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방법 논문

쥐 뇌의 일방적 인 북반구에 반복 경 두개 자기 자극

12.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54217

⸱

2016년 10월 22일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Rehabilitation Medicine, Chungnam National University Hospital, Daejeon, 2Department of Biomedical Engineering, Seoul National University College of Medicine, 3Institute of Medical and Biological Engineering, Medical Research Center, Seoul National University, 4Department of Biomedical Engineering, Seoul National University Hospital, 5Department of Nuclear Medicine, Seoul National University Hospital, Seoul National University College of Medicine, 6Department of Rehabilitation Medicine, Gangwon Do Rehabilitation Hospital, 7Department of Rehabilitation Medicine, Seoul National University Hospital, Seoul National University College of Medicine

이 논문에서

요약

우리는 쥐의 뇌의 편측성 반구에 반복적인 경두개 자기 자극(rTMS)을 적용하여, 양귁 선의 꼭짓점에서 1cm 측면으로 25mm 8자형 코일을 배치하고 코일을 45° 각도화하여 적용했습니다. rTMS를 위해 사내 수냉식 시스템이 20분 이상 사용되었습니다.

초록

이전의 반복적 경두개 자기 자극(rTMS)의 설치류 모델은 편측 반구 rTMS 대신 전뇌 자극을 채택했는데, 이는 인간 피험자에게 사용된 프로토콜과 다릅니다. 우리는 쥐의 뇌의 편측 반구에 rTMS를 성공적으로 적용했다고 보고합니다. rTMS는 저주파(1Hz), 고주파(20Hz) 또는 가짜 자극 프로토콜과 함께 작은 25mm 8자 코일을 사용하여 뇌의 한쪽에 전달되었습니다. 코일의 중심을 이귓바퀴 선의 꼭짓점 옆으로 1cm 정도 배치하고 코일을 지면에 대해 45° 각도로 배열하여 반대쪽 피질에 대한 rTMS의 잠재적인 직접적인 영향을 최소화했습니다. 또한 사내 수냉식 시스템을 사용하여 20Hz 자극 주파수에서도 20분 이상 반복적인 자기 자극을 가능하게 했습니다. 즉각적인 초기 유전자(Arc, Junb 및 Egr2)의 전사 증가는 가짜 자극 후보다 rTMS 후에 더 컸습니다. 20분 1-Hz rTMS를 5일 연속 투여한 후, bdnf mRNA 발현은 반대쪽 쪽보다 자극된 피질에서 유의하게 높았습니다. 여기에 제시된 모델은 rTMS의 효과에 대한 반구 간 차이를 분석할 수 있도록 하여 rTMS의 분자 메커니즘을 설명할 것입니다.

서론

반복적 인 경 두개 자기 자극 (RTMS), 비 침습적 뇌 자극 neuromodulation위한 도구, 예컨대 1,2- 중추 통증, 우울증 3, 4, 편두통, 심지어 5-7 뇌졸중과 같은 다양한 증상의 치료에 적용되어왔다. 머리가 대뇌 피질과 결과 신경 세포 활성화에 전기장을 유도에 신속하게 코일을 통해 전류를 변경. 대뇌 피질의 흥분이 자극이 종료 된 후 30 분 동안 지속될 수 RTMS에 의해 변조 될 수 있습니다.

후 효과 RTMS의 제안 메커니즘은 장기 강화 / 우울증 같은 효과 8, 이온 밸런스 9 과도 변화를 포함하고, 대사는 10을 변경합니다. 또한, 디 라자로 등의 알. 간헐적 세타 버스트 자극은 자극에 모두 기관의 신경 세포 삼각뿔하는 흥분성 시냅스 입력에 영향을 미치는 것이 좋습니다과 반대측 반구 (11).

중요한 제한은, 그러나, 임상 상황에 벤치 증거를 번역에서 연구를 방해했다. 우선, 이전 동물 연구에서, RTMS는 전체 뇌 자극 (12)을 사용 하였다. 전체 뇌 자극 인간 연구 9에 사용되는 프로토콜과 상당히 다르다. 또 다른 문제는, 자극 지속 기간과 관련이있다. 이것은 적어도 부분적으로 기인하는 효과적인 냉각 시스템이 과거의 작은 코일 사용할 있다는 사실이다.

