쥐에서 간 섬유증의 동물 모델을 제작하는 방법을 설명하고, 간의 조직학적 검사를 통해 섬유화의 정도를 평가합니다. 이 모델은 간 질환의 발병을 연구하고 잠재적인 항섬유화제의 효능을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
세 개의 주에서 6 수컷 위 스타 래트 간 섬유화 동물 모델을 제조 하였다. 이 과정은 일주일에 세 가지 일 연속 복강 주어진 10 ㎎ / ㎏이 dimethylnitrosamine (DMN)의 투여 4 주 필요합니다. DMN이 알려진 hepatoxin과 발암 물질로 복강 주사는 흄 후드에서 수행 하였다. 이 모델은 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 간 변경은 순차적으로 또는 관심의 특정 단계에서 공부하실 수 있습니다. 둘째, 간 질환의 단계 혈청와 ALT 및 아스 파르 테이트 아미노 트랜스퍼 라 아제 (AST) 효소의 측정에 의해 모니터링 될 수있다. 셋째, 다른 단계에서 간 손상의 정도는 메이슨의 Trichome 염색 간 조직의 조직 학적 검사 한 후, 지정된 시점에서 동물을 희생하여 확인할 수있다. DMN 투여 4 주 후, 전형적인 섬유화 점수는 5 Ishak 규모 6이다. 이 모델은 일관되게 재생 될 수있다널리 전위 항 섬유증 제제의 효능을 평가하기 위해 사용된다.
서론
DMN은 강력한 간 특정 독소이다. 래트의 간 부상을 야기하기 위해 대사 조직 분포 및 능력 매기 1로보고하고, 아폽토시스에 의한 간세포 손상과 세포 사멸의 메카니즘은 프리 차드 및 버틀러 (2)에 의해 설명되었다. 이 화합물의 간헐적 투여 개와 쥐 3,4에서 간 섬유증을 유발하는 것으로보고되었다.
메커니즘과 간 섬유증의 형태 학적 변화는 광범위하게이 모델을 사용하여 조사되었다. 래트를 사용하는 초기 연구에서, DMN 3 주간의 치료 지방증 5없이 micronodular 간경변 뒤에 중심 소엽 출혈성 괴사를 일으켰다. 그것은 초기 섬유화에 그를 줬습니다 형성 콜라겐 더 크로스 타입 I (6)보다 더 눈에 띄는되는 유형 III와 연결했다. 다른 원인에 대해 공통적으로, DMN 유발 섬유증 변화는 쿠퍼 세포에서의 증가와 관련되었다; 내가 상주 간 대 식세포n은 사인 곡선. 이 세포는 근육 섬유 모세포로 변신하고 섬유증 7의 기본 문제가 세포 외 기질의 과도한 양을 생산하고 있습니다.
세포 신호 전달의 측면에서, 나카무라 등. TGF-β는 간 섬유증 (8)의 진행에 중요한 역할을한다는 것을 입증 하였다. 그들은 특히 TGF-β 신호를 억제하기 위해, 절단 II 형 TGF-β 수용체를 발현하는 아데노 바이러스를 사용했다. 대조군에 비해 이들 쥐의 간 섬유증은 눈부시게 DMN 처리 동안 중단 하였다. 다른 연구는 TGF-β의 억제가 간 섬유증 개발 9,10의 완화로 연결 것으로 확인되었습니다. 이 모델은 또한 항 섬유증 치료 11 약물 표적으로 사용할 수있는 다른 섬유증 마커 단백질을 식별하기위한 글로벌 유전자 프로파일 링 연구에서 사용 하였다.
기타 화학 물질을 포함 티오 아세트 아미드 (TAA)와 C를 간 섬유화를 유도하는 데 사용ARBON 테트라 클로라이드 (사염화탄소). TAA는 쥐에서 이상 마우스 (12)에서 처음 사용되었다. 이 모델의 장점은 다음과 같습니다 : 화학 물질 관리의 용이성을 물, 특성 micronodular 간경변 및 생화학 적 변화 모델의 재현성을 마시는. 단점은 다음을 포함한다 : 간 섬유증 3 개월 장기간 개발 및 간 섬유증의 유도 분자 메카니즘에 대한 이해의 부족. 사염화탄소에 관해서는, 그것의 사용은 다음과 같은 이유로 거절했다 : 그것은 인간의 간 질환을 모방하지 않습니다, 오존층에 해로운 영향이 동물에게 고통과 고통의 원인, 인간에게 매우 독성 및 취급에 제공되는 추가주의 사항 및 필요합니다 처분 13, 14.
