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방법 논문

인간 간 줄기 세포를 이용한 인간형 마우스 간 세대

10.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54167

⸱

2016년 8월 29일

 ,  , 
1Department of Regenerative Medicine, Graduate School of Medicine, Yokohama City University, 2Department of Advanced Gastroenterological Surgical Science and Technology, Faculty of Medicine, University of Tsukuba, 3Regenerative Medicine Research Center, Jiangsu University Hospital

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에서는 미성숙 및 확장 가능한 인간 간 줄기 세포의 이식 후 Alb-toxin receptor mediated cell knockout(TRECK)/SCID 마우스에서 생성된 새로운 인간화 마우스 간 모델을 제시합니다.

초록

인간 간세포 이식을 통해 확립된 인간화된 간을 가진 키메라 마우스를 포함하는 새로운 동물 모델이 개발되었습니다. 간에 기능적인 인간 간세포가 다시 채워진 이 마우스는 인간 간세포 생물학, 약물 대사 및 기타 전임상 응용을 조사하는 데 유용한 도구 역할을 할 수 있습니다. 인간 간세포를 마우스에 성공적으로 이식하는 데 필요한 핵심 요소 중 하나는 인간 세포와의 경쟁을 방지하고 인간 기증자 세포 확장 및 분화를 촉진하기 위한 적절한 공간과 미세환경을 제공하기 위해 내인성 간세포를 제거하는 것입니다. 현재까지 푸마릴아세토아세테이트 가수분해효소(Fah) 및 우로플라스미노겐 활성제(uPA) 마우스를 사용하는 두 가지 주요 간 손상 마우스 모델이 확립되었습니다. 그러나 Fah 마우스는 주로 성숙한 간세포와 함께 사용되며 uPA 모델의 적용은 번식 감소로 인해 제한됩니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 Alb-toxin receptor mediated cell knockout(TRECK)/SCID 마우스를 사용하여 미성숙한 인간 간세포의 생체 내 분화 및 인간화 간 생성을 수행했습니다. 인간 간 줄기 세포(Human hepatic stem cell, HpSCs)는 디프테리아 독소(DT) 치료 후 치명적인 전격성 간 부전이 발생한 Alb-TRECK/SCID 마우스의 간을 성공적으로 재증식했습니다. Alb-TRECK/SCID 마우스의 이 인간화 간 모델은 약물 대사 및 약물-약물 상호 작용과 관련된 연구에서 기능적으로 응용될 것이며 다른 생체 내 및 체외 연구를 촉진할 것입니다.

서론

마우스는 인간을 대상으로 한 생물의학 연구가 제한되어 있기 때문에 제약 테스트에 일반적으로 사용됩니다1; 그러나 이러한 모델은 인간에서 관찰된 효과를 부정확하게 시뮬레이션할 수 있기 때문에 항상 유용한 것은 아닙니다. 현재 의료용으로 사용되는 대부분의 약물은 주로 간에서 대사됩니다. 그러나 동일한 약물이 종 간 차이로 인해 마우스와 인간의 간에서 다른 대사 산물로 대사될 수 있습니다. 따라서 개발 과정에서 잠재적인 약물이 임상 적용에 위험을 초래하는지 여부를 판단하기 어려운 경우가 많습니다2,3.

이 문제를 해결하기 위해, "인간화된" 쥐 간은 쥐4-6 내에서 인간 간 세포를 성장시킴으로써 개발되었으며, 이 모델은 인간 간에서 관찰된 것과 유사한 약물 반응을 나타냅니다. 현재 인간화 간 생성에 사용되는 주요 마우스 모델에는 우로플라스미노겐 활성제(uPA+/+) 마우스4,7, 푸마릴아세토아세테이트 가수분해효소(Fah−/-)마우스6 및 최근에 보고된 티미딘 키나아제(TK-NOG) 마우스가 포함됩니다.

