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방법 논문

골수 전구 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 T 세포 수용체 Retrogenic 마우스를 생성하는

9.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54196

⸱

2016년 7월 11일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine

이 논문에서

요약

우리는 단일 T 세포 수용체(TCR) 레트로바이러스 기반 생체 내 발현 시스템을 위한 빠르고 유연한 프로토콜을 제시합니다. 레트로바이러스 벡터는 골수 전구 세포를 transduction하여 TCR 형질전환 마우스의 대안으로 in vivo에서 단일 TCR의 T 세포 발달 및 기능을 연구하는 데 사용됩니다.

초록

T 세포 수용체(TCR) 신호전달은 흉선과 말초에서 각각 T 세포의 발달과 분화에 필수적입니다. 광범위한 TCR은 특정 항원 반응을 연구하는 것이 어렵다는 것을 증명합니다. 따라서, TCR 형질전환 마우스는 흉선에서의 양성 및 음성 선택뿐만 아니라 말초 T 세포 활성화, 증식 및 내성을 연구하기 위해 만들어졌습니다. 그러나 주어진 항원에 특이적으로 생성된 TCR 형질전환 마우스는 상대적으로 적습니다. 따라서 동일한 항원 펩타이드에 대한 다양한 친화성의 TCR을 포함하는 연구는 부족했습니다. 새로운 TCR 형질전환 라인의 개발에는 6개월 이상이 소요될 수 있습니다. 또한 특정 역교차는 6개월이 더 걸릴 수 있습니다. 여러 TCR의 더 빠른 생성 및 스크리닝을 가능하게 하기 위해 TCRα 및 TCRβ 사슬의 화학량론적 발현과 후향성 마우스의 생성을 통해 골수의 레트로바이러스 형질전환을 위한 프로토콜이 확립되었습니다. 각 retrogenic 마우스는 본질적으로 founder이므로 사실상 founder effect를 무효화하는 반면, TCR retrogenic을 생성하는 데 걸리는 시간은 6개월에서 약 6주로 단축됩니다. 여기에서는 특정 TCR을 사용하여 선택한 모든 배경에서 발현될 수 있는 TCR 형질전환 마우스에 대한 빠르고 유연한 대안을 제시합니다.

서론

인간 및 마우스의 T 세포 수용체 (TCR) 레파토리는 1 × 108, 2 × 106 고유 TCR도 각각 1.2로 추정되었다. 이 넓은 다양성은 T 세포는자가 펩티드에서뿐만 아니라 항원 제시 세포 (APC를)의 주 조직 적합성 복합체 (MHC)에 의해 제공 병원체 유래의 항원 에피토프의 광대 한 배열을 인식 할 수있다. 독특한 펩타이드 MHC 단지와 TCR도의 상호 작용의 미묘한 차이는 T 세포가 사멸, 아네 르기, 활성화, 분화, 사이토 카인 생산 세포 독성을 받아야할지 여부를 지시. 그러나, 큰 TCR 레퍼토리 특정 TCR 특정 항원에 응답하는 방법의 분석은 하나의 TCR 시스템의 사용을 필요로한다.

다양한 TCR 유전자 변형 마우스를 생체 내 모델 3-9 단일 TCR의 기능을 연구하기 위해 생성되었다. 그러나, 포함하는 형질 전환 마우스를 TCR 할주의 사항이있다선정 된 하나의 트랜스 제닉 마우스 생식선 DNA (10)에 임의의 형질 전환 유전자 삽입 소위 창시자 효과를 생성하는 시간의 길이. 따라서, 비교적 적은 TCR 형질 전환 마우스는 임의의 주어진 항원에 대해 생성 된 동일한 에피토프에 대한 고 및 저 TCR 친화력의 기능적 의미는 거의 언급하지 않는다. 화면 빠른 접근을위한 필요성을 해결 개별적으로 또는 조합하여 복수의 TCR도 공부 (레트로 바이러스 '레트로'형질 전환에서 '제닉') retrogenic 마우스는 형질 전환 마우스 11-13 TCR의 대안으로 이용되어왔다.

