방법 논문

면역 조직 화학적 및 면역 형광 분석을위한 창자 조직 준비를위한 향상된 스위스 압연 기술

DOI:

10.3791/54161

⸱

2016년 7월 13일

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Stony Brook University School of Medicine, 2Department of Physiology & Biophysics, Stony Brook University School of Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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정확한 식별 및 장 점막 안감을 따라 상피 세포의 위치는 다른 세포 계보를 정의하는 것이 필수적이다. 장 조직의 적절한 촬상 최대 해상도 단백질 발현 패턴을 식별하기 위해 중요하다. 이 연구는 처리 마우스 장 조직을위한 최적의 방법과 조건을 서술하는 것을 목표로하고있다.

초록

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장 상피 항상성을 조절하는 요인의 역할과 부상 및 재생에 대한 반응을 이해하는 것이 중요합니다. 현재 문헌에서는 데이터 검증을 위해 장 조직의 이미지를 얻기 위한 여러 가지 방법론적 접근 방식을 설명합니다. 이 논문에서는 마우스 장 조직의 유도 및 처리와 관련된 일반적인 프로토콜에 대해 설명합니다. 장 조직의 적절한 고정과 장 상피 형태를 향상시키는 스위스 롤 기술에 대해 논의합니다. 절제 후 처리 및 포매된 장 조직의 재배치는 절제 후 온전한 장 구조적 특징을 나타내는 파라핀 포매 블록을 얻는 데 중요합니다. 스위스 롤링 기법은 검사된 전체 장 또는 결장 절편의 조직학적 평가에 도움이 됩니다. 장의 구조적 특징을 구별하는 능력은 전체 길이에 걸친 장 염증 및 종양 형성을 정량적으로 측정하는 데 중요할 수 있습니다. 마지막으로, 파라핀 함유 절편은 면역조직화학 및 면역형광 검출 방법을 모두 사용하는 견고한 공정에 이상적입니다. 비형광 면역조직화학 절편은 다양한 세포 구조적 특징을 자세히 설명하는 조직의 생생한 이미지를 제공하지만 세포 내 공동 국소화 실험에 유연성을 제공하지는 않습니다. 다중 형광 채널은 공동 국소화 실험을 위해 면역형광 검출과 함께 적절하게 활용될 수 있어 기계론적 연구를 지원합니다.

서론

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포유류 장 상피 원주 세포의 단일 층을 포함한다. 분화 된 세포가 융모의 영역을 차지하면서 소장에서 증식 세포 지하실에 국한된다. 대장에는 융모 없기 때문에 그러나 증식 세포 지하실의 바닥에 지역화 및 분화 세포 소낭의 상부 영역을 차지한다. 지하실 내 증식 성 세포의 연속 분할에 의해 구동된다 - (5 일 3) 장 상피 신속한 보급을 겪는다. 지하실의 증식 성 세포는 균질 집단 아니며 상기 줄기 세포와 교통 증폭 (TA) 셀 (1)로 세분화된다. 이 바로 아래에서 5 세포 - 줄기 세포는 제 4 내 토굴 하단에 상주. 굴베이스 기둥 (CBC) 줄기 세포 및 예비 정지 줄기 세포 : 현재의 모델은 두 가지 줄기 세포 유형의 존재를 지원한다. CBC의템 세포는 활발하게 증식하고 류신이 풍부한 반복 포함하는 G 단백질 결합 수용체 5 (Lgr5) 3, Olfactomedin 4 (Olfm4) 4 Achaete의 방패 꼴의 뼈 조각 같은 2 (Ascl2) (5)로 표시됩니다. 한편, 예비 정지 줄기 세포는 B 세포 특이 몰 로니 뮤린 백혈병 바이러스 통합 위치 1 (BMI1) 6 마우스 텔로 머라 제 역전사 (mTert) (7)에 의해 표시되어, HOP 호 메오 박스 (Hopx) 8 Doublecortin 형 캠 키나제 -like 1 (Dclk1) (9), 및 류신이 풍부한 반복 및 면역 글로불린 같은 도메인 1 (Lrig1) 10. 능동적 증식 줄기 세포를 흡수 셀 (장 세포) 및 분비 세포 (장 내분비, 잔, Paneth 및 다발 세포)로 분화를 더 받아야 TA 세포 일으킨다. 그들은 세포 사멸을 받아야하고있는 융모의 상단에 도달 할 때까지 증식 영역에서 지속적인 세포 분열은 토굴-융모 축을 따라 상피 세포의 상향 이동 결과상피의 표면으로부터 벗겨진. 장 상피 세포의 종류 (예를 들어, 장 배 세포가 리소자임에 대한 항체 및 MUC2 Paneth 세포에 대한 항체로 염색하여 인식 할 수있다) 별개의 단백질의 발현에 의해 표시된다. 우리는 장 상피 11-13의 항상성 및 병리 생물학에서 크 룹펠 같은 요인 (KLFs)의 역할을 연구한다. 변형 스위스 - 롤링 방법의 타당성을 지원 여기에 제시된 결과는 활발히 증식 장내 상피 줄기 세포 (14)의 유지 보수 크 룹펠 형상 인자의 역할 5 (KLF5)의 이전 연구에 기초한다. KLF5는 매우 활성 장 줄기와 TA 세포 (12)로 표현된다 아연 손가락 전사 인자이다. 이전 연구는 KLF5이 기-67, 장 지하실에서 알려진 증식 마커와 공동으로 표현되는 것을 보여 주었다.

