) 및 의식 쥐의 뇌 (시각 잠재적 유발)에서 시각 전기 생리 신호를 측정하는 수술 주입 및 녹음 과정을 보여줍니다.

초록

전체 필드 전위도 (ERG) 및 시각 유발 전위 (VEP)은 실험실과 임상 모두에서 망막과 시각 경로의 무결성을 평가하는 유용한 도구입니다. 현재 전임상 ERG와 VEP 측정은 안정된 전극 게재 위치를 보장하기 위해 마취로 수행됩니다. 그러나 마취 임재 정상적인 생리적 반응을 오염시키는 것으로 밝혀졌다. 이 마취 교란을 극복하기 위해, 우리는 의식 쥐의 ERG와 VEP를 분석 할 수있는 새로운 플랫폼을 개발한다. 전극은 수술 ERG을 분석하고 경막 VEP를 측정 할 수있는 시각 피질을 통해 할 수있는 눈에 서브 conjunctivally 주입한다. 진폭 및 감도 범위 / 타이밍 파라미터가 발광 에너지 증가에 ERG 및 VEP 양에 대해 분석된다. 르와 VEP 신호는 적어도 사주 후 수술 주입을위한 안정적이고 반복적으로 표시됩니다. 마취없이 ERG와 VEP 신호를 기록하는이 능력은 전임상들에 교란랩탑 설치는 임상 데이터에 우수한 번역을 제공해야한다.

서론

르와 VEP는 각각 실험실과 병원 모두에서 망막과 시각 경로의 무결성을 평가하는 생체 도구의 최소 침습 있습니다. 전체 필드 ERG는 망막 통로 1,2- 다양한 세포 종류를 대표하는 각각의 요소와 다른 구성 요소들로 분해 될 수있는 특성 파형을 산출한다. 고전 전체 필드 ERG 파형은 광 수용체 활동 후 빛에 노출 2-4을 대표하는 것으로 나타났다 초기 음의 기울기 (A-파)로 구성되어 있습니다. 다음은 파가 중간 망막, 주로 ON 바이폴라 세포 5-7의 전기 활동을 반영하는 상당한 양의 파형 (B-파)로 이어진다. 또한, 하나는로드 응답 (8)로부터 콘을 분리 광량 간 자극 간격을 변화 할 수있다.

플래시 VEP는 망막 빛 자극에 반응하여 시각 피질과 뇌 줄기의 전기 전위를 나타냅니다9,10. 이 파형은 레티노-geniculo-선조체 경로 11-13 쥐 11,13 다양한 V1 라미 수행 피질 처리를 나타내는 말 성분 뉴런의 활성을 반영하는 초기 요소와, 초기 및 후기 요소로 세분화 될 수있다. 따라서 ERG와 VEP의 동시 측정은 시각 경로에 관여 구조의 포괄적 인 평가를 반환합니다.

현재 동물에서 전기 생리학을 기록하기 위해, 마취 전극 안정적인 배치를 가능하게 사용된다. 이 의식 쥐 14-16에서 ERG와 VEP을 측정하려는 시도하고 있지만, 이러한 연구는 복잡 할 수 있고, 동물의 움직임과 자연의 행동 (17)을 제한하여 동물의 스트레스로 이어질 수 유선 설정을 사용하고있다. 향상된 소형화 및 배터리 수명을 포함한 무선 기술의 최근 발전과 함께, 그것은 ERG의에 대한 원격 측정 방식을 구현하는 것이 가능하다유선 녹음 장기 생존율의 개선과 관련된 스트레스를 감소 차원 VEP 기록. 원격 측정 프로브의 완전 내재화 안정적인 주입은 만성 온도, 혈압 (18), 활동 (19)의 모니터링뿐만 아니라 뇌파 (20)에 대한 성공을 입증했다. 기술의 이러한 발전은 만성 연구를위한 플랫폼의 유틸리티를 증가, 반복성과 의식 녹음의 안정성에 도움이 될 것입니다.

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프로토콜

윤리 문 : 동물 실험은 과학적 목적을위한 동물의 관리 및 사용 (2013)의 호주 코드에 따라 실시 하였다. 동물 윤리 승인은 동물 윤리위원회, 멜버른 대학에서 얻었다. 재료는 본 명세서 만 아니라 의학적 또는 수 의학적 용도를위한 실험실 실험이다.

