방법 논문

VacuSIP, 개선 INEX 방법에 대한

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DOI:

10.3791/54221

⸱

2016년 8월 3일

 ,  ,  , 
1Department of Marine Ecology, Centre d’Estudis Avançats de Blanes (CEAB-CSIC), 2Department of Marine Biology and Oceanography, Institut de Ciències del Mar (ICM-CSIC), 3The School of Marine Science, Ruppin Academic Center

이 논문에서

요약

우리는 깨끗하고 정확한 물 샘플링을 위한 간단하고 비침습적이며 신뢰할 수 있는 방법인 VacuSIP를 소개합니다. 이 시스템은 미립자 및 용해된 화합물의 제거 및 배설을 깨끗하게 측정하기 위해 저서 현탁액 공급기가 현장에서 흡입 및 내쉬는 물을 동시에 수집하기 위해 개발 및 평가되었습니다.

초록

저서 서스펜션 피더는 해양 생태계의 기능에 필수적인 역할을 합니다. 많은 양의 물을 여과하고, 플랑크톤과 찌꺼기를 제거하고, 미립자 및 용해된 화합물을 배설함으로써 저서-원양 결합을 위한 중요한 매개체 역할을 합니다. 현탁 피더(예: 스폰지, 아시디안, 다모류, 이매패류)에 의해 제거 및 배설되는 화합물을 정확하게 측정하는 것은 이들의 생리학, 신진대사 및 섭식 생태학에 매우 중요하며, 이러한 유기체에 의해 매개되는 영양 플럭스의 생태학적 관련성을 결정하는 데 필수적입니다. 그러나 현탁액 공급기가 자연에서 미립자 및 용존 화합물을 처리하는 속도의 평가는 현재 사용 가능한 방법론의 한계에 의해 제한됩니다. 우리의 목표는 저서 서스펜션 피더의 현류 조리개와 같은 특정 지점에서 깨끗하고 제어된 물 샘플링을 현장에서 수행할 수 있는 간단하고 신뢰할 수 있으며 방해가 되지 않는 방법을 개발하는 것이었습니다. 우리의 방법은 맞춤형 매니퓰레이터 장치에 설치되고 샘플링된 유기체의 호기 구멍 내부에 조심스럽게 배치된 미세한 튜브를 사용하여 연구된 유기체의 흡입 및 내쉬는 물을 동시에 샘플링할 수 있습니다. 각 튜브의 말단 끝에 부착된 주사기 바늘로 수집 용기의 격막을 뚫으면 외부 압력이 샘플링된 물을 샘플링 튜브를 통해 용기로 천천히 밀어 넣을 수 있습니다. 느리고 제어된 샘플링 속도를 통해 물에 내재된 고르지 못한 부분을 통합하는 동시에 오염 없는 샘플링을 보장할 수 있습니다. 당사는 다양한 미립자 및 용존 화합물의 분석을 위한 가장 적합한 여과 장치, 수집 용기 및 저장 절차에 대한 권장 사항을 제공합니다. VacuSIP 시스템은 자연 조건에서 방해받지 않는 현탁 피더 대사를 정량화할 수 있는 신뢰할 수 있는 방법을 제공하며, 저렴하고 배우기 쉽고 다양한 생태계에서 필터 피더의 생리학 및 기능적 역할을 평가하기 위해 적용할 수 있습니다.

서론

저서 서스펜션 피더는 해양 생태계 (1)의 기능에 중요한 역할을한다. 물 2,3 대량 필터링함으로써, 그들은 제거하고 미립자 (플랑크톤과 암설) 및 (내부 및 참조) 용해 화합물 (1)을 배설 및 저서 - 원양 커플 링 4,5 영양 순환 6,7의 중요한 에이전트입니다. 정확하게 미립자 및 용해 화합물을 제거하고 (예 : 스폰지, 해초 강, 다모류 및 이매패 류 등) 저서 서스펜션 피더에 의해 배설을 측정하는 그들의 생리, 대사, 및 공급 생태를 이해하는 것이 필수적입니다. 함께 속도 측정을 펌핑하여, 또한 이러한 유기체 수질뿐 아니라 생태계 규모 과정에서 자신의 생태 영향에 의해 매개되는 영양소 플럭스의 정량화 할 수있다.