위장 TR 행위는 구조적으로 또는 기능적으로 균일 한 조직이 아니다. 소장은 근위부, 중간, 말단 부분으로 나누어 후자의 추가와 함께, 십이지장, 공장 및 회장과 맹장과 결장으로 대장으로 구분된다. 이 섹션은 각각 고유의 조직 학적 특징을 가지고 있으며, 서로 다른 역할 (15)을한다. 이와 같이, 욕설 효과 및 장 상피 세포의 반응의 정도를 연구 조직 (16)의 영역에 의존 할 수있다. 또한, 다양한 마우스 균주는 시험 16에 사용 모독의 유형에 기초하여 조직 학적 수준의 응답의 다양성을 증명한다. 따라서, 티슈 제조 어울리는하여 적절한 조직 학적 및 장 조직의 분자량 분석을 허용 할 필요가있다. 이와 같이, 스위스 롤 기술을 부여 한 번에 장 상피 세포의 전체 길이의 분석 따라서 포괄적 인 정보를 기반으로 박식 한 결론을 확인한다.

e_content "> 스위스 롤 기법 제 매그너스 (17)에 의해 언급 한 Moolenbeck 및 Ruitenberg 및 공원 등에 의해 상세하게 설명 하였다. 조직을 준비하고 조직학을 수행하는 방법은 쥐 소장 18,19 각각. 프로토콜 분석으로 진단 목적을위한 적절하고 신뢰성있는 티슈 제조 허용 일본어 방법의 개선 된 버전이 공보에 제시 묘사. 이러한 변형 기술은 효율적인 수집 및 면역 조직 화학, 면역뿐만 아니라 세계적으로 사용되는 기술에 대한 장 상피 세포의 제조를 허용 추가 평가를 위해 (형광 및 발색 20) 현장 하이브리드에있다. 또한, 제조 방법 표본 수정 된 조직은 신속한 조직 고정하는 방법을 제공하는 동안 쉽게 사용 가능하고 상대적으로 저렴한 시약을 이용하여 단백질, DNA의 복구를 위해 수 있으며, RNA. 카메라 함께 생의 기술은 장 상피 세포의 조직 병리학 병리학, 분자 기능의 종합 평가 우수하다.

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프로토콜

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1. 마우스

  1. 마우스와 관련된 모든 연구는 스토니 브룩 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 마우스는 12시 12분 시간의 명암주기를 유지 하였다.
    1. 상업적으로 C57BL / 6 마​​우스를 얻을 수 있습니다. 에 loxP 사이트에 의해 형벌 Klf5 대립 유전자 (Klf5 f를 L / F 리터)을 들고 C57BL / 6 마우스를 얻습니다. 이 마우스는 이전에 (21)을 설명하고 우아 박사 료조 나가이에 의해 제공되었다.
  2. Lgr5 프로모터 (Lgr5-EGFP / CreERT2 마우스)의 규정에서 유도 Cre 호텔의 재조합 효소 유전자를 운반하는 C57BL / 6 마​​우스를 구입하십시오.
  3. Lgr5-EGFP / CreER T2 / Klf5 f를 L / f를 리터 마우스를 설정하려면, 교차 Klf5 FL / F Lgr5-EGFP / CreER T2 마우스와 다음 Klf5 FL / F 리터의 자손을 역 교배 리터 마우스 마우스.
  4. 프로토콜에 따라 타목시펜으로 치료 마우스는 이전 22 설명했다. 연속 5 일 동안 멸균 옥수수 기름에 용해 타목시펜 1 밀리그램 (10 ㎎ / ㎖) 8 주령의 실험 및 대조군 마우스의 복강 (IP)을 주입한다.
  5. 첫 번째 타목시펜 주사 후 14 일에서 2 가스 소스를 CO에 연결 챔버에 배치하여 CO 2 질식을 사용하여 마우스를 희생. 마우스 의식하고 모든 움직임이 중단 될 때까지 가스가 챔버로 유입 할 수 있습니다. 안락사는 자궁 경부 전위를 수행 할 수 있도록합니다.