여러 바이러스에서 발견 된 2A 펩타이드 합의 모티브 분열은 2A의 글리신과 2B의 프롤린 사이에 발생하는에서, 2A-ASP를-발 / 일드 - 공급 과잉-X-ASN-프로의 Gly-2B-프로 구성 시스 -acting 가수 분해 효소 활동에서 번역 10,14-16 동안 리보솜 건너 뛰기 결과. 은 C를 나타내는 상세한 다이어그램이러한 방식으로, 하나의 벡터 화학 양론 번역의 결과로 연결될 수 2 시스 트론 (TCR 알파와 TCR 베타) (12) -를 다양한 2A 펩티드 (F2A, E2A, T2A 및 P2A)의 leavage 참고 문헌 10를 참조하십시오. 이 방법을 활용하여, 우리는 표현하고 직접 생체 내에서 여러 항원 특정 TCR도 비교 할 수 있습니다.

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프로토콜

윤리 정책 : 모든 노력이 조사와 꼬리 정맥 주사시 최소한으로 동물의 불편이나 스트레스를 유지한다. 마우스는 실험에서 세포의 공급원으로서 사용된다; 같은 어떠한 절차 나 조작은 안락사 따로 없습니다. 마우스는 죽음을 확인하기 위해 자궁 경부 전위 다음 CO 2 흡입에 의해 안락사됩니다. 이 절차는 미국 수의학 협회의 안락사에 대한 패널의 권고와 일치한다.

1. 레트로 바이러스가 구축 준비

  1. 서브 클론 T 세포 수용체 (TCR) 알파 및 베타 사슬하는 MSCV 계 11 레트로 바이러스 벡터 (예 pMIAII 또는 pMIGII) (11)로하는 2A 링커에 의해 분리된다.
    참고 : 2A 링커는 단일 오픈 리딩 프레임의 알파와 베타 TCR 체인의 화학 양론과 조화 된 표현이 가능합니다. 벡터는 사용하는 IRES 형광 단백질 카세트 (ametrine 또는 GFP)을 포함형질 도입 된 세포 및 형질 도입 효율을 추적. 자세한 프로토콜에 대한 홀스트 등을 참조하시기 바랍니다. (11)
  2. 상업적으로 얻은 플라즈마 준비 키트 또는 유사한 제품을 사용하여 플라스미드 DNA를 분리합니다. 하나의 작업 농도 사용 - 2 μg의 μl를 -1.

레트로 바이러스 생산자 세포주의 2 세대

  1. 레트로 바이러스 생산 세포주를 생성하기 위하여 두 단계의 과정을 이용한다.
    참고 :. 자세한 프로토콜은, 홀스트 등 (11)을 참조하시기 바랍니다.
    1. 세 플라스미드 (pVSVG, PEQ-Pam3 (-E) 및이자 (11)의 벡터) 293T 세포의 과도 형질 전환에 의해 레트로 바이러스를 생성하고, GP + E86 ecotropic 레트로 바이러스 생산 세포주를 형질 도입 할 293T 세포에서 레트로 바이러스 상등액을.
    2. FACS에 의해 형광 발현 GP + E86 프로듀서 세포의 상위 40 %를 분리하고 바이러스의 소스로 transdcuced-GP + E86 생산 세포를 전파.
      참고 : 생성고역가의 생산자들은 골수 세포의 효율적인 형질 도입 중요하다. 완전한 프로토콜 홀스트 등을 참조하시기 바랍니다. (11)

3. 레트로 바이러스 매개 줄기 세포 유전자 전송 (일 -5)