최근 몇 년 동안, 정액 기사는 작은 동물의 뇌에 RTMS 실험에서 이러한 어려움을 극복하기위한 방법을 제안 발표되었다. 이러한 동물 모델에 의해, 쥐의 뇌는 낮은 주파수 RTMS (13)에 응답하여 인간에서와 유사한 대뇌 피질의 흥분의 변화를 보여준다 것으로 밝혀졌다. 더 중요한 것은, RTMS의 세포 및 분자 메커니즘은 점점 BEI 있습니다NG는 RTMS의 동물 모델을 이용하여 조사 하였다. 지점에있는 경우가 억제 interneuron의 구별 유형이 간헐적 세타 버스트 자극 (14)에 가장 민감한 것으로 알려져 있다는 점이다. RTMS의 설치류 모델은, 그러므로, RTMS에 의한 변화의 분자 토대에 많이 추구 질문을 탐구하는 새로운 기회를 제공합니다. RTMS 작은 동물 모델보다 실험실에서 사용될 수있는 경우 크게 가속이 분야에서 연구를 강화할 수있다.

우리는 지금 쥐의 뇌, 이전 작업 (15)의 확장의 일방적 인 반구에 RTMS을 적용하는 방법에 대해 설명합니다. 자극에 의한 변화는 자극을 대뇌 피질에서 RTMS에 의한 변화를 연구하기 위해 마이크로 양전자 방출 단층 촬영 (PET)와 mRNA의 마이크로 어레이를 사용하여 평가 하였다.

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프로토콜

동물을 사용하여 모든 절차를 검토하고 서울 대학교 병원의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 실험 설정

  1. 동물 준비
    1. 실험을 시작하기 전에 새로운 환경에 적응 수컷 흰쥐를 일주 허용.
      참고 : 8 주 된 쥐가 본 연구에 사용되었지만, 현상 또는 성인 뇌 연구의 가설에 따라 선택 될 수있다.
  2. 유도 흡입 마취
    1. 유도 5 % 각각 챔버와 노즈 콘 통해 60분의 40 % ~ 25 % / 75 % 산소 / 질소 중에서 용해한 이소 플루 란 2 %로 마취를 유지한다. 적절한 마취를 확인하기 위해 발가락 핀치에 페달 철수 반사를 폐지 수준으로 마취 깊이를 조정합니다.
      참고 : 일으키게 동물을 사용하여 번역 측면에서 더 나은 선택 일 수 있지만 RTMS와 t 동안 억제하는 어려움이있다 할 수 있습니다헤이 과도한 스트레스하는 경향이 있습니다.
    2. 직장 프로브 체온을 모니터링하고 항온 성 블랭킷 (homeothermic blanket)을 사용하여 37 ℃로 유지한다. 페달 철수 반사, 온도, 호흡과 심장 박동을 사용하여 마취 깊이를 모니터링합니다.
  3. 스위치 오버 유지 보수를 위해 정맥 마취에
    1. 알코올 면봉으로 꼬리를 준비합니다. IV 마취 (그림 1A) 전환을위한 24 게이지 정맥 카테터와 측면 꼬리 정맥에 카테 테르를 꽂다. 로드 프로포폴 정맥 (1 mg을 / [kg · 분] 분 10, 10 ㎎ / ㎖ 에멀젼 사용) 동물을. 프로포폴 로딩을 시작한 후 이소 플루 란 5 분을 중단.
    2. 이전의 연구 (16)에서와 같이 실험을하는 동안 700 μg의 / (kg · 분) - 500의 주입 속도 프로포폴 진정 작용을 유지한다. 코 콘을 통해 0.8 L / min으로 산소를 보충합니다.
      참고 : 프로포폴과 마취는 inhal에 의해 대뇌 피질의 흥분의 잠재적 인 억제를 줄이는 것입니다ATION 에이전트 17-19. 그러나 마취 RTMS 실험에서 강제되지 않고, 일으키게 동물도 사용될 수있다. 마취 방법 연구 가설을 고려하여 결정되어야한다.
    3. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의학 연고를 사용합니다.
    4. 자기 자극 (2 장 참조) 정맥 마취에 대한 완전한 전환 후 10 분을 적용합니다.
  4. 복구 조건
    1. 복구 단계에서 생체 신호를 모니터링합니다. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오. 동물이 수술을받은 경우 완전히 회복 될 때까지, 다른 동물의 회사에 반환하지 않습니다.
      주 : 질병 모델에 대한 수술을 수행하는 경우, 수술 - 후 통증 관리가 필요하다. 그러나, 통증 관리 RTMS는이 실험에 필요하지 않다.