제거 및 생산 입자의 속도와 용해 닷컴을 측정하는 적절한 방법을 선택서스펜션 필터 피더에 의해 파운드는 먹이 활동 (8)에 관한 신뢰할 수있는 데이터를 얻기 위해 매우 중요하다. Riisgård 등 부적절한 방법 바이어스 결과가 지적한 바와 같이, 실험 조건을 왜곡 섭취와 특정 물질의 배설의 잘못된 추정을 생산,이 미생물에 의해 처리 된 영양 플럭스의 잘못된 정량화 될 수 있습니다.

두 가지 가장 자주 사용되는 방법은 배양 (간접 기술) 또는 주위의 동시 수집 및 호기 물 (직접 기술)를 포함하는 필터 피더의 입자 용해 영양 플럭스를 측정합니다. 배양 방법은 배양 물에 미립자의 농도로 용해 영양소의 변화율을 측정하고, 적절한 제어 8에 비해, 생산 제거 속도를 추정에 기초한다. 그러나, 배양 챔버에서 생물을 둘러싸는 자사의 feedin을 변경할 수 있습니다g 인해 및 / 또는 식품 농도, 또는 때문에 배설 배양 물 7,9의 화합물 (참고 문헌 내부)의 축적 산소의 감소로 인해 자연스러운 흐름 정권의 변화에 행동을 펌핑. 협착 및 변형 물 공급의 효과에 더하여, 배양 기술이 중요한 바이어스 재 여과 효과 (예 10 참조)로부터 유래한다. 이 방법론의 문제 중 일부가 배양 용기 (11)의 오른쪽 체적 형상을 사용하거나 반응계 12 재순환 벨자 시스템의 도입으로 극복되었지만,이 기술은 종종 분리 및 생산 속도를 과소. 이러한 용존 유기 질소 (DON)과 탄소 (DOC) 또는 무기 영양소로 용해 화합물의 신진 대사를 정량화, 배양 기술 (13)에 의해 발생하는 편견에 특히 발생하기 쉬운 것으로 입증되었습니다.

60 년대 후반과 70 년대 초반, 헨리 Reiswig에서9,14,15 별도로 현장에서 미생물에 의해 흡입과 호기 물을 샘플링하여, 거대한 카리브해 스폰지에 의해 입자 제거를 정량화하기 위해 직접 기술의 응용 프로그램을 개척했다. 작은 현탁액 공급기에보다 어려운 조건 중 Reiswig의 기술을 적용하는 어려움으로 인해,이 분야에 대한 연구의 대부분은 주로 간접 배양 기법을 이용한 16 (시험 관내) 실험실로 제한 하였다. 야헬와 동료들은 작은 규모의 환경에서 작업 할 현장 기술에 Reiswig의 직접적인을 튼튼. 그들의 방법은 INEX (16)라고, 방해받지 생물에 의해 (예) (에서) 흡입과 호기 물을 동시에 수중 샘플링을 기반으로합니다. 샘플 쌍 (INEX) 사이의 물질 (예를 들면, 박테리아)의 다양한 농도는 동물에 의한 물질의 보존 (또는 제조)의 측정치를 제공한다. INEX 기술은 개방형 튜브를 고용하고수동적으로 수집 튜브로 주변의 물을 대체 연구 유기체의 펌핑 활동에 의해 생성 된 excurrent 제트에 의존한다. 야헬 및 동료가 성공적으로 15 개 이상의 서로 다른 서스펜션의 연구에이 기술을 적용하고 있지만 분류군을 피더 (예를 들어, 17), 메소드가 일부 excurrent 오리피스의 소문자 크기에 의해, 필요한 연습과 경험의 높은 수준에 의해 제한되고,로 바다의 조건.