  1. 10 % (부피 / 권) FBS이 프로토콜의 일 0으로이 합류 150 mm 플레이트 충분한 성장을 할 수 있도록 밖으로 해동하고 완전한 DMEM의 각 GP + E86 생산 세포주의 배양 0.5 -1.0 × 10 (6).
    참고 : 해동 0.5 - 또한 GP + E86를 확장하기 위해 문화의 오일을 허용이 날 5에서 50 % 컨 플루 - 10cm의 플레이트의 각 GP + E86 생산 세포주의 1.0 × 10 6 30 수 일 0으로이 합류 150 mm 플레이트에 생산​​ 세포주.
    1. 5 % 태아 송아지 혈청 및 마이코 플라스마 오염을 방지 할 시프로플록사신 (10 μg의 / ㎖)을 포함하는 전체 조직 배양 배지에서 배양 레트로 바이러스 생산 세포주.
      참고 : generatin 때 시프로플록사신의 사용을 중지g 골수 전달의 바이러스 상층 액. 이 부정적인 골수 전달 효율에 영향 바와 같이, 생산자 세포주의 과다 성장을 피한다.

5- 플루오로 우라실 (5-FU) (주 -3) 4.를 주입 기증자 마우스

  1. 요구되는 5-FU의 양을 결정하기 위해 - (12 주 이전 5) 도너 마우스 무게. 낮은 골수 수율 나이 결과 오주 미만의 마우스를 사용. 단일 TCR의 발현을 보장하기 위해, 같은 SCID, RAG 또는 TCR 알파 골수 기증자로 결핍 마우스로 T 세포 결핍 마우스의 피로를 사용합니다.
  2. 조직 배양 후드에서 작동하는 10 밀리그램 ml의 충분한 양 -1 체중 g 당 0.15 mg의 5-FU를 전달하는 5-FU의 작업 용액을 만들기 위해 멸균 PBS로 5-FU 스톡을 희석.
  3. 37 G 바늘 1 mL를 주사기를 사용하여, 복강 공여자 마우스 당 체중 g 당 0.15 mg의 5-FU를 주입.
    참고 :받는 사람 당 사용 1 기증자 마우스 시작하고 조정셀 수율에 따라 기증자 마우스의 수. 골수 전구 세포의 농축 및 분리에 대한 5-FU 처리하는 다른 방법은 Viret 등의 알에 기재된 리니지 양성 세포의 네거티브 선택이다.

5. 골수 추출 절차 (일 0)

  1. 뼈 격리를 위해 해부 가위와 집게를 가져옵니다. 50 ML 원뿔 튜브에 뼈를 수집 미디어 (HBSS 5 % FCS (부피 /의 부피와 보충)) 준비합니다. 얼음에 미디어를 포함하는 50 ML 원뿔을 유지합니다. CO에 의해 죽음을 확인하기 위해 자궁 경부 전위 다음 2 흡입 쥐를 안락사. 더 반사가 감지되지 보장하기 위해 발을 꼬집어.
  2. 수술 부위와 에탄올 또는 메탄올과 수술 도구를 소독. 먼저 절단 및 골반 거들에 따라 신중하게 대퇴골, 경골, 상완골, 골반 거들을 제거합니다. 다시 아래 경골의 대퇴골을 따라 잘라. 깨끗한 뼈를 얻기 위해 가위와 집게를 사용하여 모든 주변 조직을 제거합니다. 유지HBSS + 5 % (부피 / 부피의) FBS 수화 뼈.
  3. 모두 각각의 뼈를 종료 잘라 확인하고, 관절에서 절단하여 뼈를 분리합니다. HBSS + 5 % (부피 / 부피)를 포함하는 10 ML의 주사기 FBS에 부착 된 25 게이지 바늘을 삽입합니다. 압력을 적용하고 50 ML 원뿔에서 70 μm의 여과기 휴식을 통해 모든 골수를 세척합니다.
  4. 주기적으로, 1 mL의 3 mL의 주사기의 플런저를 사용하여 70 ㎛의 필터를 통해 골수를 누른다. HBSS + 5 % (부피 / 권) FBS와 스트레이너를 씻어. 이것은 뼈 조각 및 조직이 없도록 단일 세포 현탁액을 보장한다. 멸균 후드의 절차를 수행하여 무균 세포를 유지합니다.
  5. 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기 골수 세포.