2. 조직 준비 및 스위스 롤링

  1. 해부 집게와 가위를 사용하여 복부 쪽의 피부에 절개를 잘라. 포셉 한 쌍으로, 절개 부위의 피부를 잡고 부드럽게 떨어져 복부 근육 조직에서 빼냅니다. 복부 근육을 복부 피부를 잘라 노출 가위를 사용합니다.
  2. 잡고 흥을 끌어포셉으로 ritoneum. 잡고 창자에서 당겨 할 수 없습니다 있는지 확인하십시오. 조심스럽게 복막 조직의 절개를하고 복부 근육을 노출 피부를 멀리 절단을 계속합니다. 조심스럽게 복부 근육의 절개를하고 장을 노출을 멀리 절단을 계속합니다.
  3. 콜론를 확인하고는 직장 / 항문을 조인 말단부에 추적. 가위로, 가능한 한 항문에 가깝게 잘라.
  4. 위를 확인하고는 소장과 결합 위치를 추적. 가위로 약 1cm 떨어진 위장에서 소장 무료 잘라. 인산염 완충 식염수 (PBS)를 포함하는 깨끗한 페트리 접시에 해제 소장과 대장의 전체 길이를 전송합니다.
  5. 한 손 또는 집게 쌍으로 결장의 말단부를 잡고있는 장간막 부드럽게 결합 및 / 또는 지방 조직에서 콜론의 전체 길이를 해명 한편을 사용한다.
  6. 맹장을 식별(작은 크고 작은 창자 사이 파우치)과 맹장과 결장은 대장을 무료로 (콜론의 기단부)에 가입 위치를 잘라.
  7. 한 손이나 집게 한 쌍으로, 소장을 잡고 조심스럽게 모든 장간막 결합 및 / 또는 지방 조직에서 소장의 전체 길이를 해명하기 위해 다른 손을 사용합니다. 맹장을 절취하고 필요가없는 경우 버린다.
    밤새 처리가 DH (2 O 50 % 에탄올 / 5 % 아세트산)의 변형 Bouin 정착액의 밖으로 해부 창자 배양하여 여기에 정지 될 수 있고, 다음 날의 절차를 계속 참고.
  8. 소장 (소장 또는 대장)의 하나의 세그먼트를 처리, 수정 Bouin의 정착과 함께 10 ML의 주사기를 작성하고 그것에 위관 바늘을 연결합니다. 장 세그먼트 (segment)의 전방 구멍에 반 센티미터에 대해 바늘을 삽입합니다.
  9. 악기에 확실히 압력을인가함으로써 장 구간 안에 위관 니들을 잡아장 세그먼트. 한편 주사기 채 수정 Bouin의 정착액을 이용하여 장 구간의 내용을 플러시 완만하지만 일관된 압력을 적용한다. 이 단계는 장 세그먼트 즉시 고정 동시에 청소를 할 수 있습니다. 플로우를 통해 폐기물을 수집하는 페트리 접시를 사용합니다. 고정 불투명 선회 결장 색으로 관찰 할 수있다.
    참고 : 세척하거나 장 세그먼트가 오픈 버스트 수있는 동안 너무 많은 압력을 가하지 않도록해야합니다.
  10. 가위를 사용하여 장간막 라인을 따라 길이 방향으로 장 세그먼트를 열 잘라. 한 쌍의 겸자로 잡아하고 PBS를 함유하는 페트리 접시에 간단히 린스.
    1. 근위부, 중간 및 원위부 : 3과 동일 세그먼트로 소장을 잘라. 근위 세그먼트는 위 다음 바로 하나이며, 말단 부분은 콜론 전에 즉시 하나입니다. 근위 세그먼트에 십이지장, 소장의 중간 및 말단에 해당회장.
    2. 각 세그먼트의 근위 및 원위 단부를 표시한다. 선단부는 원래 위를 향해 가리키는 된 하나는 콜론으로 지적 말단이다.
  11. 세정 및 열 장 세그먼트를 배치하는 페트리 접시의 상단을 사용합니다. 내강면이 위를 향하도록 장 세그먼트를 배치합니다.
    1. 콜론의 경우, 그것의 폭을 가로 질러 실행 variegations / 능선에 의해 내강면을 식별하고 기단부에 존재한다. 중간 및 말단 영역은 길이 방향으로 실행 일부 variegations 있습니다. 소장의 경우, 융모를 표시하는 거친 나타나는 표면에 의해 내강 측을 식별합니다.
      참고 : 작은 창자를 들어, 근위부, 중간 및 말단 영역의 외부 육안 해부학 적 경계가 없습니다. 그러나이 지역은 현미경 섹션에서 확인 할 수있다. 그들이 곳 융모는 말단 점차 짧아 인접 지역에서 가장 오래되고이 될길이가 짧은. 미시적으로는 결장 음와은 리지의 존재에 의해 식별 될 수있는 인접 영역의 최단이다. 대장 지하실 아직 인접 지역에 비해 여전히 키가 말초 지역의 중앙부에서 가장 높은 짧은이다.