이러한 장애를 극복하기 위해, 우리는 예약 튜브를 통해 상기 샘플링 된 물 흡입 조절 (외경 <1.6 mm)에 기초하여 대안적인 기술을 발전시켰다. 우리의 목표는 저서 서스펜션 피더의 excurrent 구멍으로 깨끗하고 아주 특정 지점에서 현장 물 샘플링 제어 허용 단순하고 안정적이며 저렴한 장치를 만드는 것이 었습니다. 효과적이기 위해서는, 상기 방법은 주위의 유동 체제 영향 또는 B를 수정하지 않도록 비 간섭이어야연구 된 생물의 ehavior. 여기에 제시된 장치 VacuSIP 불린다. 그것은 야헬 동부 등에 의해 개발 된 SIP 시스템의 단순화이다. 깊은 바다에서 ROV 기반 포인트 샘플링 (2007) 18. VacuSIP은 원래 SIP보다 훨씬 저렴하고는 스쿠버 기반 작업에 적용되고있다. 이 시스템은 실험실 설정에 대한 라이트와 스티븐스 (1978) 19 Møhlenberg 및 Riisgård (1978) (20)에 의해 제공되고 시험 원칙에 따라 설계되었습니다.

VacuSIP 시스템 저서 현탁액 공급기의 대사 반응계의 연구를 위해 설계되었지만, 또한 실험 연구에 이용 될 수 있고, 제어 깨끗 포인트 소스 물 샘플 목적지가 요구된다. 현장 filtrations 또는 장기간 (최소 시간)에 걸쳐 통합이 필요한 경우 시스템이 특히 유용합니다. VacuSIP 2011 년 이후 야헬 실험실에서 성공적으로 사용하고, 또한이되었습니다카리브해와 지중해 스폰지 종 (21)에 의해 매개 영양 플럭스의 두 최근 연구에 사용 된 (Morganti 등. 제출).

VacuSIP이 적용되는 특정 샘플러 장기간 샘플링 기간, 현장 조건의 사용은, 수집, 필터링하고 민감한 분석을위한 샘플을 저장하기위한 표준 프로토콜 해양 다소 차이를 수반한다. VacuSIP 시스템 또는 수집 후에 세균 활성에 의해 샘플링 물의 변형의 위험에 의한 오염의 위험을 줄이기 위해, 반응계 여과 및 저장 과정에서 각종 시험. 다른 여과 장치, 수집 용기 및 저장 절차 용존 무기 (PO 4 3-, NO X - NH 4 +, 그런가 4)의 분석에 가장 적합한 기술을 달성하기 위해 조사하고, 유기 (DOC + DON)를 화합물 및 초 플랑크톤 (<1081; m) 및 입자상 유기 (POC + PON) 샘플링. 또, 특히 현장 조건 하에서, 오염의 위험을 최소화하기 위해, 처리 공정 수를 최소한으로 감소시켰다. 상기 방법은 제시되는 영상 포맷은 재현성을 용이하고 효율적으로하는 기술을 적용하는데 필요한 시간을 단축하도록 배향된다.

시스템 개요

2mm 작게 exhalant 오리피스와 서스펜션 피더에서 현장 펌핑 물 샘플, 각 시편의 펌핑 활동은 첫째 옆에 흡입 구멍 (들)과 excurrent 개구 (16)로부터의 흐름을 관찰에 형광 염색 해수를 여과 해제하여 가시화 (18 2B 그림도 참조). 연구 표본 (된 유입 및 excurrent)에 의해 흡입과 호기 물은 동시에 맞춤형 조작에 설치된 분 튜브의 한 쌍의 사용으로 또는 "아칸소의 두에 샘플링거꾸로 유연한 휴대용 삼각대의 MS "(그림 1 및 보충 비디오 1). 연구 유기체에 의해 흡입 물은 조심스럽게 내부 또는 연구 유기체의 흡입 구멍 근처에 하나 관의 기단부의 위치에 의해 수집된다. 동일한를 튜브는 다음 excurrent 구멍 안쪽에 위치한다.이 작업은 퇴적물 재 부유하여 예를 들어, 연락처 또는 동물의 방해를 피하기 위해 잘 관리해야합니다. 샘플링을 시작하려면, 다이버가 부착 된 주사기 바늘로 수집 용기에 격벽을 관통 샘플링 튜브를 통해 용기에 샘플링 된 물을 강제로 외부 수압 있도록 각각의 튜브의 말단부. 흡입 나란히 바이알에서 생성 된 진공에 의해 외부의 물과 배기 샘플 컨테이너의 압력 차에 의해 개시 .