6. 골수 문화 (0 일)

  1. 캔트 또는 흡인 미디어 50 ML 원뿔 튜브 당 1 ml의 염화 암모늄을 기반으로 적혈구 용해 버퍼 (또는 RBC 용해 버퍼 상당)에 재현 탁 세포 펠렛. 룸에서 1 분 배양 후온도는 완전 DMEM 20 % (부피 / 부피) 10 ml의 FBS를 첨가하여 적혈구 용해 완충액을 해소.
  2. 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기 세포.
  3. 가만히 따르다 5 ml의 완전한 DMEM 20 % (부피 / 부피) FBS의 대기음 뜨는 및 재현 탁 골수. 노이 바 우어 계산 챔버와 세포를 계산합니다.
    참고 : 일반 수율이 있어야합니다 약 5 - 마우스 당 × 10 6 셀 (10); 그러나, 수율은 쥐의 다른 변종에 따라 다를 수 있습니다.
  4. IL-3이 보충 된 완전 DMEM 20 % (부피 / 부피) FBS 30 mL를 150-mm 플레이트 당 4 × 107 세포의 밀도로 접시의 골수 세포 (20g 용액 1), IL-6 (50 g ml의 1) 및 SCF (50g ml의 1).
    참고 : 갓 해동-분주 사이토 카인을 사용합니다. 2 주 이상 4 ° C에서 냉동 번 이상 해동 또는 보관 된 사이토 카인을 사용하지 마십시오.
  5. 5 % CO 2, 37 ℃에서 밤새 골수 (약 24 시간)을 인큐베이션.

7. 레트로 바이러스 생산자 세포 배양 (0 일)

  1. 플레이트 18 ml의 완전한 DMEM 20 % (부피 / 권) FBS에서 150 mm 플레이트 당 3 × 10 6 레트로 바이러스 생산 세포.
  2. 하룻밤 37 ° C에서 레트로 바이러스 생산 세포를 품어. (- 3 기증자 마우스 약 2) 15000000 골수 세포에 대해 하나의 150-mm 판을 기대하고 있습니다.

8. 레트로 바이러스 상층 액 (1 일)

  1. 다음날 (약 24 시간 이상), 10 ml의 주사기와 필터는 0.45를 이용하여 150 mm 플레이트에서 직접 레트로 바이러스 상등액을 그림으로써 (7 단계에서 설정) 생산자 판에서 레트로 바이러스 뜨는을 수확 -μm 주사기 필터.
  2. 조심스럽게 신선한 완전한 DMEM 20 % (부피 / 부피) FBS 18 ㎖로 제거 된 레트로 바이러스 뜨는을 교체합니다.
  3. (g ml의 -1 20) IL-6 (50g ml의 1), MSCF (50g ml의 1) 및 Hexadimethrine 브로마이드 (폴리 브렌) (6을 IL-3 필터링 된 레트로 바이러스 상층 액을 보충# 956; g ml의 1).
    주 : Hexadimethrine 브로마이드 레트로 바이러스 형질 도입의 효율의 저하를 방지하기 위해 2 개월마다 신선한하여야한다.

9. 골수 수확 (1 일)

  1. 단계 8.3를 완료 한 후, 단계 6.4로부터의 골수 세포를 수확하고 멸균 된 50 ㎖의 튜브에 비 부착 세포를 포함하는 미디어 전송.
  2. 10 ml의 PBS에 적극적으로 접시를 씻으 단계 9.1에서 50 ML 원뿔에서 수집합니다. 필요한 경우, 세척 공정을 반복한다.
  3. 원심 분리기는 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 세포가 뜨는을 가만히 따르다, 작은 볼륨에 resuspend 세포 (1-3 ml)을 완료 DMEM 20 % (부피 / 부피) FBS, 그리고 계산합니다. 사이토 카인 및 Hexadimethrine 브로마이드를 함유하는 레트로 바이러스 상층 액 1 ㎖ 당 1 × 106 세포로 재현 탁 0 일 골수 75 % 복구 - 50 예상된다.