1. 준비 전극

주 : 세 채널 송신기가 동시에 수행 될 2 ERG 1 VEP 기록 가능 외과 이식에 사용된다. 활성 비활성 및 3 개의 전극을 눈에 부착하기 위해 주입 전에 링 형상으로 사전 식 될 필요가있다. 비활성 전극 전체 색깔 덮개로 덮여있는 동안 식별 목적을 위해, 제조 업체, 절반 흰색에 반 색깔의 플라스틱 덮개를 활성 전극을 동봉했다. 접지 전극 (투명 플라스틱 외피) 변경되지 않고 남아있다. 모든 활성 및 비활성 ELECTR에 대한송시 행위는 1.1, 1.2, 1.3 및 1.7 단계를 반복합니다.

  1. 이 뾰족한 펜치로 이중 가닥 스테인레스 스틸 전극을 꼬인 것이 풀리다.
  2. 링 전극을 형성하는 나머지 하나의 긴 직선 가닥두고 스테인리스 스트랜드 (선단으로부터 약 1cm) 중 하나를 낸다.
  3. 전극의 팁에서 매끄러운 고리를 형성하고, 다시 그 자체 트위스트 상 스테인리스 단일 가닥 접어.
  4. 르 활성 전극 패션이 루프 ~ 0.2 - 루프의 염기 꼬아 직경 0.5 mm (여기에 설명 된 목적을 양쪽 눈으로부터 ERG를 기록하기 위해 이러한 방식으로 두 개의 활성 전극을 형성)을위한 ERG 비활성 VEP 전극 루프 직경은 ~ 0.8 mm 직경 (이 예에서는 하나의 능동 VEP 전극과 세 비활성 전극 용 이렇게) 만든다.
  5. 스테인리스 나사 (직경 0.7 mm, 길이 3mm) 때문에 전극이 스크루 헤드의 주위에 얹혀 원형 VEP 활성 전극 후크.
  6. 출동제 스테인리스 나사 (직경 0.7 mm, 길이 3 mm)의 주위에 3 비활성 전극 (ERG이 1을 VEP) K.
  7. 자극을 줄이기 위해 두 개의 스테인리스 스틸 가닥의 날카로운 끝을 통해 앞으로 플라스틱 슬리브를 당깁니다.
  8. 약 25 ° C에서 10 개 이상의 시간 동안 2 % 글루 타르 알데히드에 몸을 담근하여 원격 측정 송신기를 소독. 그런 다음 멸균 생리 식염수 3 회와 송신기를 씻어.