호기의 물을 깨끗한 수집을 보장하고 AMBI의 실수로 흡입을 방지하기 위해엔트 물 (16)은 물 샘플링 레이트는 excurrent 유량보다 현저하게 낮은 비율 (<10 %)로 유지 될 필요가있다. 흡입 속도는 상기 튜브의 길이와 내경 (ID)에 의해 제어된다. 작은 내경도 무시할 죽은 볼륨 (<튜브의 미터 당 200 μL)을 보장한다. 장기간 (시간 분)에 걸쳐 샘플링이 가능 관심의 대부분 물질의 고유 patchiness를 통합 할 수 있습니다. 샘플을 적절하게 실험실로 운송뿐만 아니라 장시간 수중 샘플링 세션에서 유지되는 것을 보장하기 위해 현장 여과에 민감한 분석하는 것이 좋습니다. 샘플링 용기, 여과 어셈블리 및 튜브의 선택은 연구 생물 및 특정 연구 문제에 의해 결정된다. 아래에서 설명하는 프로토콜은 전체 신진 대사 프로필 (개요는 그림 2 참조) 관심이 있다고 가정합니다. 그러나, 프로토콜의 모듈 특성은 F 허용또는 쉽게 수정은 단순 또는 매우 다른 샘플링 방식을 수용한다. 전체 대사 프로파일 샘플링 프로토콜은 다음 단계를 포함한다 : (1) 유동 가시화하는 단계; (2) 샘플링 초 플랑크톤의 먹이 (플랑크톤 <10 μm의); (3) (인라인 필터를 사용하여) 무기 영양소의 흡수와 배설을 샘플링; (4) 샘플링 유기 흡수와 배설을 용해 (인라인 필터를 사용) (5) 미립자 공급 및 배설 (인라인 필터를 사용) (6) 2 단계를 반복합니다 (품질 검사 등 매우 플랑크톤 먹이); (7) 시각화 흐름.

논리적으로 가능한, 그 대사 프로파일 측정 속도 펌프와 결합되는 것이되는 경우 (예를 들면, 염료 프론트 속도에있어서, 16)뿐만 아니라, 호흡 측정과. 이러한 측정은 최고의 샘플링 세션의 시작과 끝에서 수행된다. 호흡 측정, 수중 optodes 또는 마이크로 전극이 바람직하다.