그러나 이전 보고서에 따르면 이식된 인간 미성숙 세포 또는 줄기 세포는 Alb-uPA tg(+/−)Rag2(−/−) 마우스 간8-10에서 성인 인간 간세포보다 경쟁력이 떨어집니다. 더욱이, Fah−/− 마우스는 분화된 간세포에만 성장 이점을 제공하고 미성숙 간 전구 세포에는 제공하지 않습니다11. 실험실에서 인간 간 줄기 세포(HpSCs)를 TK-NOG 마우스에 이식하는 것은 성공적이지 못했습니다. 따라서 인간 미성숙 간 세포의 효율적인 생착을 위한 유용한 마우스 모델은 현재 존재하지 않습니다.

따라서, 우리는 인간의 미성숙한 간세포로 효율적으로 재채울 수 있는 새로운 Alb-TRECK/SCID 마우스 모델을 개발했습니다. 이 형질전환 마우스 모델은 간 세포 특이적 알부민 프로모터의 제어 하에 인간 헤파린 결합 EGF 유사 성장 인자(HB-EGF) 수용체를 발현합니다. 디프테리아 독소(diphtheria toxin, DT)를 투여한 후, 이 마우스는 간세포의 조건부 절제로 인해 전격성 간염이 발생하여 기증자 세포 거주 및 증식이 가능해진다12. 이전 연구에서 마우스 간세포가 Alb-TRECK/SCID 마우스에 성공적으로 이식되었지만(13,14), Alb-TRECK/SCID 마우스를 사용한 인간화 간 생성은 아직 보고되지 않았습니다.

이 연구에서는 HpSC의 이식을 통해 Alb-TRECK/SCID 마우스에서 인간화 간을 생성했습니다. 이 인간화된 간은 보편적인 줄기세포 분화를 위한 생체 내 환경을 제공하고 인간 약물 대사 패턴 및 약물-약물 상호 작용을 예측할 수 있는 능력을 제공합니다.

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프로토콜

모든 동물 실험 절차는 요코하마 시립 대학의 동물 보호 지침에 따라 수행 하였다.

급성 간 손상 마우스 모델 1 세대

  1. 1 ㎎ / ㎖ DT 원액을 1 mg을 디프테리아 독소 (DT) 내지 (0.85 % NaCl 용액 100 ㎖에 0.6 g의 페놀) phenolized 0.85 % NaCl 용액 1 ㎖를 추가한다. 주 : 1 밀리그램의 농도 DT는 / ㎖ 3 ° C ~ 8 ° C에서 약 2 년 동안 저장 될 수있다.
  2. 직렬 phenolized 0.85 % NaCl 용액에서 0.3 μg의 / ㎖ DT에 1 ㎎ / ㎖ DT 원액을 희석 작업 솔루션으로 0.3 μg의 / ㎖의 DT 용액의 분취 량을 준비합니다. 참고 :이 작업 솔루션은 새로 제조해야한다.
  3. 치사 용량 (~ 50 % 치사)를 사용하여 실험을 수행, 8 주령 생쥐에게 DT의 1.5 μg의 / kg 투여 량을 관리.
    1. 지느러미 드러 누움에 마우스를 잡고 DT의 복강 내 주사를 수행하고 needl를 삽입무릎의 굽힘 아래 전자는 왼쪽이나 정중선의 오른쪽. 방광의 침투를 방지하기 위해 중간 선을 피하십시오. 각도 몸에 바늘이 약 45 °.
    2. 인슐린 주사기를 이용하여 마우스의 체중 20g 당 0.3 μg의 새로 제조 / ㎖의 100 ㎕ DT와 마우스를 주입. 예를 들어, 18 g의 마우스는 0.3 μg의 / ㎖의 DT 솔루션의 9​​0 μl를 받아야합니다.
  4. 48 시간 후 DT 주입에서는, 혈관을 팽창하기 위해 약 10 분 동안 37 ℃의 수욕 마우스 꼬리 제한 수단에 마우스를 위치시키고 가온하여 꼬리 정맥으로부터 혈액을 수집한다. 그런 다음, 날카로운 메스 블레이드와 함께 끝에서 꼬리 2cm에 1 mm 닉을하고 마이크로 캐 필러 튜브에 혈액을 수집합니다.
    1. 5 분 1,500 XG에서 혈액을 포함하는 마이크로 캐 필러 튜브를 원심 분리기와 뜨는 및 세포 펠렛을 분리하여 혈청을 수집합니다.
  5. 1시 20분 희석 마우스 혈청의 피펫 50 μL GOT / AST- 상PIII는 슬라이드. 제조사의 프로토콜에 따라 다목적 건조 화학 자동 분석기를 사용하여 650 nm에서의 반응 생성물 (청색 색소)의 흡광도를 측정한다.
    참고 : 아스 파르 테이트 아미노 전이 효소 (AST)의 판독은 / 글루타민산 옥 살로 트랜스 아미나 제 (GOT) 활동이 자동으로 표시됩니다. 16,000 IU / L 급성 간 손상을 앓고있는 것으로 간주 하였다 - 이일은 DT가 주입, 쥐의 약 60 % 12,000 사이 AST 값을 나타내 게시합니다. 이러한 마우스는 새로운 케이지 전달 및 세포 이식을 사용 하였다.