2. 송신기 주입

  1. 동물 준비
    1. 70 % 에탄올로 세정하여 실험 전에 수술 영역 소독. 사용하기 전에 모든 수술 장비를 압력솥와하지 않을 때 수술 중 사용 클로르헥시딘 장비를 유지한다. 멸균 환경을 유지하기 위해 수술 중 수술 용 드레이프 동물 커버. 모든 실험자 수술 마스크, 멸균 장갑과 가운을 착용해야합니다.
    2. 3 L / 분 maintai의 유량으로 2 % 이소 플루 란 - 1.5 마취 유도수술을 통해 2 L / 분에서 2 % - 1.5 네드. 발가락 사이의 근육을 곤란에 페달 반사의 부재에 의해 마취의 충분한 깊이를 확인합니다.
    3. 흉골에 사타구니 위에서 복부를 통해 40mm X 30mm의 영역을 면도.
    4. 눈에 이마를 통해 후방을 30mm의 X 20mm의 영역을 면도하고 귀에 전방.
    5. 두 면도 영역을 소독. 이마 지역의 경우 10 % 포비돈 - 요오드 세 번 (외과 기술자 협회에 의해 설정 연습의 표준에 부합되고, 눈 주변 지역에 대한 알코올 계 소독제의 사용을 방지)으로 소독. 복부에 걸쳐 10 %, 포비돈 요오드 및 70 % 에탄올로 소독.
    6. 추가 국소 마취의 각막에 proxymetacaine 1 방울을 적용합니다.
    7. 눈의 건조를 방지하기 위해 각막에 카르복시 메틸 셀룰로오스 나트륨 1 방울을 적용한다.
  2. 외과 이식
    1. 10 밀리미터 절개를합니다수술 용 메스와 귀 사이의 수직 중간 선을 따라 머리에.
    2. 흉골 아래의 중간 선을 따라 피부 층을 통해 복부에 5mm의 절개를합니다.
    3. 터널 헤드 절개에 복부 절개에서 5mm 직경 캐 뉼러 피하.
    4. 머리 복부에서 캐 뉼러를 통해 상기 송신기의 전극 배선 (3 활성 및 비활성 3)를 공급.
    5. 송신기베이스 기준 전극을두고 무균 거즈에 전극의 끝 부분을 커버합니다.
    6. 무균 거즈와 전극의 끝 (3 활성 및 비활성 3)을 커버.
    7. 정위 플랫폼에 쥐의 머리를 고정합니다.
    8. 수술 가위로 길이 30mm로 이마의 절개를 확장합니다.
    9. 3 ~ 9시에 - 2 봉합 (0 ~ 3)으로 느슨한 피부를 수축하여 수술 영역을 노출.
    10. 브레 그마, 람다 및 정중선 봉합을 노출 멸균 거즈를 이용하여 두개골을 덮는 골막 긁어.
    11. VEP 활성의 두개골을 통해 두 개의 구멍을 드릴 정위 좌표를 (정중선에서 정수리 5 밀리미터 주동이) 및 비활성 (7mm은 복부 정중선 외측 3mm를 정수리합니다).
    12. 작은 스크류 드라이버 미리 만들어진 구멍에 깊이 ~ 1mm에와 두개골에 미리 부착 된 스테인레스 스틸 나사 (직경 0.7 mm, 길이 3mm)로 VEP 활성 및 비활성 전극을 연결합니다. 이것은 기본 피질 조직을 손상시키지 않고 뼈 나사 앵커.
    13. 일시적으로 눈꺼풀을 철회 0 봉합 - 르 활성 전극 8을 사용하여 이식합니다.
    14. 우수한 결막 원개까지 눈 뒤에서 16 G 21 정맥의 피하에 삽입합니다.
    15. 가이드 바늘을 제거합니다.
    16. 눈으로 이마에서 단축 플라스틱 카테터를 통해 활성 전극을 공급. 그런 다음 플라스틱 카테터를 제거합니다.
    17. ELEC 않도록, 전극 루프를 통해 나사 결합, - 임시 봉합사 (0-8)를 사용하여다시 터널로 후퇴에서 trode.
    18. 12시, 윤부 뒤에 1mm에서 우수한 결막에 0.5 mm의 절개를합니다. 기본 공막을 노출 무딘 절개를 사용합니다.
    19. 반 공막 두께의 윤부 바로 뒤에 0 봉합 - 0 또는 9 - 8을 이식.
    20. ERG 활성 전극에서 임시 봉합을 제거합니다.
    21. 전극의 끝 부분을 보장 3 연속 매듭을 묶는하여 반 공막 두께 봉합에 ERG 활성 전극을 고정은 윤부 부근에 자리 잡고 있습니다.
    22. (0 - - 9 0 8) 1 ~ 2 중단 봉합사를 이용하여 결막 플랩을 닫습니다. 결막이 완전히 편안함을 개선하기 위해 ERG 전극을 커버 있는지 확인합니다.
    23. 눈꺼풀 후퇴 봉합사를 제거합니다.
    24. 반대편 눈의 절차를 반복합니다.
    25. 모든 스테인리스 나사와 전극 와이어를 확보하기 위해 두개골을 통해 시아 노 아크릴 레이트 젤을 적용합니다. 확인합니다 ERG 활성 전극은 실내에 고정하기 전에 너무 꽉 끌어되지 않습니다수 안구의 움직임.
    26. 0 봉합 - 비 흡수성 3를 사용하여 머리에 상처를 닫습니다.
    27. 복부를 노출 설치류를 돌립니다. 수술 가위로 원격 교육 알바를 따라 40mm의 복부 피부 절개를 길게.
    28. 내부 복강을 노출 내부 근육 벽을 통해 35 밀리미터 절개를합니다.
    29. 이 봉합 (가) 3 - 0 ()를 사용하면 동물의 오른쪽 내부 복부 벽에 송신기 본체를 연결합니다. 간 접촉하지 마십시오.
    30. 루프 접지 전극과 봉합사 (3-0)이 모양 보안. 이 복강에 자유 떠 놓습니다.
    31. 연속 봉합 (0 - 3)를 사용하여 복막을 닫습니다.
    32. 중단 봉합 (0 - 3)를 사용하여 피부 절개를 닫습니다.
  3. 수술 후 관리
    1. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 동물을 모니터링합니다. 집은 동물 단독으로 수술을 다음과 같습니다.
    2. carpr 관리OFEN 피하 4 일 동안 하루에 한 번 진통제 (5 ㎎ / ㎏)합니다.
    3. 칠일 후 수술을 위해 식수에 예방 경구 항생제 (Enrofloxin, 5 ㎎ / ㎏)를 추가합니다.
    4. 첫 번째 7 일 후 수술 자극을 줄이기 위해 피부 절개 사이트에 항 염증 연고를 적용합니다.

