포유류 뇌 조직에서 미토콘드리아 시각화 및 분석은 어려운 작업입니다. 여기에서는 연속 블록면 주사 전자 현미경(SBFSEM)의 3차원(3D) 재구성 분석을 사용하여 이 중요한 에너지 생성 소기관의 형태학적 및 체적 분석에 대한 통찰력을 얻는 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
인간의 두뇌는 주로 연료 공급원으로서 포도당에 의존하는 고 에너지 소비 기관이다. 글루코스는 아데노신 삼인산 (ATP)의 형태로 세포 에너지를 생산 당분, 트리 카르 복실 산 (TCA) 사이클 및 산화 적 인산화 (OXPHOS) 경로를 통해 뇌 미토콘드리아 이화된다. 미토콘드리아 ATP 생산의 손상은 저명한 신경과 myopathic 증상이 임상 적으로 제시 미토콘드리아 질환을 발생합니다. 미토콘드리아 결함도 신경 발달 장애 (예를 들어, 자폐증 스펙트럼 장애) 및 신경 퇴행성 질환에 존재한다 (예 : 근 위축성 측삭 경화증, 알츠하이머와 파킨슨 질환). 따라서, 건강 상태 및 질환 모두하에 미토콘드리아 형태, 구조 및 분포의 3 차원 분석을 수행하기위한 필드에 증가 된 관심이있다. 뇌 미토콘드리아 형태는 특히 일부 미토콘드리아와 함께,에서와 매우 다양하다시냅스 영역 전통적인 광학 현미경의 해상도 한계 이하의 <200 nm의 지름의 범위에있는. 뇌의 미토콘드리아-대상으로 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하는 것은 상당히 공 초점 현미경에 의한 organellar 검출을 향상시킨다. 그러나, 대형 미토콘드리아의 이미지 oversaturating없이 비교적 작은 크기의 미토콘드리아의 검출 감도에 대한 제약을 극복하지 않는다. 시리얼 전송 전자 현미경 성공적 시냅스 신경 세포에서 미토콘드리아를 특성화하기 위해 사용되었지만,이 방법은 매우 시간 소모적 여러 샘플을 비교할 때 특히이다. 시리얼 블록면을 주 사형 전자 현미경 (SBFSEM) 기술은 조직 및 데이터 취득 촬상 블록 절편의 자동화 된 프로세스를 포함한다. 여기서 우리는 신속하게 재구성과 미토콘드리아 형태를 시각화하기 위해 쥐의 뇌에서 정의 된 영역의 SBFSEM을 수행하는 프로토콜을 제공합니다. 이 기술nique 또한 정의 뇌 영역 미토콘드리아 번호, 볼륨, 크기 및 분포에 대한 정확한 정보를 제공하기 위해 사용될 수있다. 얻어진 이미지 해상도 (일반적으로는 10 nm 이하) 높기 때문에 어떤 형태 총 미토콘드리아 결함은 검출 될 수있다.
서론
미토콘드리아는 세포의 세포 골격과의 긴밀한 상호 작용, 자신의 모양과 휴대 단서 및 필요에 따라 위치를 변경 동적 소기관이며, 이러한 뉴런 1 칼슘 전류와 같은 셀룰러 이벤트에 대한 응답이다. 다른 세포 소기관이 차례로 자신의 역학과 신진 대사 2를 조절 소포체를, 예와 미토콘드리아는 또한 상호 작용합니다. 미토콘드리아 형태, 즉 서로 다른 세포 유형의 이질성을 보여줍니다. 세포 기관의 모양은 시트, 자루 및 타원 3 구성된으로 관에 따라 다릅니다. 미토콘드리아 융합과 분열주기 단백질 위치, 크기, 형상 및 미토콘드리아 (4)의 분포를 조절할 수 있음을 보여왔다. 또한, 미토콘드리아 형상의 변화는 신경 퇴화, 신경 세포의 가소성, 근육 위축, 칼슘 신호, 반응성 산소 종의 생성뿐만 아니라, 수명 및 세포사 연루 그쪽와 연관된T 세포 특이 미토콘드리아 형태는 정상적인 세포 기능 5-11의 유지에 중요하다.
