적용 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을하여 이펙터 전좌 효율을 검사합니다<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; siRNA를 음소거시

Patrice Newton; Eleanor A. Latomanski; Hayley J. Newton

doi:10.3791/54210

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방법 논문

적용 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을하여 이펙터 전좌 효율을 검사합니다

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DOI:

10.3791/54210

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2016년 7월 6일

Patrice Newton¹ , Eleanor A. Latomanski¹ , Hayley J. Newton¹

¹Department of Microbiology and Immunology, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, University of Melbourne

이 논문에서

요약

세균성 병원균과 호스트 사이의 상호 작용을 조사하는 것은 생물학적 연구의 중요한 영역입니다. 여기서는 BLAM 기판을 사용하여 siRNA의 유전자 사일런 동안 Coxiella burnetii에 의해 이펙터 전위를 측정하기 위해 필요한 기술들을 설명한다.

초록

Coxiella burnetii의, Q 발열의 원인 물질은 복제 성 틈새를 확립 타입 IV 도트 / ICM 분비 시스템에 의존하여 세포 내 병원체이다. 이펙터의 코호트는 호스트 프로세스를 조작 및 복제에 대한 고유 리소좀 유래 액포의 확립을 허용하는 숙주 세포에 본 시스템을 통해 전좌된다. 특정 유전자의 siRNA를 이용하여 침묵과 β-lactamase의 활성에 의존하는 FRET 기반의 기판을 사용하여 이펙터 전위 측정 : 여기에 제시된 방법은 두 개의 잘 확립 된 기술의 조합을 포함한다. 이 두 접근 방법의 적용, 우리는 박테리아 분비 시스템 기능 및 이펙터 전위에서 호스트 인자의 역할을 이해하기 시작할 수있다. 이 연구에서 우리는 Rab5A과 Rab7A, 모두 세포 내 이입 인신 매매 경로의 중요한 규제 기관의 역할을 조사했다. 우리는 이펙터 translocatio의 감소 중 단백질 결과의 발현을 침묵 입증N 효율. 이러한 방법은 또한 쉽게 분비 시스템을 이용하는 다른 세포 및 세포 외 병원체를 조사하도록 변형 될 수있다. 이러한 방식으로, 세균 이펙터 전위에 관련된 호스트 요인 글로벌 영상이 드러날 수있다.

서론

Coxiella burnetii의는 인수 공통 인체 감염 Q 열병을 일으키는 독특한 세포 내 병원균이다. 이 질환은 증상이 혈청에서 종종 노출 ^한 후 심내막염 년으로 나타난다 생명을 위협하는 만성 감염 연장 임상 프레 젠 테이션의 광범위한 스펙트럼과 연결됩니다. 인간의 감염은 주로 반추 동물, 특히 젖소, 양, 염소 감염의 주요 저수지와 오염 된 에어로졸의 흡입을 통해 발생합니다. 이러한 동물 Coxiella 감염은 일반적으로 무증상이지만 감염 낙태를 트리거 할 수 있으며, 유체 출산 및 태반 내의 상당한 세균 부하는 ^한 로컬 ^{환경을 오염시킬} 수있다. 공중 보건과 농업 산업 모두 최근 네덜란드 ^2에서 발생한 Q 열병 발생이 관찰되었다에 엄청난 부담 등 오염의 예는 수 있습니다. 2007 년과 사이2010, Q 열병 4,000 통해 인간의 경우는 진단받은이 발발은 염소 농장 ^3의 중요한 오염에 연결되었다. 또한, Coxiella 인해 심각한 이환율과 사망률 ^(4)을 일으킬 수있는 박테리아와 필요한 낮은 전염성 선량의 환경 안정성에 미국 질병 통제 예방 센터에 의해 분류로, 잠재적 인 생물학적 무기입니다.