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프로토콜

1. 준비 단계 및 청소 절차

  1. 세척제
    1. 항상 보호 장비, 실험실 코트, 장갑을 착용 할 것. 먼지와 연기없는 깨끗한 공간에서 이러한 준비 단계를 수행합니다.
    2. 신선한, 높은 품질, 두 번 증류수로 5 ~ 10 % 염산 (HCL) 솔루션을 준비합니다.
    3. 5 %를 음이온 및 비 이온 계면 활성제 용액의 높은 가용성 기본 혼합 조제 신선한 고품질 이중 증류수 (자재 목록 참조).
    4. 청소의 모든 솔루션을 보관, 산 용기를 세척 하였다.
  2. 준비 단계 및 (실험실) 청소 절차
    주 : 인 화합물 관심없는 경우, 염산 세척 고품질 인산 (H 3 PO 4) 세척 (8 % H 3 PO 4 최종 농도)에 의해 대체 될 수있다.
    1. 항상 보호 장비, 실험실 코트, 장갑을 착용 할 것.
    2. 빨래고순도의 물 충분한 량 (인라인 스테인리스 Swinney 필터 홀더를 제외) 샘플링 장치. 밤새 5 ~ 10 % HCl 용액에 몸을 담근 장치를 둡니다. 고품질 증​​류수 충분한 양 장치를 다시 씻어.
    3. 고순도의 물을 충분한 양의 인 - 라인 스테인레스 스틸 Swinney 필터 홀더를 씻으십시오. 밤새 5 %에​​ 음이온 성 및 비이 온성 계면 활성제 용액의 높은 가용성 기본 믹스를 몸으로 필터 홀더를 남겨주세요. 충분한 고품질의 이중 증류수로 다시 씻어.
    4. 모든 샘플링 장치를 건조 알루미늄 호일을 포장하고 사용할 때까지 깨끗한 상자에 보관합니다.
  3. 흡입 속도 제어
    1. 길이 및 계획된 작업 깊이 수온에 따른 흡입 호스의 내경을 조정함으로써 샘플링 레이트를 제어한다. 완전 (STABLE)에 사용되는 푸 아죄 유의 법칙으로부터 유도 된 다음 식 (사용가이드로 oped 층류 파이프 흐름) : figure-protocol-1 여기서 F = 유량 (cm 3 분 -1), ΔP는 = 차압 (바), R = 입구 내부 반경을 튜브 (cm), K = 2.417 × 10 -9 (초 -2), L = 관의 길이 (cm ), V = 물 점도 (g의 cm -1 초 -1). 자세한 내용은 표 1을 참조하십시오.
    2. 연구 된 동물의 펌핑 률 1 % 미만의 샘플링 레이트를 유지한다.
      참고 : 알 수없는 진공 때때로, 진공 용기를 사용하여 추가 합병증을 포즈. 따라서, 필드 테스트는 것이 좋습니다. 10m 깊이 ~ 22 ° C 해수 (40 PSU)에서 254 μm의 내부 직경 50cm 입구 튜브는 26 μl의 초 -1 (-1 1.56 ml의 분) ~의 평균 흡입 속도를 제공합니다.
  4. 샘플링 용기
    1. 소량의 샘플 (3-20 ml를, 예를 들어, 흐름 CYT에 대한 초 플랑크톤에 대한ometry)는 사전에 진공 멸균 플라스틱 튜브를 사용합니다.
      참고 : 사전 진공 멸균 플라스틱 튜브는 일상적으로 인간의 표준 혈액 검사를 위해 사용된다; 자연산 멸균 튜브를 사용해야합니다. 이러한 진공 멸균 플라스틱 튜브가 가장 중심에서 벗어난 루어 멸균, 일회용 튜브 홀더를 이용하여 샘​​플링된다. 이것은 가장 안전하고 효율적인 샘플링 장치이지만, 단순한 바늘에 비해 약간 더 큰 데드 볼륨을 갖는다.
    2. 이러한 영양분과 용존 유기물과 같은 큰 물 샘플의 경우, 휘발성 유기 분석을위한 환경 보호국 (EPA) 기준을 충족하는 40 또는 60 ml의 유리 병을 사용합니다. 이 병은 PTFE 직면 실리콘 격막과 폴리 프로필렌 캡을 포함한다.
    3. 더 큰 볼륨의 경우, 고무 마개 또는 진공 플라스크와 페니실린 병을 사용합니다.
    4. 실리카 샘플 고밀도 폴리에틸렌 병 (HDPE 튜브)를 사용합니다.
    5. 샘플 량을 증가시키고, 상기 스토퍼 빠지의 위험을 감소시키기등반 중, 진공 펌프와 잠수하기 전에 (진공) 항목을 1.4.2-1.4.4 대피. 진공 수동 핸드 진공 펌프 또는 주사기로 공기를 흡입하여를 이용하여. 그러나, 최상의 결과를 위해, 좋은 진공 펌프를 권장합니다. 표준 lyophilizers 높은 진공을 제공합니다.