10. 골수 형질 도입 (1 일)

  1. 레트로 바이러스 상등액 / 뼈 엄마 플레이트여섯 웰 조직 배양 플레이트에 웰 당 3 ㎖의 부피에서 rrow 혼합물. 단계 10.2에서 원심 분리 동안 가스 교환을 최소화하기 위해 플라스틱 포장의 판을 바꿈.
  2. 60 분 37 ° C 1,000 XG에서 랩 여섯 웰 플레이트 스핀.
  3. 스핀가 완료되면 플라스틱 포장을 제거하고 24 시간 동안 37 ° C CO 2 배양기에서 접시를 놓습니다.

(11) 레트로 바이러스 뜨는 및 형질 도입 (2 일)

  1. 24 시간 후, 바이러스 생산 세포주에서 신선한 바이러스 상층 액을 수집합니다. 10 mL의 주사기와 0.45 μm의 주사기 필터를 사용하여 레트로 바이러스 상등액을 필터. IL-3 필터링 된 레트로 바이러스 상층 액 (용액 20g-1), IL-6 (50g 용액 -1) 및 SCF 보충 (50g 용액 -1) 및 Hexadimethrine 브로마이드 (6g 용액 1).
  2. 다음, 조심스럽게 피펫으로 제거하거나 골수 세포를 포함하는 6 웰 플레이트의 각 웰로부터 매체의 상단이 용액을 흡인.
    주 : 작업은 신중 보통 웰의 중앙에 집중되어 골수를 대기음 없다. 이와 달리, 제거 된 상등액을 어떤 손실 골수 세포를 회수하기 위해 스핀 다운된다.
  3. 잘 골수 6 웰 플레이트의 각에 신선한 바이러스 상층 액을 포함하는 사이토 카인 및 Hexadimethrine 브로마이드 3 ㎖를 추가합니다. 플라스틱 접시를 감싸, 60 분, 37 ° C를 1,000 XG에서 스핀 전달을 반복합니다. 접시를 풀다, 37 ° C, 5 % CO 2 밤새 (약 24 시간)에서 세포를 배양한다.

신선한 보충 DMEM의 12 추가 (3 일)

  1. 24 시간 후, 단계 11.2에서와 골수 세포를 포함하는 6 웰 플레이트의 각 웰로부터 매체의 상단이 용액을 제거한다. (g ml의 -1 50) IL-3의 최종 농도로 보충 신선한 DMEM 20 % (부피 / 부피) FBS와 (20g ml의 -1) 제거 된 미디어를 교체, IL-6 (50 g ml의 1) 및 SCF .
  2. 골수를 품어또 다른 24 시간 동안 37 ° C CO 2 배양기에서 접시.

13. 수확 형질 골수 (4 일)