2. 반복 경 두개 자기 자극

  1. 자극 코일
    1. 25mm의 그림-8 코일을 통해 이상성 자극을 제공하는 반복적 인 자극을 사용하여 자극을 적용합니다. 0.5 cm가 biauricular 라인의 정점에 측 방향 코일의 중심을 찾아 땅에 코일 45 °를 angulate.
      주 : 코일의 최대 자기장 세기가 자기 코일이 내장 홀더에 단단히 장착된다 T. 4.0이다.
  2. 모터 임계 값
    1. 코일의 중심에서, 핫 스폿에서의 모터 임계치 (MT)를 결정 0.5 cm가 biauricular 라인과의 두개골 상에 평평한 표면에 정점 측 방향 위치. 이는 이전의 연구 (20)에서 사용 된 동일한 방법론이다.
      참고 : 10 연속적인 자극에 의해 반대측 앞발에 5 개 이상의 만져서 수축을 불러 일으키는 최소한의 자극 강도로 MT를 정의합니다. 자극은 주로 일방적 인 자극을 보장하기 위해 반대쪽 근육 수축을 일으키는 지 여부를 확인합니다.
  3. RTMS의 응용 프로그램
    1. 깊은 마취의 안정화 후 RTMS 10 분을 적용합니다. 연구 질문에 따라 대뇌 피질에서 선택된 대상 RTMS 사이트에서 코일의 중심을 놓습니다. 그리고, 코일 중심 자극 점에서 두개골 표면과의 직접 접촉을 위해 상기 코일 기울.
      참고 : 예를 들어, 접지 angulate 코일 45는 반대측 피질 (도 1B 및 1C)의 RTMS의 전위 직접적인 영향을 최소화하기 위해.
    2. 일방적 반구의 20 분 RTMS의 세션에 동물을 대상. 소프트웨어 콘솔을 사용하여 저주파수 (1 Hz에서) 높은 주파수 (20 Hz로) 또는 가짜 자극 프로토콜 RTMS를 전달하고 (100)의 자극의 강도를 설정 - 이동 단말의 110 %.
    3. 휴식없이 1 Hz의 자극을 수행합니다. 소프트웨어 콘솔 입력 "20"분)은 "1200"탄을 사용. 20 Hz에서 자극의 경우, 28 다음 자극의 2 초를 실시나머지의 초. 소프트웨어 콘솔 입력 "20"분 "1600"탄을 사용.
    4. 가짜 자극의 경우, 덮개 뼈에 수직 코일 (90 ° 회전)를 기울이고 헤드 표면 (그림 1D)에서 2cm 떨어진 코일의 가장자리를 배치합니다. 장치 본체에 단단히 코일 홀더를 고정; 실험 기간 동안 수작업으로 상기 코일을 보유 할 필요가 없다.
      주 : 음향 및 다른 비 특정 효과를 보상하기 위해, 별개의 모의 프로토콜이 별개의 자극 프로토콜을 사용한다. 예를 들어, 1 Hz에서 허위 자극 1 Hz에서 RTMS 실험에 사용될 수있다.
  4. 코일 냉각
    1. 1- 및 20 Hz에서 자극 주파수 (도 2)에서 20 분 동안 반복 자기 자극을 가능하게하는 물 냉각 시스템을 사용한다. 코일 또는 자극의 온도가 모니터되지 않지만 과열을 방지하기 위하여 실험 기간 동안 코일의 전체 길이를 둘러싼 얼음 물 순환.
      참고 : 시판되는 냉각 코일 래트도 사용될 수있다.
    2. 가능하다면, RTMS 기계의 가열 게이지를 확인하여 상기 코일의 온도를 모니터링한다. 주 : RTMS 자극과 관련된 부정적인 결과가 없었다. 금속 귀 식별 태그는 자극 코일 근처에서 사용되는 경우에 잠재적 인 화상 위험 그러나있다.