  12. 스위스 결장 롤링 진행합니다 :
    1. 평면 오픈 콜론을 유지하고 페트리 접시의 가장자리를 향해 그 기단부에서 집게로 잡아 당깁니다.
    2. 이 위를 향하도록 내강면을 유지하고 한 손으로 집게로 근위 끝을 잡고 다른 손으로 이쑤시개를 개최합니다.
    3. 집게를 사용하여 이쑤시개 주위의 기단부의 가장자리를 감싸 약간 제자리에 고정하기 위해 이쑤시개에 랩 가장자리를 끼.
    4. 부드럽게 천천히 스위스 롤을 형성하기 위해 이쑤시개 주위에 결장 롤 손가락으로 이쑤시개를 압연 시작합니다.
    5. 전체 대장의 길이가 겹쳐서되면, 조심스럽게 C를 슬라이드 집게 한 쌍을 사용하여이쑤시개 오프 및 조직 처리 / -embedding 카세트에 olon 스위스 롤. 실온에서 하룻밤 동안 10 % 포르말린에 카세트를 놓습니다.
  13. 스위스 소장 롤링 진행합니다 :
    1. 한 번에 하나의 세그먼트를 처리, 내강면이 평면 오픈 세그먼트를 주기적으로 업데이트하여 페트리 접시의 가장자리를 향해 그 기단부에서 집게로 잡아 당깁니다.
    2. 대장에 기재 한 바와 같이 스위스 압연을 진행합니다.
  14. 파라핀 삽입에 대한 포르말린 고정 조직을 처리를 진행합니다. 다음과 같이 진행하십시오 :
    참고 : (자세한 내용은 자재 및 장비의 참조) 자동화 된 프로세서를 사용합니다.
    1. 조직 카세트 중일 고착성이 완전히 제거 될 때까지, PBS로 조직을 헹군다.
    2. 다음 순서에 따라 에탄올을 이용하여 조직을 탈수 : 50 %의 에탄올을 10 분, 70 % 에탄올에서 10 분, 80 % 에탄올에서 10 분, 10 분, 95 % 에탄올, 10 분 동안 100 % 에탄올, 100 % 에탄올 10 분간 , 110 분 00 % 에탄올.
    3. 다음 순서 자일 렌과의 교류 에탄올 : 2 : 1의 에탄올 : 10 자일 렌 - 15 분, 1 : 1 에탄올 : 10 자일 렌 - 15 분, 1 : 2 에탄올 : 10 자일 렌 - 10 15 분, 100 % 크실렌 - 15 분 10 100 % 크실렌 - 15 분 10 100 % 크실렌 - 15 분. 주의 : 크실렌 따라서 직장이 적절한 후드와 직원이 착용해야 적절한 보호 장비와 국소 배기 장치가 장착되어 있어야 건강에 유해하다.
    4. 파라핀과의 교류 크실렌. 2 : 1 크실렌 30 분간 파라핀, 1 : 1 크실렌 30 분간 파라핀, 1 : 1 크실렌 30 분간 파라핀, 100 % 파라핀 58 °의 C - 오븐 (54)에 설정된 진공에서 다음 단계를 수행 1 - 2 시간, 1 100 % 파라핀 - 2 시간 또는 하룻​​밤.
      참고 :이 파라핀 중합체를 분해하고 단단하고 부서지기 쉬운 것 때문에 파라핀 시간의 연장 기간 동안 60 ° C를 넘지 않도록하십시오.
    5. 드 신선한 새로운 파라핀과 동양 조직에 포함파라핀이 경화되기 전에 희망하는. 스위스 롤의 경우, 조직 paraffinization 다음, 파라핀 삽입하는 동안 옆에 각 롤의 위치를​​ 변경하는 것이 중요합니다. 이 절단시 각 롤의 전체 길이의 부분이 생성 될 것임을 보장한다.
  15. 염색의 경우, 마이크로톰을 사용하여 5 μm의 두께 부분을 잘라. ; 충전 슬라이드에 섹션을 수집하고 오븐에서 밤새 65 ° C에서 그 (빵)을 건조 실온에 시원하고 연속적으로 염색을 위해 그들을 사용 할 수 있습니다.
    주 : 소성 시간은 1로 단축 할 수있다 - 슬라이드 얼마나 갓 절단에 따라 2 시간. 절편 이후 한 달 미만의 경우는 하룻밤 구워하는 것이 좋습니다. 한 달 이상 되었다면, 1 - 2 시간의 소성 시간을 저장하기에 충분하다. 시간이 부족하면, 밤새 백업은 항상 사용할 수 있습니다.