의식 쥐 3. 행동 ERG와 VEP 녹음

  1. 다크 전에 ERG와 VEP 녹음 12 시간 동안 동물을 적용
  2. 어두운 붉은 조명 (17.4 cd.m -2, λ 최대 = 600 ㎚)에서 모든 실험 조작을 실시
  3. 국소 마취 (0.5 % proxymetacaine) 및 확장시키고 (0.5 % tropicamide) 각막에 방울을 적용합니다.
  4. 사용자 정의 만든, 명확한 제한 수단으로 의식 쥐를 안내합니다.
    주 :이 플라스틱 튜브의 길이는 60mm로 고정 전체적인 직경이 다른 크기의 래트를 수용하도록 조절 될 수있다. 상기 장치의 전방 단부는 헤드 (MO)을 최소화하기 위해 테이퍼vement과 정상적인 호흡 수 있도록 구멍이 포함되어 있습니다. 이 테이퍼 전면는 Ganzfeld 구의 개방에 정렬 및 쥐의 머리와 눈의 안정화 할 수 있습니다. 설치류가 제한 수단 (3 ~ 5 차례) 이전에 수술에 순응되어 있습니다.
  5. 그릇의 입구에 정렬 된 눈을 가진 Ganzfeld 그릇 앞의 쥐를 놓습니다.
  6. 송신기의 ~ 5cm 내에서 자석을 전달하여 내주 송신기의 전원을 켭니다. 송신기는 수신기베이스의 LED 상태 표시등을 확인하여 켜져 있는지 확인합니다.
  7. 이전 21 설명 된 바와 같이 발광 에너지 (즉, -5.6 1.52 로그에 cd.sm -2)의 범위에서 신호를 수집합니다. 간략하게, 밝게 빛나는 에너지의 주차 빛 수준 (~ 80 반복) 이하에서 평균 이상의 신호 (1 ~ 반복). 점차적으로 가장 어두운 영역에서 가장 밝은 빛 레벨 1 180 초에서 interstimulus 간격을 연장.
  8. 르로드를 분리하려면콘 응답은 트윈 플래시 패러다임 (8)을 사용한다. 예를 들어, 1.52 로그 cd.sm 두 깜박 -2 년 사이에 500 밀리 초 간 자극 간격을 시작합니다.
  9. 밝은 발광 에너지에서 VEP 신호, 평균 20 반복을 기록하기 위해 (즉, 1.52 로그 cd.sm -2, 5 초 간 자극 간격).
  10. ERG 및 VEP 기록 7, 10, 14, 21 및 28 일 후 수술을 수행하는 시간이 지남 신호 변동에 의해 평가된다 임플란트 안정성을 평가한다.
  11. 자일 라진 마취 (12 : 1 ㎎ / ㎏) 실험 기간에 따라, 케타민 후 pentobarbiturate의 intracardial 주입 (1.5 ㎖ / ㎏)를 통해 쥐를 안락사.