3. 마이크로 양전자 방출 단층 촬영

  1. 동물 준비
    1. 유지 보수 (참조 단계 1.2.1과 1.3.1)에 대한 유도 및 정맥 마취에 대한 흡입 마취를 실시한다. 이동 단말의 100-110%의 자극 강도에서 10 분 동안 동물 1-Hz의 RTMS을 적용합니다.
    2. 다섯 분 RTMS 자극을 마친 후, 정맥 꼬리 정맥 카테터를 사용하여 생리 식염수 0.5 ㎖에 녹이고 2- [F-18] 플루오로 글루코오스 (18 FDG)의 1 mCi의 주입. 18 FDG 섭취 30 분을 허용합니다. 참고 : 전체 마이크로 PE 동안 마취에서 쥐를 놓습니다T 실험.
  2. 이미지 분석
    1. 자극의 unilaterality을 재확인하기 위해 뇌 영상에 대한 PET 스캐너를 사용합니다. 3-D 반복 알고리즘과 이미지를 재구성. RTMS에 의한 신진 대사의 변화를 평가하기 위해, 가로 뇌 부분 (21)의 이미지에 관심 (로아)의 영역을 식별합니다.
  3. 안락사
    1. 마이크로 PET 이미징을 수행 한 후, 래트를 깊게 마취 동안 이산화탄소 채워져 챔버에서 래트를 안락사.

4. mRNA의 마이크로 어레이

  1. 안락사
    1. 유도 5 % 각각 챔버와 노즈 콘 통해 60분의 40 % ~ 25 % / 75 % 산소 / 질소 중에서 용해한 이소 플루 란 2 %로 마취를 유지한다. 참수되기 전에 발가락 핀치에 페달 철수 반사를 폐지 수준으로 깊이 마취.
    2. 1-Hz에서 RTMS 1 세션 후 안락사 5 분 동안 쥐 목을 벨.
  2. 조직 수확
    1. 접힌 된 종이 수건, 뼈 rongeur, microscissors, 큰 수술 가위하는 microforcep, 호 10 또는 11 메스 블레이드, 얼음으로 가득 뚜껑 10 cm 유리 페트리 접시를 포함하여, 사용의 순서로 재료 및 수술 도구를 배치 1.5 ㎖의 튜브. 시체의 처리를 위해 비닐 봉투를 준비합니다.
    2. 두개골 anterioposteriorly의 중간 선 피부 절개를합니다. 퉁명스럽게 수술 가위로 부드러운 조직과 주변 근육을 해부하고, 뼈 rongeur를 사용하여 두개골 뼈 조각을 제거합니다. 신속하게 두개골에서주의 깊게 신선한 뇌를 해부하다. 그런 다음, microforceps 및 microscissors를 사용하여 얼음에 누워. 얼음처럼 차가운 생리 식염수의 뇌 조직을 헹군다.
    3. 즉시 드라이 아이스로 뇌를 전송하고, 이후에 추가 처리 될 때까지 튜브에서 -80 ° C에서 보관합니다.
    4. 수확을하기 전에 뇌 조직을 해동.
    5. 뇌의 등쪽면을 위로 배치하고, 일에서 뇌 조직을 수확microforceps 및 microscissors를 사용하여 얼음에 (일차 운동 피질에서 핫 스폿 정도) 대뇌 피질을 imulated. 1.5 ML 튜브에서 수확 된 조직을 넣습니다.
  3. RNA 준비
    1. 용해 시약 (22)를 사용하여 조직 균질에서 총 RNA를 추출합니다. DNase의 소화 및 정리 절차 과정. RNA의 샘플 및 분취 량을 정량화하고 사용할 때까지 -80 ° C에 저장합니다.
    2. 품질 관리 (260)의 OD 비로, 겔 전기 영동을 변성하여 RNA 순도 및 완전성을 평가 : (280), 및 시판 분석기들을 분석한다.
  4. 라벨링 및 정제
    1. 증폭 비오틴 화 된 cRNA를 수득 시판 RNA 증폭 키트를 사용하여 총 RNA를 정제. 간단히, 리버스 전사 T7 올리고 (DT) 프라이머를 사용하여 cDNA를에 총 RNA의 550 NG를. 합성 및 시험 관내에서 두 번째 가닥의 cDNA를 전사하고 비오틴 - NTP로 레이블을 붙입니다.
    2. 끝까지 마음 후형 치수는, 분광 광도계를 사용하여 cDNA의 정량화.
  5. 하이브리드 및 데이터 내보내기 (23)
    1. mRNA 발현 분석을위한 식 beadchip를 사용합니다. 58 ° C에서 18 시간 - 16 각 쥐-12 발현 비드 배열에 표시된 750-NG의 cDNA 샘플을 혼성화. Cy3에 스트렙 타비 딘을 사용하여 어레이 신호 검출을 수행한다.
    2. 공 초점 스캐너 스캔 배열. 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어를 사용하여 배열 데이터 내보내기 처리 및 분석을 수행한다.