  1. 24 시간 후에, 6- 웰 플레이트에서 골수 세포를 수집한다. 모든 비 부착 세포를 제거하기 위해 PBS에 격렬 판을 씻는다.
    1. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 세포를 원심 분리기와 뜨는을 가만히 따르다.
    2. PBS + 0.5 % (부피 / 부피)의 소량 (1 mL) 중 골수 열 - 불 활성화 FBS를 재현 탁. 얼음에 세포를 유지합니다.
  2. 각 골수 조건의 10 μL 샘플을 채취하고 노이 바 우어 계산 챔버를 사용하여 세포를 계산합니다. 1 가정 -받는 사람 당 2 기증자, 수율은받는 사람 마우스 당 최소 4 × 10 6 세포를 전송하기에 충분합니다. 마우스 당 300 μL - 200에 주입하는 PBS + 0.5 % (vol / vol) 열 활성화 된 FBS 충분한 양의 골수 재현 탁.
    1. 전달 효율을 갖는 적어도 2 × 106 세포를 주입25 %의 정맥 마우스 당 (8 X10 6 셀을 삽입 할 수 있습니다).
      참고 : 우리는 일상적으로 골수 세포의 두 6 웰 플레이트에 5받는 사람 쥐를 주입. 수율이 실질적으로 낮은 경우 충분한 골수 수가 얻어 질 때까지 더 공여 마우스는 사용되어야한다. 최적의 재구성을 달성하기 위해, 적어도 5 × 5는 형질 도입 (양의 형광체)를 각 수신자에 주입한다.
  3. 마이크로 피펫으로, 각각의 골수 조건의 10 μl의 샘플을 채취하여 형광 마커 (그림 1A) (11)의 발현에 따라 유동 세포 계측법에 의해 전달 효율을 분석 할 수 있습니다.
    주 : 일반적으로, 형광 양성 세포의 비율은 구조 및 레트로 바이러스 역가에 따라 25 %에서 70 % 사이이다. 필요한 형질 도입 골수 세포의 수는 서브 - 치명적 조사하는 마우스 전달 효율에 따라 달라질 수 재구성. 트란 낮은sduction 효율이보다 골수 세포를 요구하고, 반대로 골수 전달 효율이 높아 세포의 낮은 숫자는 재구성에 필요한. 25 % 아래의 전달 효율이 최적이며, 부족 재구성과 생존의 원인이 될 수 있습니다. 최적 골수 회복 전달 효율을 확보하기 위해, 새로 제조 된 조직 배양 배지 및 사이토 카인을 사용한다. retrogenic 체계를 이용하여 새로운 TCR을 발현 할 때, 생체 내에서 그 TCR의 선택은 알려져 있지 않다. 개별 TCR의 친화도에 따라 흉선 및 말초 T 세포 발현 TCR 선택 17 달라진다.

14. 마우스 조사, 골수 주입 및 관리

  1. 쥐에게 골수 주입 전날 (13 단계로 당일)을 조사. 다음 용량 사용 C57BL / 6 마우스 (및 기타 야생형 균주), 900 래드, Rag1을 - / - 마우스, 500 래드; SCID 마우스, 300 래드).
    1. 아목시실린에 배치받는 사람 마우스 (50 ㎎ / ㎏ / 일) 또는 조사 전에 다른 항생제 물 처리, 골수 주입 후 첫 2 주 동안 항생제를 계속.
      주 : 최적의 조사량은 경험적으로 결정될 수있다.
  2. 주사를 들어, 바로 주입하기 전에, 다음, 주사 27 게이지에 바늘을 변경 공기 색전증을 방지하기 위해 모든 공기를 추방 무딘 바늘을 사용하여 1 ML의 주사기에 단계 13.1에서 세포를로드합니다. 가열 램프 아래에서 열 및 마우스 당 정맥 마우스 골수 0.2 ml를 주입.
    참고 : 세포가 시간의 길이 또는 정착 할 셀의 주사기에 앉아 않도록하십시오.
  3. 그들이 건강을 유지하도록 주간 생쥐를 모니터링합니다.
  4. 오 후 - 육주, GFP + / ametrine + 및 TCR 공동 식 (그림 1B) (11)에 기초하여 재구성을 확인하기 위해 쥐를 피.