인간의 간 줄기 세포의 2. 준비

  1. CDCP1 + CD90 + CD66- 아군를 얻을 CDCP1, CD90 및 CD66의 세포 항원을 이용한 셀 소터 인간 일차 태아 간세포에서 인간 간 줄기 세포를 분리 한 다음, 콜라겐 IV 코팅 된 배양 접시에 절연 세포군 시드, 앞서 15 일 보도했다. 배아의 인간의 기본 태아 간 세포를 사용하여주 14과 18 사이의 나이.
  2. 배양액을 흡인 100-mm 배양 접시에 90 % 합류 10 ml의 PBS로 세포를 세척 한 후 PBS를 제거 - 80 % 배양 된 간 줄기 세포를 수집한다. 37 ° C에서 5 분 동안 2 ml의 0.05 % 트립신 / EDTA 용액으로 세포를 Trypsinize. 주 : 세포 분화 쥐 그들의 증식 능력에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 90 % 이상의 세포가 합류 세포 이식에 적합하지 않다.
  3. 현미경 하에서 세포의 분산액의 상태를 모니터한다. 세포가 떠하거나 자유롭게 유동 할 때 나타나는 10 % FBS를 함유하는 DMEM / F12 8 ml를 첨가하여 효소 소화를 멈춘다.
  4. 천천히 10 ㎖의 혈청 피펫을 사용하여 세포를 정지하고, 15 mL의 원뿔형 튜브에 세포를 옮긴다. 100 XG에 5 분, 4 ° C를위한 세포를 원심 분리기.
  5. 조심스럽게 10 % FBS를 함유하는 10 ㎖의 DMEM / F12에서 세포 펠렛을 재현 탁하고 현미경 카운팅 챔버를 이용하여 세포 수를 결정한다.
  6. 각 마우스 PBS 씩 50 μL 당 1.0 × 10 6 세포로 세포를 나누어 이식까지 얼음에 저장합니다.

인간의 간 줄기 세포의 3 Intrasplenic 이식

  1. 37 ° C 전기 가열 패드에 깨끗한 케이지를 놓습니다.
  2. 노즐 아래에 배치하여 - (분당 산소의 2 L에서 1.5 % (부피 / 부피) 1) 마우스 사용 이소 플루 란 흡입 마취. 또한, 이소 플루 란 적신 거즈를 포함하는 튜브를 사용합니다.
    1. 마우스를 가볍게 뒤쪽 발바닥을 곤란하게하여 마취되어 있는지 확인합니다. 무릎 경련이 유발되는 경우, 다시 실에서 마우스를 놓습니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다.
  3. 전기 면도기를 사용하여 수술 부위를 면도하고 (부피 / 부피) 에탄올 및 포비돈 요오드 소독 할을 70 %를 적용합니다. 그런 다음 절개에 이어 바로 리브의 늑골 테두리 아래 왼쪽 측면에서 1 cm의 피부 절개를 만들복벽뿐만 아니라 복막.
  4. 조심스럽게 비장 노출됩니다. 직접 각 마우스의 비장에 50 ㎕의 PBS에 1.0 × 106 인간 간 줄기 세포를 주입하기 위해 32-G / 2 인치 바늘 100 μL 미세 주입 주사기를 사용한다. 주입을위한 5 ° 각도로 바늘을 기울입니다.
    1. 주사의 깊이가 비장의 절반 이하 두께 있는지 확인하십시오. 바늘을 한쪽 끝 (헤드)에서 비장을 입력하고, 다른 단부 (꼬리)의 셀을 증착한다.
  5. 주입 따라 셀의 누출을 방지하기 위해, 2 분간 부드럽게 손가락을 이용하여 압력을인가하고 바늘을 제거.
  6. 다시 마우스 본체에 비장을 놓고 근육과 피부를위한 정상 주행 봉합와 공동을 닫습니다.
  7. 즉시 이식 다음 37 ° C 미리 예열 케이지에 쥐를 전송합니다. 마우스를 보장하기는 편안하게 호흡 케이지에 옆에 마우스를 배치 할 수있다케이지 침구 및 수술 부위 사이의 접촉을 무효화.
  8. 마취가 봉합 폐쇄 유지하기 위해 오프 착용하고 마우스 조건 수술 전으로 돌아갈 때까지 마우스를 모니터링합니다.
  9. 마우스를 확인하는 것은 정상적인 마시는 물과 음식이 제공됩니다. 1 시간 후, 동물 센터의 마우스 방에 케이지를 반환하고 매일 쥐를 모니터링 할 수 있습니다.