      참고 : 빠른 초기 흡입 속도가 호기 물 샘플을 오염하지 않을 것이라고 보장하기 위해 대형 진공 플라스크를 사용하는 경우 특별한주의를 기울이십시오.
  5. 선박 청소 절차
    1. 용존 유기물 및 NH 4 + 분석을 위해, 새로운 사전 청소 EPA의 튜브를 사용합니다.
    2. 다음과 같은 다른 영양소의 분석을위한 유리 병 (유리 및 HDPE)을 씻어 :
      1. 유리 병 (유리 및 HDPE)과 높은 품질을 두 번 증류수로 폴리 프로필렌 캡을 씻어. 새로운 실리콘 격막을 설치합니다.
      2. 최소 3 일 동안 염산의 10 %에 병 (유리 및 HDPE)을 만끽하고 풍부한 고품질의 이중 증류수로 헹군다.
      3. 4 시간 동안 450 ℃에서 유리 병을 연소 노에 냉각 할 수 있습니다. 뚜껑을 설치하고 사용할 때까지 알루미늄 호일에 포장.
  6. 필터
    1. (예를 들어, DOC, DON) 모든 용존 유기 시료의 여과하고 (예를 들어, POC, PON) 입자상 유기물의 수집 바인더가없는 유리 섬유 필터를 사용합니다. 별도의 알루미늄 호일 봉투에 각각의 유리 필터를 포장하십시오. 사용할 때까지 깨끗하고 건조한 용기에 유기 잔류 물 및 저장소를 휘발 2 시간 동안 400 ℃에서 연소.
    2. 무기 양분을 샘플링하는 바인더없는 상기와 같은 유리 섬유 필터는 0.2 ㎛의 폴리 카보네이트 멤브레인을 사용 (예, PO 4 3-, NO X - NH 4 +). 없다 (1.7.3) 아래에 설명 된대로 한 번 필터 홀더에 설치된 후자를 청소합니다.
    3. 실리카 샘플링 0.2 μm의 폴리 카보네이트 멤브레인 필터를 사용합니다. 한 번 installe을 청소필터 홀더 D는 (1.7.3) 아래에 설명했다.
  7. 여과 조립체의 제조
    1. 여과 조립체를 세정하도록 사용 전에 0.2 ㎛의 필터를 통해, 음이온 및 비 이온 계면 활성제 용액 및 고품질 증​​류수의 높은 용해성 염기성 믹스 필터.
    2. 영양분과 실리카 이외의 용존 유기물에 대한 여과 어셈블리 :
      1. 세정 인라인 스테인레스 스틸 Swinney 필터 홀더 내부 연소 바인더가없는 유리 섬유 필터를 배치합니다.
      2. 전체 어셈블리를 통해 음이온 및 비 이온 계면 활성제 용액을 5 %의 높은 용해성 염기성 혼합물을 100 ml의 고품질 이중 후 증류수 100 ㎖를 실행하는 산 세척 주사기를 사용한다.
    3. 그런가 4 여과 어셈블리 :
      1. 세정 폴리 카보네이트 필터 홀더 (PC 필터 홀더) 내부의 폴리 카보네이트 필터를 놓습니다.
      2. 연구에 산 세척 주사기를 사용하여UN 5 % 염산 30ml의 전체 조립체를 통해 높은 품질의 증류수 30 ㎖.
  8. 시스템 조립
    1. 1.6 mm의 외부 직경 (OD) 254 μm의 또는 177 μm의 내경 (ID)와 PEEK (폴리 에테르 에테르 케톤) 튜브를 사용하여 수중 작업을 위해 시스템을 조립합니다.
    2. 필요한 길이로 튜브를 잘라 날카로운 칼 또는 PEEK 커터를 사용합니다.
    3. 선단 (샘플 용기 측)에서 주사기 바늘에 부착 된 수형 루어 커넥터의 각 튜브를 장착한다. 제조업체의 지시를 따라 그린 너트를 조이기 전에 튜브의 끝에 파란색 플랜지가 페룰의 평평한면을 정렬해야합니다.
    4. 절연 테이프를 사용하여 삼각대 "팔"또는 맞춤형 조작에 PEEK 튜브를 연결합니다.
    5. 남성 루어 커넥터에 일회용 주사기 바늘을 연결합니다. 부상을 방지하기 위해 자사의 보호 캡과 바늘을 유지합니다.
    6. 분명히 샘플링 장비와 색상 코드 레이블을 모든 흡입과 호기 구성 요소 (예를 들어, = 녹색에서 빨간색 = 예).
    7. 마찬가지로 컬러 코드는 한 쌍의 샘플링 용기 세트와 샘플링 용기는 순차적으로 번호.