3. 조직 학적 분석 및 면역 형광 염색법

조직 학적 분석 및 immunoflu를 수행orescence 염색은 이전의 수정, 23, 24을 설명했다. 강화 된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 면역의 경우 :

  1. 1 시간 동안 65 ° C 오븐에서 슬라이드 구워 내생 알칼리 포스 파타 아제 활성을 비활성화하고 이후 자일 렌에 deparaffinize.
  2. 내인성 퍼 옥시다아제 조직을 차단 메탄올 중 3 % 과산화수소 욕 섹션을 인큐베이션; 다음 10 분 동안 125 ° C에서 구연산 완충액 항원 회수 하였다 감소 알코올 욕 시리즈 (100 %, 95 %, 70 %)에서 배양 (10 mM의 시트르산 나트륨, 0.05 % 트윈 20, pH를 6.0) 재수 decloaking 챔버를 사용하여.
  3. 소수성 장벽을 제공 펜을 표시하여 조직 섹션 주위에 원을 그리고 (EGFP에 대한 일차 항체로 다음 희석 한을 37 ° C에서 30 분 동안 (TBS-트윈 2.5 % 소 혈청 알부민 [BSA]) 버퍼를 차단과 함께 섹션을 품어 : 밤새 가습 실에서 4 ° C에서 500) 부드럽게 흔들어 섞으면.
  4. 부분을​​ 세척하고 37 ℃에서 30 분 동안 적절한 농도로 형광 표지 된 이차 항체와 함께 품어.
  5. 훽스트 2 차 항체 처리 및 얼룩 핵 후 슬라이드를 세척하고 설치 미디어를 탑재합니다.
    1. Klf5 / EGFP / 기-67 공동 염색의 경우, 프로세스 슬라이드 단계 3.1에 ​​설명 된대로 - 3.3 Klf5 항체 (희석 1 : 150)을 배양하여 Klf5 염색을 수행 하룻밤.
    2. 프로토콜에 따라 슬라이드에 토끼 AP 폴리머 검출을 적용합니다.
    3. Klf4는 제조 업체의 프로토콜에 따라 발색 면역 조직 화학 염색을 이용하여 염색 알 수있다.
    4. 이전에 기술 된 프로토콜 25을 사용하여 항체 용출을 수행합니다. 글리신 - SDS에서 50 ° C (산도 2.0) 1 시간 동안 교반 솔루션에서 슬라이드를 품어.
    5. 세척하고 증류수로 충분히 슬라이드 및 37 ° C에서 30 분 동안 (TBS 트윈 - 2.5 %의 BSA) 블로킹 완충액으로 배양한다.
    6. 기-67 추가 (희석 1 : 500)와 EGFP (희석 1시 50분0) 동시에 항체 및 1 시간 동안 37 ℃에서 배양한다.
    7. (데이터는 도시하지 않음) 훽스트 염색하기 전에 적절한 보조 항체와 형광 검출을 수행하고 매체를 장착 마운트.
  6. 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E) 26 5 μm의 섹션을 염색에 조직의 조직 학적 형태를 관찰한다. 형광 이미지의 각각 EGFP, Klf5 및 기-67 염색을 시각화 535, 646, 700의 방출 파장을 사용합니다.