4. 감지 이식 인간의 간 마우스 간에서 세포 유래 간세포 줄기

주 : 다음 절차는 자궁 경부 전위 다음 케타민과 자일 라진의 과다 복용을 사용하여 모든 동물을 안락사.

  1. 4시 - 육주, 이식을 게시 쥐를 안락사 동시에 커티스 절단 및 밴드 수술 가위를 사용하여 복강을 엽니 다.
  2. , 복막 위의 결합 조직을 해부 확산기로 가위를 사용하고 복막을 열 수있는 원격 교육 알바 함께 복막을 잘라공동.
  3. , 집게로 흉골을 들어 올려 다이어프램에 구멍 및 자궁 거들을 통해 흉골의 각면을 잘라.
  4. 간 흉부 측의 대정 맥을 절단하고, 앞쪽 방향으로 간을 통해 식도를 당깁니다. 간을 제거하기 위하여 진동판을 제거한다.
    참고 : 위의 팁은 아래의 흉부 장기의 손상을 방지하기 위해 위쪽으로 지적 유지하기 위해주의해야합니다. 흉선은 때때로 흉골의 지느러미 측면에 집착하는 경향이있다이 조심스럽게 피해야한다.
  5. 핸들로 진동판을 사용하여, 복강 내에서 간 당기는 시작한다. 내부 대정맥은 장소에 간을 개최합니다. 내부 대정 맥을 잘라; 중간에 오른쪽 부신을 해방 않도록주의하십시오.
    참고 : 마우스가 중간 엽으로 구성된 네 잎 모양 간, 왼쪽 엽, 우엽과 미상 로브 있습니다. 담낭은 작은 분기에 현탁중간 엽.
  6. 접합에서 서로의 로브를 분리하고 제조 업체의 프로토콜에 따라 최적의 절삭 온도 OCT () 화합물을 포함. 그라 이오 스탯의 금속 격자의 간 조직을 포함 OCT를 고정.
  7. -18 ° C에서 그라 이오 스탯을 사용하여 5 μm의 두께 샘플 부분을 잘라 RT 현미경 슬라이드에 그들을 탑재합니다. -80 ° C에서 주식을 저장합니다. 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E)과 이전에보고 절차 (16)에 따라 면역 형광 염색법에 대한 슬라이드를 준비합니다.

5. 인간 알부민 분비의 탐지 및 키메라 비율​​의 계산

  1. 인간 간 재구성을 측정하기 위해, 혈청 및 제조자의 지시에 따라 인간 알부민 ELISA 키트를 사용하여 인간 알부민 ELISA 수행한다.
  2. 전체 - 인간화 간에서 실시간으로 발현의 PCR 분석을 인간형 키메라 간 비율을 계산한다. 상대 예를 결정인간의 마우스 크로스 굴지 인간 고유의 굴지의 Pression의 수준 비율 (비율 1) 인간 - 마우스 크로스 굴지에 마우스 특정 굴지의 비율 (비율 2). 키메라 비율​​은 비율이 1 /로 (비율 1 + 비율 2)를 계산한다.