2. 작업 중

  1. 작업 현장 준비
    1. 예비 조사 및 표본의 선택
      참고 : 인해 수중 샘플링 프로토콜의 복잡한 특성으로 효율적인 샘플링 다이빙을 보장 준비에 필요한 시간을 할애.
      1. 작업 사이트를 조사하고 사전에 필요한 준비를한다.
      2. 선택하고 비교적 쉽게 액세스 할 수있는 적합한 대상 생물을 표시합니다. 모든 생물이 반드시 샘플링 다이빙시에 활성화 될 수 있기 때문에, 당신은 샘플 예상 한 것보다 더 많은 워크 스테이션을 준비합니다.
    2. 기본 지원 설치
      1. WHEn은 수평 기판 작업 :
        1. 1kg 다이빙 무게에 유연한 삼각대의 원래 빠른 릴리스 클립을 장착하고 간단하게 다음 대상 동물에 그것을 놓습니다.
      2. 수직 벽에 작업 할 때 :
        1. 작업 현장 준비 단계 (2.1.1) 동안 트레이를 들고 수집 용기에 대한 마운트베이스지지 상기 VacuSIP 시스템에 대한 접시, 액세서리 기어 후크 및 옷걸이.
        2. 가요 휴대용 삼각대를 사용하는 경우, 각각의 타겟 동물 옆에 10 × 10 cm에서의 PVC 판을 고정하는 볼트 이성 에폭시 수지를 사용한다. 각 판은 유연한 휴대용 삼각대의 빠른 릴리스 클립을 연결하는 구멍을 가질 필요가있다.
        3. 수지가 경화하고,베이스 플레이트 단단 벽에 부착되면, VacuSIP 시스템가요 휴대용 삼각대 확고한 부착 포인트로서, 퀵 릴리스 클립에 나사.
  2. 버지니아 설치CUSIP
    1. 시편은 흡입 구멍 옆에 필터링 된 형광 염료를 해제하여 펌핑되어 있는지 여부를 확인하고 야헬 등의 설명에 따라 염료가 exhalent 오리피스를 통해 신흥되어 있는지 확인합니다. (2005) 16.
    2. VacuSIP 장치를 설치하고 (5 ~ 내 mm)에 바로 옆에 흡입 구멍 내에서 흡입 (IN) 샘플링 튜브를 배치하거나. 흡입 튜브가 다른 exhalant 구멍의 근접하지 있는지 확인합니다.
    3. 조심스럽게 osculum / exhalant 폰쪽으로 exhalant (EX) 샘플링 튜브를 지시하고는 osculum / exhalant 폰 (그림 1 및 보충 비디오 1 참조) 내부 1-5mm를 위치 할 때까지 아주 부드럽게, 그것을에 삽입합니다. 와 접촉하거나 샘플링 된 생물을 방해하지 않도록 상당한주의를 기울입니다.
    4. 이전과 샘플링 동안 모두 튜브의 위치를​​ 다시 확인.
    5. 샘플링 검사 후 시편은 여전히​​ 데스로 펌핑되어 있는지 여부위 (2.2.1) cribed.
      참고 : 발생할 수있는 다른를 조작 할 때 삼각대의 한 팔의 움직임은, 첫째로보다 정확한 조작을 필요로 흡입 샘플링 튜브와 둘째 exhalant 튜브를 배치해야합니다 때문입니다. exha​​lant 샘플링 튜브의 조작은 흡입 튜브의 이동을 유발할 수 있더라도,이 순서에 따라, 상기 샘플링에 영향을 미치지 않을 것이다.
  3. 모듈 중 샘플링 절차
    주 : 연구 문제의 대기는 아래의 실험 단계들 각각은 독립적 인 실험으로 수행 될 수있다. 아래에 설명 된 전체 신진 대사 프로필 샘플링 프로토콜이 표본 당 8 시간까지 필요로 긴 과정이다 (개요는 그림 2 및 표 2 참조). 다이빙 조건 및 규정 샘플링 사이트, 지역 및 기관이 서로 다른 것처럼, 다이빙 계획은이 프로토콜에 포함되지 않습니다. 그럼에도 불구하고 극도의주의와 경제 산업 성을 헌신다이빙 계획 culous 계획. 채도와 요요 다이빙 프로파일을 피하기 위해 특별한주의를 기울이십시오. 가능하면, 이러한 실험 얕은 깊이에서 (<10m)를 수행하는 것이 좋습니다. 폐쇄 회로 리브 리더는 장기간의 샘플링 방식에 매우 유용 할 수 있습니다.
    1. 실제 샘플링을 시작하기 전에, 형광 잔류의 눈에 보이는 흔적이 남아 그 부유 퇴적물이 정착 된 또는 멀리 표류했는지 확인하십시오.