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결과

다섯 8 주령의 수컷 흰쥐는 MT 판정 별도 간 레이터 신뢰도 분석을 위해 사용 하였다. 근육 경련의 촉진을 사용하여, MTS는 두 개의 독립적 인 연구자들에 의해, 모든 쥐에서 얻을 수있는 각각 33.00 ± 4.21 % 최대 자극기 출력 (% MSO) 및 33.93 ± 0.88 % MSO로 측정 하였다. 개성 - 알트 바이어스는 -0.93이고, 계약의 95 % 한도는 7.26 %로 -9.13이었다.

(가짜 RTMS 그룹 N = 1 Hz의 RTMS 4, 및 N = 2) 여섯 8 주령 쥐 마이크로 PET 실험에서, ROI는 18 F-FDG의 섭취는 평균으로서 계산되었다 같은 이미지의 동측과 반대측 대뇌 피질 모두의 보정 후 NCI는 / CC. 반대편 영역에있는 방사능 동측의 영역에서 획득 된 데이터를 정규화하기위한 기준으로 사용하고, 미분 ...

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토론

본 연구의 주된 목적은 일방적 RTMS 동물 모델을 소개했다. 일방적 자극 RTMS 인간 연구의 가장 중요한 특징 중 하나이지만, 대부분의 연구는 작은 동물을 채용하지 않았다. 112.5 %와 133.3 % MT 자극은 동측과 반대측 유럽 의회 의원을 생산하는 반면, 로텐 버그 등. 15, 20mm의 외부 로브 직경 8 자형 코일을 사용하여 100 % MT의 자극과 반대측 유럽 의회 의원을 기록했다. 큰 유도 전기장이 반대측 반구에 영향을 미칠 수 있기 때문 일 수 있습니다. 따라서, 우리의 연구는 코일이 더 측면으로 이동하고 일방적 인 자극을 강조하기 위해 틸팅하여이 이전 작업 15,24의 확장이다. 우리는 마이크로 PET는 RTMS 후의 자극 대뇌 피질에서 글루코스 대사 로컬 증가 (도 3) 계시를 확인하기 때문에 본 연구의 주된 목적은 달성되었다.

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

본 연구는 대한민국 정부연구재단 지원금(KRF-2008-313-E00458)의 지원을 받았습니다. 저자는 이진주에게 기술적 도움을 준 것에 대해 감사를 표한다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
직장 프로브가 있는 동종 담요Harvard 장치507222F
Isoflurane (Forane sol.)충화
프로포폴 (Provive Inj. 1% 20 ml)Claris Lifesciences
반복 자기 자극기 (Magstim Rapid2)Magstim Company Ltd
25 mm figure-of-8 coilMagstim Company Ltd1165-00
PET-CTGE Healthcare
QIAzol Lysis 시약Qiagen(미국 특허 번호 5,346,994)
RNeasy 지질 조직 미니 키트Qiagen74804
RNeasy Mini Spin ColumnsQiagen(Mat No. 1011708)
Agilent 2100 BioanalyzerAgilent Technologies
Ambion Illumina RNA 증폭 키트 Ambion
Nanodrop 분광 광도계NanoDropND-1000
Illumina RatRef-12 발현 BeadChipIllumina, Inc.
아머샴 플루오로링크 스트렙타비딘-Cy3GE 헬스케어 바이오사이언
스

참고문헌

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재인쇄 및 허가

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단측 rTMS쥐 뇌 자극8자형 코일수냉식 냉각 시스템운동 임계값 결정즉각 조기 유전자BDNF 발현포도당 대사반구 간 차이
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