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결과

감광체 응답은 램과 퓨의 모델에 기초하여, 각 동물에 대한 상위 2 발광 에너지 (1.20, 1.52 로그 CSM -2)에서 ERG 응답의 초기 하강 사지의 전연 지연 가우시안 피팅에 의해 분석되고 (22)는 후드와 자작 나무 (23)에 의해 공식화. 이 공식은 진폭과 민감도 매개 변수 (그림 1C 각각 1D를) 반환합니다. 쌍곡선 함수는 또한 진폭과 민감도 매개 변수 (그림 1E 및 1F 각각)을 반환 각 동물에 대한 막대 양극 세포의 발광 에너지 응답에 장착되었다. 콘 바이폴라 셀 진폭이 피크 반응에 도달하는 데 걸린 시간으로 촬영 암시 시간 파형의 피크 응답 (도 1a 및도 1b의 정상 파형)으로 분석 하였다. 자세한 사항은 ...

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토론

때문에 시각 전기 생리학의 최소 침습 자연, 인간 환자의 ERG와 VEP 기록은 의식이있는 상태에서 수행에만 전극 배치를위한 국소 마취제의 사용을 요구하고 있습니다. 반면에, 동물 모델에서 시각적 전기 생리학 종래 자발적 눈과 몸체 움직임을 제거하여 안정적인 전극의 배치를 가능하게 전신 마취 하에서 수행된다. 이전 공보 25-27 24 등으로 도시하지만, 일반적으로 사용되는 전신 마취제는 ERG 및 VEP 응답을 변경. 설치류 모델의 의식 ERG와 VEP 플랫폼 등의 개발로 차례로 임상 연구 결과를 임상에서 더 나은 번역 가능성을 줄 수있다 동물 모델에서 생리적 반응의 우수한 표현을 제공합니다. 마취를 사용하는 또 다른 단점은 실험의 기간을 제한한다는 것이다. 구체적으로는, 반복 administ뿐만 아니라 장기간의 마취제의 사용마취제의 배급은 약물 구축 및 관련 호흡기 문제 (28)과 같은 부작용의 가능성을 증가시킬 수있다.

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공개 사항

RG와 RF는 이 연구의 상업적 자금 제공자(화이자 노이센티스 및 화이자 글로벌 리서치)의 직원입니다. MI는 이 연구 기간 동안 Pfizer Global Research의 직원이었으며 현재 Proteostasis Therapeutics(미국 케임브리지)의 직원입니다.