간경변에 대한 실험 모델로 (수술 적 치료에 의해) 장기간 담관 폐쇄가 먼저 Kountouras 등. (15)에 의해보고되었다. 이 방법은 인간과 동물에 독성이있다. However 개발하는 간 섬유증에 필요한 시간은 변한다. 마르케스 등. (16) 30 보고서의 검토, 간 섬유증 개발하는 것이 수술 후 4 주 7 일간 갔다 것으로 나타났습니다. 설명 병리학 적 변화는 인간의 만성 담즙 성 섬유증의 사람들을 모방하고 모델이 분야에 관심있는 연구자에 대한 더 적합 할 것이다.
요약하면 4 주 동안 쥐에 DMN의 일정한 용량의 간헐적 투여은 인간의 질병을 모방 간 섬유증을 생산하고 있습니다. 투여 된 쥐 간 손상 및 실질 섬유화 4,17의 진보적 인 발전을 보여줍니다. 질병의 진행 정도와 특정 시점에서 혈액 샘플 또는 동물의 희생을 통해 감시 할 수 있으며, 그 효과는 18 재현성이다. 따라서이 모델은 광범위 간 섬유화 및 간경변의 메커니즘을 연구뿐만 아니라 잠재적 인 항 섬유증 제제 10,19,20 스크리닝하기 위해 사용되어왔다.
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프로토콜
모든 동물 실험은 응용 과학의 학교, 테마섹 폴리 테크닉의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
DMN 1. 준비
- 피펫 (200) DMN의 μL (1 ㎍ / ㎖ 원액)와 주입을위한 10 ㎎ / ㎖의 DMN 용액을 제조 PBS의 19.8 ml를 추가합니다.
참고 : DMN은 발암입니다. 동물의 주사를 DMN을 준비하고 수행하는 흄 후드를 사용합니다.
DMN 2. 복강 내 주사
- 200g - 150의 평균 무게 남성의 Wistar 쥐를 사용합니다. 실험의 시작 7 일 전 - 4 쥐를 적응.
- 12 시간 빛과 12 시간 어두운 사이클, 22 ± 1 ℃의 실온에서 쥐를 유지한다. 쥐 Chow 및 임의 량의 물을 제공한다.
- 매일 음식과 물 섭취량을 측정합니다. 체중 주간을 측정합니다.
- 10 mg / kg 체중의 투여 량에 기초하여 각각의 래트에 대해 DMN의 양을 계산한다. 25 게이지 바늘 t으로 1 ML의 주사기를 사용하여오 주사기에 DMN 솔루션의 계산 된 볼륨을 그립니다.
- 복강 내 주사 (21)의 쥐를 억제.
- 쥐가 제대로 억제로, 복부의 오른쪽 아래 사분면에 바늘을 소개 복부 공간에 바늘의 정확한 위치를 확인하고 천천히 DMN 솔루션을 주입 (아무것도 흡입 될 수 없습니다) 주사기의 플런저에 다시 그립니다.
- DMN의 용량이 투여되면, 천천히 바늘을 인출하고 샤프 함으로 처리.
- 4 주간 일주일에 3 일 연속 DMN의 복강 내 주사를 수행합니다. 매일 같은 시간에 주사 투여. 주사 매주의 시작에서의 체중에 기초하여 용량을 다시 계산한다.
- 생화학 적 매개 변수를 측정하기 위해 꼬리 정맥 주에서 혈액을 수집 : 알라닌 아미노 전이 효소 (ALT)와 아스 파르 테이트 아미노 전이 효소 (AST) 22.
- 상업 수의사를 사용하여 측정 혈청 ALT 및 AST테스트 화학 분석기.