미토콘드리아의 주요한 생체 에너지 함수는 TCA 사이클을 통해 완전한 영양소 파괴 (즉, 글루코스, 지방산 류 또는 아미노산)를 포함하고 OXPHOS 12 경....
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프로토콜
윤리 정책 : 동물 과목을 포함하는 절차는 버지니아 공대에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
주의 :이 프로토콜에 사용되는 여러 구성 요소를 처리하고 폐기 할 때 극단적 인 예방 조치가 취해 져야한다. 사용하기 전에, 제도적 지침 및 건강과 안전 사례 지역은 특히 인 중금속과 방사능 소스, 납, 질산 모두이다 휘발성 매우 유독 산화 오스뮴, 우라 닐 아세테이트, 대한, 설립 따라야합니다 중금속 독. Thiocarbohydrazide (TCH)을 잘못 취급하면, 폭발과 유독 가스를 생산하기 위해 분해 할 수 있습니다. 많은 기관이 시약은 일상적으로 사용하고 도움을 제공 할 수있는에 EM의 핵심 시설을 제공합니다.
뇌 조직과 SBFSEM 이미징 1. 준비
- 5 % isoflura - 4를 사용 - (4 개월 ~ 2) C57 블랙 마우스 (C57BL / 6J 변형) 젊은 마취네브라스카 제도적 지침에 따라. 근육, 자발적인 움직임과 꼬리 핀치 같은 혐오 자극에 대한 반응의 부족의 손실을 모니터링하여 마취를 확인합니다.
- 해부 트레이에 마우스를 고정하고 복부 중간 선을 따라 피부에 절개를합니다. 마우스의 갈비뼈를 노출 피부에 더 절개를합니다. 다이어프램을 절개 조심스럽게 뛰는 심장을 노출하기 위해 주변....
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결과
우리는 뇌 미토콘드리아 형태와 크기가 다른 신경 하위 구획의 유형이 있음을 보여줍니다. 렌티 바이러스는 미토콘드리아-대상으로 녹색 형광 단백질을 발현하는 형질 도입 저밀도의 연결을 문화에 공 초점 현미경은 말초 신경 돌기에 거주하는 사람들은 개별 연장 된 형태 (그림 1 AB)를 나타내는 반면, 신경 소마에 거주하는 미토콘드리아가하는 망상 네트워크를 형성하는 것으로 나타났다. SBFSEM 기술을 사용하여 미토콘드리아의 형태, 크기, 부피 분포는 마우스 뇌에서 분석 하였다. 미토콘드리아의 3 차원 (3D) 이미지는 마우스 뇌의 해마 신경 돌기 모두와 시냅스로부터 재구성되었다. 시냅스 미토콘드리아는 확인 및 주민 미토콘드리아을 품고 시냅스 부 튼스의 수를 정량화 하였다. 미토콘드리아의 크기 이질성은 인터넷 (축삭 구획 대 수지상에서 관찰gure 1 CD). 또한, 마우스 뇌의 해마에 많은 작은 시냅스 구획
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토론
신경 시스템의 복잡성은 적절한 해상도와 미토콘드리아로 큰 조직의 볼륨을 재구성하고, 형태 및 세포 소기관의 분포를 분석에 상당한 도전을 포즈. 뉴런, 올리고 덴드로 사이트와 입체적으로 확장 된 다수의 프로세스와 성상 세포를 포함한 여러 세포는 뇌 조직 (43) 내에서 상호 작용한다. 미토콘드리아는 세포와 먼 프로세스의 소마에 모두 존재하기 때문에, 미토콘드리아 형태는 신경계 (그림 1)에서 매우 다형성이다. 충분한 해상도 적절한 3 차원 구조 정보 그러므로 이러한 촛점 또는 이광자 현미경 (44,45)과 같은 종래의 광학 현미경 기술에 의해 얻어 질 수 없다. 전자 현미경은, 충분히 높은 해상도로 신경 조직에 대량의 재구성을 허용하는 경우에만 현재 이용 가능한 기술이다. 전통적으로, 신경 조직의 3 차원 복원 달성했다얇은 부분 (29)의 직렬 단면 투과 전자 현미경 (SSTEM)에 의해 D. 그러나, 최근의 기술 발전은 볼륨 전자 현미경 .......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다. Emily K Benson은 Renovo Neural Inc.의 유급 직원이며, Grahame J Kidd는 직렬 블록 페이스 SEM 서비스 및 분석의 상업 제공업체인 Renovo Neural Inc.에서 3DEM의 과학 이사로 재직하고 있습니다.