감사의 글

JC는 이 원고를 집필하는 데 재정적 지원을 해준 멜버른 대학교의 데이비드 헤이 추모 기금(David Hay Memorial Fund)에 감사의 뜻을 전합니다. 이 프로젝트에 대한 자금은 ARC Linkage 보조금 100200129(BVB, AJV, CTON)에서 제공했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
생체 증폭기ADInstrumentsML 135ERG 및 VEP 신호 증폭
카르복시메틸셀룰로오스 나트륨 1.0%AllerganCAS 0009000-11-7수술 중 각막 수분 유지
Carprofen 0.5%Pfizer Animal Health GroupCAS 53716-49-7수액 보충을 위해 주사 가능한 식염수를 투여하는 수술 후 진통제
클로르헥사딘 0.5%Orion Laboratories27411, 80085수술 기구
소독 시아노아크릴레이트 젤 활성제RS 구성 요소473-439빠르게 건조 시아노아크릴레이트 젤
시아노아크릴레이트 젤RS 구성 요소473-423두개골에 스테인리스 나사 고정
치과 버Storz Instruments, Bausch 및 LombE0824AVEP 나사를 이식하기 위해 각 반구의 두개골에 작은 구멍을 만들기위한 ~ 0.7mm 직경의 소형 드릴 헤드 드릴
BoschDremel 300 시리즈트레패닝용 자동 드릴
EnrofloxinTroy Laboratories예방적 항생제 포스트 surgey
Ganzfeld 통합 구광도 측정 솔루션 국제맞춤형 광 자극기 : 직경 36mm, 조리개 13cm 크기
거즈 면봉Multigate Medical Products Pty Ltd57-100B수술 절개 및 노출 된 두개골 표면 건조
수술 중 Isoflurane 99.9 %Abbott Australasia Pty LtdCAS 26675-46-7소유명: Isoflo(TM) 흡입 마취제. VEP 전극 임플란트 수술
Kenacomb 연고Aspen Pharma Pty Ltd수술 후 피부 자극 및 가려움증을 줄이기 위해
Luxeon LEDPhillips Lighting Co.광 자극을 위해 20 개의 5 W 및 1 개의 1 W LED가 스코프 소프트웨어로 제어
바늘 (매크로 수술)World Precision Instruments501959복부 및 머리 수술 봉합에 사용되며 3-0 봉합사, 눈 바늘, 커팅 엣지 5/16 서클 크기 1, 15mm
바늘 홀더 (매크로 수술)World Precision Instruments500224복부 및 머리 수술
중 바늘을 잡기 위해바늘 홀더 (미세 수술)World Precision Instruments555419NT안구 수술 중 바늘을 잡기 위해
Optiva 카테터Smiths Medical International LTD16 또는 21 G가이드 두개골에서 결막까지 각막 활성 전극
포비돈 요오드 10%Sanofi-AventisCAS 25655-41-8소유명: Betadine, 수술을 위해 면도한 피부를 준비하기 위한 방부제 10%, 500 ml
Powerlab 데이터 수집 시스템ADInstrumentsML 785텔레메트리 송신기에서 신호 획득, 텔레메트리 데이터 컨버터
Proxymetacaine 0.5%Alcon Laboratories CAS 5875-06-9토피칼 안구 진통
Restrainercutom 제작Restrainer의 앞면은 머리 움직임을 최소화하기 위해 테이퍼되어 있으며, 길이는 다양한 랫 길이를 수용할 수 있도록 조정할 수 있습니다. 전체 직경은 60 mm입니다.
Scapel bladeR.G. Medical SuppliesSNSM0206외과 절개
가위(매크로 수술)World Precision Instruments복부 및 앞머리 조직 절단용
501225 가위(미세 수술)World Precision Instruments501232전극 부착을 위한 결막 해부
범위 소프트웨어ADInstruments버전 3.7.6동시에 ADI Powerlab 시스템을 통해 자극을 트리거하고 데이터를 수집합니다.
버오스터골든 A5쉐이브 퍼
스테인리스 스트릴 나사 MicroFastenersL001.003CS3040.7 mm 샤프트 직경, 3 mm 길이 
입체 프레임David Kopf모델 900두개골의 이식 랜드 마크를 찾기위한 작은 동물 입체 기구
수술 용 드레이프Vital Medical SuppliesGM29-612EE수술 중 멸균 환경 보장
봉합사 (거대 외과)Ninbo 의료 바늘3-0, 멸균 실크 꼰, 60cm
봉합 바늘 ( 미세수술)Ninbo 의료용 바늘8-0 또는 9-0안구 수술 포함, 공막에 전극 봉합 및 결막 상처 봉합, 나일론 봉합사, 3/8 원 1 × 5, 30 cm
텔레메트리 데이터 변환기 DataSciences InternationalR08사용하면 텔레메트리 신호가 데이터 수집 소프트웨어와 인터페이스할 수 있습니다
텔레메트리 데이터 교환 매트릭스DataSciences International송신기에서 데이터를 수집하고 수신기와 페어링
텔레메트리 데이터 수신기DataSciences InternationalRPC-1송신기에서 텔레메트리 데이터 수신
메트리 송신기DataSciences 국제F50-EEE3 채널 텔레메트리 송신기
트로피카미드 0.5%Alcon Laboratories 홍채 확장
핀셋 (거대 외과)World Precision Instruments500092복부 및 머리 수술 중 조직 조작
핀셋 (미세 수술)World Precision Instruments500342안구 수술 중 조직 조작
를 위한 산소 가스와 혼합된 제약 등급 흡입 마취제 됩니다 수술 부위에서 쉐이, 복부 및 머리 수술 봉합을위한 을 텔레

참고문헌

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  5. Kline, R. P., Ripps, H., Dowling, J. E. Generation of b-wave currents in the skate retina. Proc Natl Acad Sci U S A. 75, 5727-5731 (1978).
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