3. 총 검사 및 간 수확
- 100 mg / kg 체중의 용량으로 복강 내 펜토 바르 비탈의 주사에 의해 래트를 안락사. 심장 박동의 부족을 확인하여 죽음을 확인합니다.
- 사후 부검을 준비하고 복부 위쪽으로 향하게 지느러미 드러 누움의 해부 보드에 파킨슨 병 등. (23) 장소 죽은 쥐에 의해 설명 된대로 동물의 상태를 평가합니다.
- 소독 및 70 % 에탄올로 피부를 적셔.
- 가위를 사용하여 피부를 턱 항문에서 ventrum의 전체 길이를 절개하고, 피부를 반영한다. 가위로 복부 내장을 노출, 칼 모양의 연골에 항문에서 복벽을 절개.
- 어떤 이상이 있는지 확인하기 위해 현장에서 복부 장기를 검사합니다. 색상, 크기 변화, 장기의 위치 및 복강 내의 액체의 존재를 참고. 검사기관의 일관성과 어떤 냄새의 존재를 확인합니다.
- 가위와 집게를 사용하여, 그것의 인대 및 첨부 파일의 전체 간 무료 해부.
- 이 진동판에 부착 된 hilus에서 시작 및 첨부 파일의 모든 간 로브를 무료로 작동합니다. 조심스럽게 모든 인대, 혈관을 잘라.
- 배양 접시에 간 이동 및 간 무게.
- 5mm 간 로브의 두께 섹션 - 메스를 사용하여, 2를 잘라. 일관성을 위해, 항상 같은 간 로브에서 샘플을 채취. 고정을 위해 오른쪽 측면 로브에서 두께에 쐐기를 10 % 포르말린에 lobe.Immediately 장소의 가장자리에서 약 24 1cm를 약 5 mm 직경을 가지고. 포르말린 볼륨 조직 1:10 이상인 것을 확인.
- 다른 연구에 필요한 경우 수확은 바로이 시점에서 간 로브 (액체 질소를 사용하여) 부분을 고정. 일관성을 위해 같은 간 엽에서 (3.8), 샘플에 관해서.
4를. 간 처리, 임베딩 및 단면
- 24 시간 이상 동안 10 % 완충 포르말린에서 간 샘플을 고정한다.
- 고정 후, 간을 잘라 카세트에 배치하고 자동화 된 조직 프로세서의 바구니에로드.
- 10 % 포르말린을 포함하는 제 1 스테이션에 카세트와 바구니를 놓습니다. 확인 카세트가 완전히 침수된다. 사이클이 시작될 때까지 그들은 최대 12 시간 동안이 방에서, 남아있을 수있다.
- (50 %, 70 %, 90 %, 100 % (2 국), 크실렌 (2 연)과 유동 파라핀의 농도의 에탄올 : 다음 방법을 포함하는 연속 스테이션을 통해 1 시간마다 카세트 회전 티슈 프로세서 프로그램 2 연).
- 매립 역 왁스 욕에 간 샘플을 옮긴다. 매립 기계는 적어도 한 시간 빠른 켜져 있는지 확인합니다.
- 사용하여 미리 예열 집게는 (65 ° C)에서, w에서 각 카세트를 제거매립 기계의 따뜻한 판 (65 ° C) 상에 도끼 목욕 및 장소. 스테인레스 강 기재 금형 내로 유동 파라핀의 충분한 양을 조제 전체의 절반까지 (65 ° C로 미리 예열). 금형에 카세트에서 간 부분을 전송합니다. 시험편의 절단면에 배치되어 있도록 상기 몰드의 바닥 평면 (현미경으로 검사한다).
- 액체 파라핀 완전히 금형을 채우기 위에 빈 카세트를 장착하고 적어도 30 분 동안 냉각 매립 기계의 4 ° C를 판에 금형을 배치합니다.
- 왁스가 냉각 및 응고 것을 확인하고, 몰드에서 파라핀 블록을 제거합니다. 블록은 쉽게 튀어과 스틱 또는 균열 안된다. 이 경우, 블록을 용융이 단계를 반복합니다. 이 응고 후 파라핀 블록을 절단 할 수있다. 블록은 수년 동안 실온에서 저장 될 수있다.
