세포 및 세포 내 스케일링의 메커니즘은 여전히 파악하기 어렵습니다. Xenopus 배아 추출물의 사용은 세포 기관 크기 조절의 메커니즘을 밝히기 위해 점점 더 보편화되고 있습니다. 이 방법은 배아 추출물 준비와 핵 크기 조절 메커니즘을 확인할 수 있는 새로운 핵 스케일링 분석을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
세포 생물학의 근본적인 문제는 세포와 세포 기관 크기는 조절하는 방법이다. 긴 두 셀에서 극적인 감소 핵 크기가 발생할 때 핵의 크기는 일반적으로 특히 배아 발생 동안, 셀의 크기로 스케일링하는 것이 인정되었다. 핵 크기 조절의 메커니즘은 크게 알려지지 및 변경된 핵 크기가 중요한 진단 및 예후 매개 변수입니다 암과 관련이있을 수 있습니다. 생체 내 핵 함수의 필수적인 복잡한 자연 복잡 핵 크기 조절기를 식별에 접근한다. 핵 크기 조절을 연구하기 위해 여기에 설명 된 체외 방법은 Xenopus의의 laevis의 개발 과정에서 발생하는 핵의 크기가 정상 감소 활용합니다. 우선 핵 X. 조립했다 계란 추출물 laevis의. 그런 다음,이 핵을 분리 후기 배아에서 세포질에 재현 탁하고 있습니다. 90 분 잠복기, 핵 표면적 - 30 후발달 핵 크기 스케일링 기여 후기 배아 세포질에 존재하는 구성 요소를 식별하는 데 유용한 분석법을 제공하고, 60 % - 20에 의해 감소한다. 이 방식의 가장 큰 장점은 계란 배아 추출물 생화학 핵 크기를 조절하는 신규 한 단백질 활동을 식별 할 수 있도록 조작 할 수있는 상대 설비이다. 체외 접근 방식에 어떤과 마찬가지로, 생체 시스템의 결과의 검증은 중요하고, X의 미세 주입 laevis의 배아는 이러한 연구에 특히 적합하다.
서론
세포 소기관의 크기는 통상적으로 전지의 크기 스케일링, 이는 아마도 최상의 셀 크기 1-10 핵 크기의 스케일링을 위해 설명되었다. 이것은 세포 및 핵의 크기 모두에서 극적인 감소는 종종 11, 12을 관찰 배아 및 세포 분화, 중 특히 그러하다. 또한, 변경 핵 크기는 암 진단 및 예후 13-17에서 중요한 파라미터이다. 핵의 크기 조절에 기여하는 메커니즘은 복잡 핵 구조와 기능의 본질에 부분적 대부분 알려져 있지 않다. 여기에 기재된 방법은 조작 및 생화학 핵 크기 조절 메커니즘의 해명에 의무가 핵 크기 스케일링을위한 시험 관내 분석으로 개발되었다.
Xenopus의 laevis의 달걀 추출물은 시험 관내에서 복잡한 세포 과정을 요점을 되풀이하고 공부 잘 설립 시스템 컨텍스트. 이 추출물은 조립 및 유사 분열 스핀들, 소포체의 기능 및 핵 18-22 포함한 여러 세포 프로세스에 대한 새로운 기본 정보를 공개했다. 추출 시스템에 하나의 중요한 장점은 X.이다 laevis의 달걀 추출물 조성 쉽게 재조합 단백질 또는 immunodepletion의 추가를 통해 예를 들어, 변경할 수 있습니다....
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프로토콜
모든 Xenopus의 절차와 연구는 실험 동물 8 판의 관리 및 사용에 대한 NRC 가이드를 준수 실시 하였다. 프로토콜은 와이오밍 기관 동물 관리 및 사용위원회 (보증 번호의 A-3216-01)의 대학에 의해 승인되었다.
X의 1. 준비 (27, 28에서 적응) laevis의 달걀 추출
- 프라임 여성 X. laevis의는 3 일 최소 임신 암말 혈청 성선 자극 호르몬 (PMSG)의 단일 100 IU 주입 계란 컬렉션 전 2 주 최대 개구리.
- 어느 날 실험하기 전에, 1 / 3 배 마크의 변경 벨소리 (MMR)의 개구리 당 1 L에 16 ° C에서 인간 융모 성 생식선 자극 호르몬 (HCG)과 장소의 800 IU와 프라임 개구리를 주입. 모든 버퍼 조성은 표 1을 참조하십시오.
참고 : 일부 개구리가 알을 낳기하지 않거나 품질이 좋지 알을 낳는 것입니다. 일반적으로 2-3 개구리 sufficien을 마련 할 것이다 적어도 하나의 개구리를 보장하기 위해 주입좋은 품질의 계란 t 번호. 평균 개구리는 충분히 계란 계란 추출물의 최소 1 ml의 생산 배치됩니다. - 1 / 3 배 MMR은 차가운 증류수 탈 이온....
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결과
계란 추출물의 핵의 조립
이 프로토콜의 첫 번째 단계는 X를 준비한다 laevis의 달걀 추출물 (프로토콜 1) demembranated 정자 핵 (프로토콜 2). 이 시약은 핵 드 노보 (프로토콜 3)를 조립하는 데 사용됩니다. (1) 일부 대표 데이터를 보여줍니다. 칼슘 첨가 계면에 meiotically 체포 계란 추출물을 구동하고, 사이클로 헥시 미드는 계면에서 체포 추출물을 유지합니다. (30) - 반응 개시 후 45 분, 처음에 얇은 S 모양의 정자 핵 총알 모양의 염색질 대중에 두껍게하기 시작한다. 온전한 핵막의 성공적인 형성 예컨대 GST-GFP-NLS (데이터 미도시) 또는 FG 반복 인식 mAb414를 사용.......