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결과

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면역 조직 화학 염색과 함께 스위스 압연 기술은 작거나 큰 장 조직의 포괄적 인 분석이 가능합니다. C57BL / 6 마우스 (그림 1)의 대장의 H & E 염색의 예는 타당성의 그림과이 기술의 효과이다. 근위, 중간 및 말단도 1에 도시 된 바와 같이, 화상이 대장 모든 부분을 캡쳐 할 수있다. 따라서, 광범위한 조직 학적 평가를 허용한다. 스위스 롤과 크고 작은 창자 조직의 전체 길이를 캡처하는 능력은 이종 유전자 발현 마커 염색 또는 모욕 장 조직의 가변 응답 매우 유용하다.

예 Lgr5-EGFP / CreER T2 마우스에서 EGFP 염색 패턴이다. 이 마우스 모델에서, EGFP의 발현에 의해 구동되고만 활발하게 증식 장 지하실에서 활성 Lgr5 프로모터,.<...

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토론

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스위스의 압연 기술은 대규모 조직 학적 및 형태 학적 평가 소장 조직을 제조하기위한 강력한 방법이다. 원래 동결 절편 (18, 19)의 제조를 위해 개발 된 전술 스위스 압연 기술과는 대조적으로, 여기에서 제시된 방법은 포르말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 조직에 대한 신속한 장 준비 및 고정 할 수있다. 냉동 된 조직과 비교 FFPE 조직 훨씬 긴 수명을 갖고 있기 때문에 더 조직 무결성 조직 학적 분석을 위해 조직의 바람직한 형태이다. 스위스 압연 프로토콜의 중요한 부분은 압연 및 염색 postfixation의 스위스 롤 무결성 및 조직의 품질을 유지하기위한 조직의 유연성을 포함한다. 장 조직 FFPE 표준 스위스 롤 기법은 일반적 힘들고 시간 소모적 (2 일) (18, 19)이다. 또한,이 표준 방법은 일반적으로 R은 소장 조직을 수득elatively 뻣뻣하고 쉽게되지는 스위스 롤에 형성한다. 10 % 포르말린에서 장 해부 조직 밤새 인큐베이션 조직 압연 전의 요구되기 때문이다. ...

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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H&E 이미지를 제공해 주신 Ainara Ruiz de Sabando에게 감사드립니다. 이 연구는 Vincent W. Yang 박사에게 수여된 미국 국립보건원(DK052230, DK093680 및 CA172113)의 보조금으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
스테인레스 스틸 해부 키트VWR25640-002
은폐 제거 챔버Biocare MedicalDC2012
주사기 10 mlVWR89215-218
Swingsette 티슈 임베딩 / 처리 카세트 뚜껑포함 SimportM515
Superfrost Plus Slides [크기 : 25 x 75 x 1 mm]VWR48311-703
수동 슬라이드 염색 세트Tissue-Tek/Sakura4451
염색 접시 녹색Tissue-Tek/Sakura4456
염색 접시 흰색Tissue-Tek/Sakura4457
탈착식 손잡이가 있는 24-슬라이드 슬라이드 홀더Tissue-Tek/Sakura4465
오븐Thermo Scientific624365도 베이킹 슬라이드
해부 현미경ZeissStemi 2000C
형광 현미경NikonEclipse 90i밝고 형광등, 대물렌즈: 10X, 20X
PAP 펜 Super-Liquid Blocker MiniFisher ScientificDAI-PAP-S-M
에탄올 200 증명AAPR111000200
메탄올VWRBDH1135-4LP
빙초산AAPR281000ACS
크실렌피셔 사이언티픽X5P-1GAL
과산화수소 25% 물 용액아크로스202465000
10% 부퍼 포르말린Fisher Scientific22-026-213
소 혈청 분획 V, 열 충격Roche3116956001
Tween 20Sigma AldrichP7949
구연산나트륨Fisher ScientificS279
Gavage needleVWR20068-624
Rabbit anti Klf5 항체Santa Cruz Biotechnologysc-22797Dilution 1:150
Chicken anti EGFP 항체MilliporeAB16901Dilution 1:500
Rabbit anti Ki67 항체Biocare MedicalCRM325B희석 1:500
Mach3 토끼 AP 폴리머 검출 키트Biocare MedicalM3R533L
워프 레드 크로모겐 키트Biocare MedicalWR806 H
Lgr5-EGFP/CreERT2 마우스 잭슨 연구소008875 
자동화 프로세서LeicaLeica TP1020

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
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