- 왁스 층까지 10 μm의 두께로 마이크로톰 및 구역에 파라핀 블록을 배치내장 된 간 조직이 표시 될 때까지 충분히 제거된다.
- 5 μm의 두께로 잘라 마이크로톰의 설정을 변경합니다. 집게를 사용하여, 모서리를 잡고 잘 절단 부분을 집어 조심스럽게 40 ℃에서 수조에서 섹션 로트.
- 부드럽게 부동 섹션에서 깨끗한 유리 슬라이드를 배치하고 유리 슬라이드의 표면에 올립니다. 하룻밤 37 ° C에서 따뜻한 슬라이드에 슬라이드를 놓습니다.
5. 메이슨 트리 크롬 염색
- 다음과 같이 얼룩을 적용하기 전에, 상기 왁스를 제거하고 조직을 재수 슬라이드 치료 :
- 5 분 동안 크실렌의 섹션을 담가. 배를 반복합니다.
- 3 분 동안 100 % 에탄올 섹션을 담가. 1 배를 반복합니다.
- 90 %, 80 % 및 70 % : 1 분 에탄올의 다음과 같은 솔루션의 각 섹션을 담가.
- 슬라이드에 기존의 에탄올을 제거하기 위해 수돗물에서 슬라이드를 씻어.
- 핵을 염색하는 10 분 동안 철 헤 마톡 실린 슬라이드를 담가.
- 슬라이드에서 여분의 얼룩을 제거하기 위해 물에 슬라이드를 씻어.
- 세포질을 염색하는 데 2 분 동안 Biebrich 스칼렛 - 산 푹신에서 슬라이드를 담가.
- 물 슬라이드를 씻어.
- 아닐린 블루의 흡수를 촉진하기 위해 10 분 동안 포스 / 몰리브덴 산 용액에 슬라이드를 놓습니다. 사용의 2 라운드 경기 인 텅스텐 / 몰리브덴 산 용액을 변경합니다.
- 콜라겐 섬유를 염색하는 10 분 동안 아닐린 블루 솔루션에 슬라이드를 놓습니다.
- 물을 초과 얼룩을 씻어 차별화 슬라이드의 색이 더 섬세하고 투명 렌더링하는 자리를 차지할 수 있도록 1 분 동안 1 % 아세트산 용액에 슬라이드를 배치합니다.
- 물 슬라이드를 씻어 조직 섹션을 탈수로 진행합니다. 다음과 같이 탈수 단계는 다음과 같습니다
- 다음 conce에, 10 초 때마다 연속적으로 슬라이드를 빠져에탄올 ntrations : 70 %, 80 %, 95 % 및 100 %.
- 100 % 에탄올에 30 초간 담가 슬라이드. 1 배를 반복합니다.
- 5 분마다 제거하는 에탄올 자일 렌의 3 국을 통해 슬라이드를 씻어.
- 설치 미디어 (예를 들어, DPX의 mountant)와 시편 위에 유리 커버 슬립을 마운트하고 건조 할 수 있습니다.
주 : DPX는 빨리 건조 얼룩을 보존하고 조직 절편 보호 합성수지이다.
간의 메이슨의 Trichome 스테인드 섹션 6. 섬유증 점수
- 수의학 병리학이 25 개의 점수 섬유증에 따라 섬유화의 정도를 평가합니다. 섬유화 점수가 맹검 방식으로 독립적으로 두 개 또는 세 개의 병리학 자에 의해 수행되는 경우가 최적 일 것이다. 이러한 시나리오에서는 득점의 차이점을 제압 토론 및 그룹의 검토 후 최종 점수를 얻을 수 있습니다.