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토론
여기에서는 X. laevis 발달 중 핵 크기 조절 메커니즘을 연구하는 새로운 방법을 제시합니다. 발달 진행은 세포 생리학, 신진대사, 분열 속도 및 이동의 급격한 변화뿐만 아니라 세포 크기 및 세포 내 구조의 변화와 관련이 있습니다. 이러한 다양한 과정은 복잡하고 필수적이므로 생체 내 환경에서 이러한 발달 측면 중 하나만 연구하기는 어렵습니다. 여기에 설명된 X. laevis 배아 추출물 및 핵 수축 분석은 시험 관 내 맥락에서 크기 조절 메커니즘을 연구하여 생체 내 시스템의 복잡한 신호와 물리적 제약을 우회할 수 있습니다. 또한, 추출물의 개방적 특성으로 인해 생화학적 조작이 용이합니다.
프로토콜의 일부 단계 문제를 해결해야 할 수 있습니다. 핵 조립 및 성장 문제는 품질이 좋지 않은 난자, 정자 핵의 불완전한 막외, 너무 높은 농도에서 정자 핵 사용 또는 너무 낮은 온도에서 핵 조립 반응을 배양.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
레비(Levy)와 개틀린(Gatlin) 연구실의 구성원들과 분자생물학과의 동료들이 도움이 되는 조언과 토론을 제공해 주었습니다. 레베카 힐드(Rebecca Heald)는 이 프로토콜 개발의 초기 단계에서 지원을 제공했습니다. 이 연구는 NIH/NIGMS (R15GM106318) 및 미국 암 학회 (RSG-15-035-01-DDC)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 568 당나귀 안티 마우스 IgG | 분자 프로브 | A10037 | |
| ATP 디 소듐 염 | 시그마 Aldrich | A2383 | |
| Benzocaine | 시그마 Aldrich | E1501 | |
| 소 혈청 알부민 | 시그마 Aldrich | A3059 | |
| CaCl2< / sub> | Sigma Aldrich | C3306 | |
| 원심 분리기 | Beckman | J2-21M | |
| 원심분리기 로터 | Beckman | JS 13.1 | |
| 키모스타틴 | 시그마 알드리치 | C7268 | |
| 크레아틴 인산이 나트륨 | Calbiochem | 2380 | |
| 시클로헥시미드 | 시그마 알드리치 | C6255 | |
| 사이토칼라신 D | 시그마 알드리치 | C8273 | |
| 일회용 물티슈 (kimwipes) | Sigma Aldrich | Z188956 | |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | W326306 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| 포름알데히드 | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Glass crystallizing dish (150 x 75 mm) | VWR | 89090-662 | |
| Glycerol | Macron | 5094-16 | |
| HEPES | 시그마 Aldrich | H4034 | |
| Hoechst - bisBenzimide H 33342 트리하이드로클로라이드 | 시그마 Aldrich | B2261 | |
| HCG - 인간 융모성 성선 자극 호르몬 | Prospec | hor-250-c | |
| L15 매체 | 시그마 Aldrich | L4386 | |
| leupeptin | 시그마 Aldrich | L2884 | |
| 리솔레시틴 | Sigma Aldrich | L1381 | |
| mAb414 | Abcam | ab24609 | |
| MgCl2 | EMD | MX0045-2 | |
| MgSO4 | 시그마 알드리치 | M9397 | |
| 말토스 | 시그마 알드리치 | M5885 | |
| NP40 | BDH | 56009 | |
| 파라포름알데히드 | 전자 현미경 과학 | 15710 | |
| 페니실린 + 스트렙토마이신 | 시그마 알드리치 | Pp0781 | |
| 펩스타틴 | 시그마 알드리치 | P5318 | |
| 파이프 | Sigma Aldrich | P6757 | |
| 플라스틱 파라핀 필름 (파라 필름) | Sigma Aldrich | P7793 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541 | |
| KH2PO4 | Mallinckrodt | 70100 | |
| KOH | Baker | 5 3140 | |
| PMSG - 임산부 암말 혈청 성선 자극 호르몬 | Prospec | hor-272-a | |
| NaCl | 시그마 Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328 | |
| Na2HPO4 | EMD | SX0720-1 | |
| NaOH | EMD | SX0590 | |
| 유봉 | Thomas Scientific | 3411D56 | |
| 둥근 바닥 유리관, 15 ml | Corex | 8441 | |
| 2차 항체 (Alexa Fluor 568, 당나귀 안티-마우스 IgG) | ThermoFisher | A10037 | |
| 자당, | Calbiochem | 8550 | |
| thermal cycler | Bio-Rad | T100 | |
| 초원심분리기 | , Beckman | L8-80M | |
| , 초원심분리기 로터 | Beckman | SW 50.1 | |
| Vectashield (페이드 방지 마운팅 매체) | Vector | H-1000 |
참고문헌
- Conklin, E. Cell size and nuclear size. J. Exp. Embryol. 12, 1-98 (1912).
- Wilson, E. B. The Cell in Development and Heredity. , The Macmillan Company. 727-733 (1925).
- Levy, D. L., Heald, R.
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재인쇄 및 허가