감사의 글
기술적인 도움을 주신 Sidney Walker님께 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institute of Health)의 보조금(1R01EY024712-01A1)으로 부분적으로 지원되었습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf
륨 트 합니다. 전도SEM 는 핀 준비를 위한 있습니다 의 일부로 공급일td colspan="4">
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| C57BL/6J 마우스 | 잭슨 실험실 | 664 | |
| Isoflurane | VETone, 상품명 Fluriso | 501017 | |
| Dissection | Fisher scientific | S65105 | |
| 해부 가위 | Ted Pella Inc. | 1316 | |
| 나비 캐뉼라 | Exel International | 26704 | |
| 인산염 완충액 식염수 | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| 필터(0.45 미크론) | EMD Millipore | NC0813356 | |
| 해부 현미경 | Olympus | SZ61 | |
| 진동 절편 시스템 | Ted Pella Inc. | Vibratome 3000 | |
| 나트륨 카코딜레이트 | EMS | 12300 | |
| 탄닌산 | EMS | 21700 | |
| 칼륨 페로시아나이드 | J.T. 베이커 | 14459-95-1 | |
| 오스뮴 테트록사이드 4% 용액 | EMS | 19150 | |
| 티오카르보하이드라지드 | EMS | 21900 | |
| L-아스파르트산 | 시그마-알드리치 | A93100 | |
| 수산화칼 | Acros Organics | 43731000 | |
| 납 질산염 | EMS | 17900 | |
| EMbed-812 임베딩 키트 | EMS | 14120 | 포함 812 레진, DDSA, NMA, 그리고 DMP-30. |
| 글루 타르 알데히드 25 % EM 등급 | Polysciences Inc. | 1909 | |
| 파라포름알데히드 | EMS | 19202 | |
| 우라닐 아세테이 | EMS | 22400 | |
| 에탄올 | EMS | 15055 | |
| 프로필렌 옥사이드 | EMS | 20400 | |
| 임베딩 몰드 | EMS | 70907 | |
| 알루미늄 시편 핀 | EMS | 70446 | |
| 콜로이드 실버 Liquid | EMS | 12630 | |
| Razor | EMS | 72000 | |
| Super Glue (Loctite Gel Control) | Loctite | 234790 | 하드웨어/공예품 상점에서 이 품목을 취급 |
| 성 에폭시 | Ted Pella Inc. | 16043 | |
| 주사 전자 현미경 | Zeiss | Sigma VP | |
| Gatan Inc. | 용 챔버 내 초박 절곡기 | 3View2 | 다른 SEMs 트리밍 현미경을 위해 디자인될 수 |
| Gatan Inc. | 3View 시스템 | ||
| Low kV 후방 산란 전자 검출기 | Gatan Inc. | 3V-BSED | |
| ImageJ/ 피지 프로세싱 패키지 | ImageJ ver 1.50b, FIJI 다운로드 2015년 10월 1 | http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf | |
| http://rsb.info.nih.gov/ij/< | |||
| http://fiji.sc/TrakEM2 |
참고문헌
- Kasahara, A., Scorrano, L. Mitochondria: from cell death executioners to regulators of cell differentiation. Trends Cell Biol. 24, 761-770 (2014).
- Friedman, J. R., et al. ER tubules mark sites of mitochondrial division. Science. 334, 358-362 (2011).<....
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