| 점수 | 기술 |
| 0 | 어떤 섬유증 없습니다 |
| 1 | 또는 짧은 섬유 성 격막이없는 일부 포털 지역의 섬유 확장, |
| 이 | 또는 짧은 섬유 성 격막이없는 대부분의 포털 영역의 섬유 확장, |
| 삼 | 대부분의 포털 영역의 섬유 확장, 포털에 가끔 포털 (PP) 브리징 |
| 4 | 중앙 (PC에 표시 브리징 ((PP를 포털에 포털)뿐만 아니라 포털과 포털 지역의 섬유 확장) |
| (5) | 가끔 결절 (불완전 간경변)와 (PP 및 / 또는 PC)를 브리징 표시 |
| 6 | 간경변, 가능성 또는 확정 |
표 1 : 섬유증은 메이슨의 Trichome 스테인드 간 섹션 (25) 읽기에 사용 점수.
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결과
DMN 처리 된 쥐들은 체중을 잃고 주름 장식 헤어 코트 덜 활발한된다. DMN 처리 된 쥐의 평균 체중에 상당한 손실이; 제 2 검출 후의 DMN 처리 주,이 차이는 DMN 처리 (도 1a) 후 3 주와 4를 통해 유지된다. 쥐가 연속 주간 DMN을받을 때, 간 손상은 작아됩니다. 간 지수; 이는 최종 체중의 간 중량의 비율이 DMN 처리 된 쥐들 (도 1b)에 대한 낮았다이다.
그림 1 : A) DMN의 바디 무게는 쥐를 처리 하였다. 데이터는 SD ± (- 8 N = 6) 수단으로 표시됩니다. * P <정상 대조군 b) 간 인덱스에 비해 0.05.; DMN의 최종 체중...
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토론
우리는 간 섬유화 동물 모델을 만들기 위해, 간 섬유증의 정도를 평가하는 방법을 설명 하였다. DMN의 정확한 용량을 제공하고 주간 복강 내 주사의 일정을 준수하는 것이 중요합니다. 실험이 진행되는 동안, 래트 체중 및 DMN 주사의 매주의 시작시에 용량을 다시 계산하는 것이 중요하다. DMN은 독성과 연기 캐비닛에서 처리 될 필요가 명심하십시오. 우리는뿐만 아니라 연기 캐비닛에 복강 주사를 수행합니다. 반복 주사의 필요성으로 주입 억제 및 정확한 기술은 내장에 오염 물질의 도입 및 손상을 방지하는 것이 중요하다. 우리는 거의 복강 내 주사에서 사망률이 없습니다.
쥐 실험 기간 동안 하루에 2 배 모니터링해야합니다. DMN 주입의 마지막 주 동안, 동물들은 죽어가는 징후를 더 자주 밀접하게 관찰해야한다. 이 요정 인간 손상이 가장 심한 및 영향을받는 쥐가 inappetent 할 때 OD는 체중과 조건을 잃게됩니다. 25 - 어떠한 의학적 개입이 없으면 쥐의 40 %가이 기간 ...
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공개 사항
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
저자는 싱가포르 교육부의 보조금 번호 MOE2010-IF-1-025의 자금 지원을 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 디메틸 니트로사민 | Wako | 147-03781 | |
| 포르말린 | 시노팜 화학 물질 | F63257009 | |
| 에탄올 | 시그마 | 64-17-5 | |
| 크실렌 | 피셔 | 1330-20-7 | |
| Masson 트리 홈 염색 | |||
| 아닐린 블루 | 전자 현미경 과학# | 42755 | |
| Acid Fuschin | Electron Microscopy Sciences | RT42685 | |
| Scarlet Red | Electron Microscopy Sciences | #26905 | |
| 포스포텅스텐 산 수화물 | ALFA AESAR | ALFA40116.4 | |
| 포스포몰리브딕산 수화물 | 시그마 SG | 221856-25G | |
| Weigert's Iron Hematoxilyn | Merck | 1.15973.0002 | |
| DPX 마운팅 미디엄 | Merck | HX066873 | |
| 티슈 프로세서 | Leica | Leica TP 1020 | |
| 임베딩 머신 | Sakura | Sakura Tissue Tek TEC5 임베딩 시스템 | |
| Microtome | Leica Leica | RM 2235 | |
| 수의사 검사 분석기 | Idexx | 수의사 검사 8008 |
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