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결과

골수 대표 골수 전달도 (도 1a)에있어서 꼬리 정맥에서 정맥 내로 주입되기 전에 골수 전달 효율은 수확 된 골수의 약 10 μL 중 100 ㎕를 첨가하고, 프로토콜의 단계 133에서 판정한다 PBS 및 ametrine 발현을 분석 하였다. 일반적으로 형광 양성 세포의 비율은 구조 및 레트로 바이러스 역가에 따라 25 %에서 70 % 사이이다. 6주 골수 주사 후, 마우스 골수 재구성 (도 1b)를 결정하기 위해 혈액을 채취한다. 약 말초 혈액의 25 μL은 적혈구가 용해 및 안티 TCRβ로 염색했다. 도 2b에 모든 TCR 양성 세포 concordantly ametrine 형광 단백질을 발현.

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토론

프로토콜에서, 최적의 골수 건강, 전달 효율 및 재구성을 보장하기 위해 여러 세부 중요한 단계를 우리. 첫 번째 중요한 단계는 생성 및 GP + E86 바이러스 생산자 세포의 적절한 유지된다. 초기 통로 생산 세포주를 사용하여 80 % 컨 플루 이하 사용하기 전에에서 유지한다. 48 시간 - 신선한 GP + E86 바이러스 생산 세포를 만드는 경우, 293T 세포가 초기 통로 (24)에 대한 문화에서 성장되어 있는지 확인합니다. 형질 도입 단계에서 너무 많은 GP + E86 셀을 도금하는 바이러스 역가를 낮출 것이다. GP + E86 강력한 바이러스 생산자 보장하기 위해 홀스트 등. (11)에 기술 된 바와 같이 바이러스 역가를 결정합니다. 또한, 수확 된 골수에서 적혈구의 제거는 형질 도입 효율을 향상시킨다. 골수 전구 세포의 상태를 보장하는 프로토콜의 성공에 매우 중요하다. 이를 위해, 항상 신선한 미디어 (후 FCS로 보충 4 ° C에서 4 주 이하) 및 신선한 사이토 카인 (이하 사용...

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공개 사항

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

이 작품은 MLB, BCM에서 당뇨병 연구 센터 (P30-DK079638)의 파일럿 / 타당성 프로그램, JDRF 1-FAC-2014-243-APF, ADA에 NIH (5K22A1119151-01 및 1R56DK104903-01)에서 보조금에 의해 지원되었다 1-15-JF-07, 면역학 MB에 친목, 그리고 로버트와 제니스 맥 네어 재단 AAI 채용.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMEM, 고포도당 + 글루타민Corning Cellgro10-013-CVDulbecco의 4.5 g/L 포도당, L-글루타민 및 피루브산 나트륨을 함유한 독수리 매체의 변형
FBS애틀랜타 생물학S11550
Trypsin-VerseneLonza17-161F
0.45 & #181; m 주사기 필터Thermo Scientific194-2545
폴리브렌SigmaH9268-10G멸균 dH2O
Ciprofloxacin VWRAAJ61970-06
5-플루오로우라실(5-FU)VWRAAA13456-06
피루브산나트륨Corning Cellgro25-000-CI
MEM 비필수 아미노산Corning Cellgro25-025-CI
HEPES 1 M 용액Corning Cellgro25-060-CI
2-MercaptoethanolGibco by Life Technologies21985-023
Pen/StreptCorning Cellgro30-002-CI
L-글루타민Corning Cellgro25-005-CI
150 mm 조직 배양 접시Greiner Bio-one639160
Tisue 배양 처리된 6-well 평판Greiner Bio-one657160
70 µ m 나일론 세포 여과기Falcon352350
마우스 IL-3InvitrogenPMC0033
Human IL-6Invitrogen 
마우스 줄기 세포 인자InvitrogenPMC2113L
10x PBSCorning Cellgro46-D13-CM
HANKS 버퍼Corning Cellgro21020147
BD 10 ml 주사기BD300912
BD 1 ml 주사기BD309659
27 G x 1/2 BD 정밀 글라이드 니들BD
30 g x 1/2 BD 정밀 글라이드 바늘BD305106
PHC0063305109

참고문헌

  1. Qi, Q., et al. Diversity and clonal selection in the human T-cell repertoire. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13139-13144 (2014).
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