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결과

장백의-트렉 / SCID 쥐 간세포는 알부민 프로모터의 조절 하에서 인간 DT 수용체 HB-EGF 유전자를 발현하고 DT 정부 (12) 아래의 세포 독성 효과를 나타낸다. 간 손상에 DT 치료의 효과를 평가하기 위해, 1.5 μg의 / kg의 DT의 용량은 8 주령 장백의 - 트렉 / SCID 마우스에 주입하고 간 48 시간 포스트 DT 관리의 병리학 적 변화는 조직 학적으로 평가 하였다. (DT하지 처리) 대조군 마우스와 비교하여 처리 마우스 DT 증가 혈청 AST 활성이 정체에 대한 수정을 도시하는 무질서 간 구조를 나타내었다. 또한, DT-처리 생쥐의 간세포 함께 어두운 핵 (아마 세포 사멸 간세포) 여러 깊이 스테인드 acidophilic 세포질 흠도 있었다; 다른 간세포는 그림 1 (보존 또는 거의 또는 전혀 포털 정맥 염증 어두운 핵을 가진 공포 형성 세포질을 전시 등장 ). 이러한 결과는 장백...

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토론

최근의 연구는 마우스 간 성인 간세포 증식 및 간 줄기 세포 (17)를 포함하여 인간 간세포 증식을 할 수 있음을 보여 주었다. 이 다시 채워 간 약물 대사 시험 및 신약 개발 18 전임상 실험 모델로 사용되고있다; 뿐만 아니라, 그들은 세포 성숙과 분화 (19)에 대한 생체 내 환경을 제공하고 있습니다. 본 연구의 주된 목적은 약물 대사 활동의 획득을 위해, 인간 미성숙 간세포 증식, 성숙 및 분화를 허용하는 신규 간 질환의 마우스 모델을 생성 하였다.

intrasplenic 이식의 과정은 광범위하게 연구되고있다. 쥐의 비장 세포를 이식은 평균 수명에 걸쳐 생존. intrasplenic 이식 프로토콜은 특정 연구 질문 조사에 매우 유용한 것으로 입증되었습니다;많은 실험실은 전 세계적으로 인해 개선 된 생쥐의 생존과 간 재생의 간 세포 이식에 대한 높은 재현성 및 신뢰성 모델이 프로토콜을 사용하려고했습...

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공개 사항

저자는 공개할 경쟁적인 재정적 이해관계가 없습니다.

감사의 글

쥐를 제공해 주신 Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science의 Mammalian Genetics Project에 감사드립니다. 또한 일본 Sekisui Medical Company Ltd.의 ADME(Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion) & Toxicology Research Institute의 S. Aoyama와 Y. Adachi, 그리고 LC-MS/MS 분석에 도움을 준 K. Kozakai와 Y. Yamada에게 감사드립니다. 이 작업은 일본 문부과학성(MEXT)이 Y-W.Z.(18591421, 20591531, 23591872)에 제공하는 보조금의 일부 지원을 받았습니다. 고위급 인재 소개를 위한 Jiangsu 혁신 및 기업가 프로젝트와 Jiangsu 과학 기술 계획 프로젝트(BE2015669); 일본 과학기술청(Japan Science and Technology Agency)의 혁신적인 연구 및 개발의 전략적 촉진을 위한 H.T.(S-innovation, 62890004)에 대한 보조금으로.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
인간 알부민시그마A6684마우스
인간 CK19DakoM088801마우스
인간 핵MilliporeMAB1281마우스
인간 CK8/18프로젠GP11기니피그
CDCP1Biolegend324006마우스
CD90BD559869마우스
CD66BD551479마우스
GOT/AST-PIII후지필름14A2X10004000009
DMEM/F-12Gibco11320-033
FBSBiowestS1520
0.05% Trypsin-EDTA Gibco25300-054
디프테리아 독소시그마D0564-1MG
인간 알부민 ELISA 키트Bethyl LaboratoriesE88-129
주사기 (1 ml)TerumoSS-01T
32G 1/2" 바늘TSKPRE-32013
O.C.T.Compound(118 ml)Sakura Finetek Japan4583
MoFlo 고속 세포 분류기Beckman CoulterB25982
DRI-CHEM 7000Fujifilm14B2X10002000046

참고문헌

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