    2. 울트라 플랑크톤은 (어떤 필터가이 단계에서 설치되지 않습니다!)
      1. (호기)를 IN (흡입)와 EX 멸균 플라스틱 튜브 격막을 진공 청소기로 청소를 관통하는 바늘을 사용합니다. 물이 계획된 속도에 떨어지는되어 있는지 확인하고 2-6 ml의 물 샘플을 수집합니다.
      2. 검색에서 얼음에 찬 상자에 샘플을 유지합니다. 실험실에서, 1 + 0.05 % % 파라 포름 알데히드 EM 등급 글루 타르 알데히드 (최종 농도) 0.2 % EM 등급 글루 타르 알데하이드로 유지합니다. -80에서 액체 질소와 저장소에 크리오 바이알 (cryovial)를 고정# 176; 분석까지 C.
    3. 규산 샘플링 및 저장
      1. 바늘 튜브의 원위 단부에 루어 수 커넥터 사이에 0.2 ㎛의 폴리 카보네이트 막을 포함하는 사전 세정 인라인 스테인레스 PC 필터 홀더를 설치한다.
      2. 피어스 예비 세정 고밀도 폴리에틸렌 튜브 (HDPE 바이알)의 격벽 캡 샘플링을 시작한다. 모두 샘플러가 떨어지는 것을 확인하고 각 유리 병에 물 15 ㎖의를 수집합니다.
      3. 분석 할 때까지 냉장 시료 (4 °에 C)를 유지합니다. 분석은 -20 ℃에서 2 주 저장소 내에 시작할 수없는 경우. 분석을 위해 샘플이 실리카 겔을 용해 적어도 50 분 동안 50 ℃에서 해동되어 있는지 확인합니다.
        주 : 필요에 따라 막을 현미경 또는 DNA 분석을 위해 보존 할 수 있습니다.
    4. 용존 무기물 (PO 4 3-, NO X -, NH 4 +)
      1. t를 교체사전 연소 유리 필터를 포함하는 사전 - 세정 - 라인 스테인레스 스틸 필터 홀더와 그 PC 필터 조립체.
      2. 샘플링 전에 해수 시료의 20 ml의 흡인을 시작 EPA, HDPE 튜브 또는 다른 진공 용기를 이용하여 전체 여과 시스템을 통과되었는지 확인. 그들이 폐기되기 전에 수집 된 물의 부피를 측정한다.
      3. 피어스, 샘플링을 시작 두 샘플러가 떨어지는 것을 확인하고 질산염 및 인산염 분석을 위해 25 ~ 30 ml의를 수집 할 수있는 적절한 EPA 유리 병의 격막 캡.
      4. 암모니아 분석을위한 새로운 EPA 유리 병으로 전환 모두 샘플러가 떨어지는 것을 확인하고 각 바이알에 20 ㎖를 수집합니다.
      5. 분석 할 때까지 -20 ° C에서 얼음 저장에 찬 상자에 샘플을 보관하십시오.
        참고 : 여액 관심 있다면, 일회용 주사기 필터 단계 2.3.3 및 2.3.4를 위해 사용될 수있다.
    5. 용존 유기물 (DOC + DON) 샘플링과 일or 연산
      참고 : 그래서 그 샘플 물이 실리콘 격막과 접촉하지 않는 처리를 통해 같은 직립 가능한 샘플을 보관하십시오.
      1. 스테인레스 스틸 필터 조립체를 계속 사용하고 전술 한 바와 같이, 새로운 EPA 유리 바이알에 해수 20 ㎖ 시료 수집.
      2. 검색시, 얼음에 찬 상자에 샘플을 유지한다. 실험실에서, 오르토 인산과 샘플을 해결하기 위해 사전 연소 유리 파스퇴르 피펫을 사용하거나 염산 (20 ml의 샘플, 최종 농도 0.04 %로 25 %의 미량 금속 등급 산의 5-6 방울을 추가) (2 방울을 추가 미량 금속의 등급은 20 ml의 샘플, 최종 농도 0.1 %)에 산을 농축하고, 냉장 보관하십시오.
      3. 분석 할 때까지 냉장 시료 (4 °에 C)를 유지합니다. 시료는 분석 전까지 -20 ℃에서 수집 저장소 주일 이내에 분석을하지 않는 경우.
    6. 미립자 유기물 (POC, PON, POP)
      1. 보안 목표 명세서를 계속 사용스틸 필터 조립체 및 필터 배기 된 250 ml의 진공 플라스크에 넣고 해수 적어도 500 ml의 ainless. 필요한 경우 플라스크를 교체합니다.
      2. 검색에서, 필터 홀더에서 남아있는 모든 바닷물을 대피 알루미늄 호일에 포장하고 얼음에 냉각 박스에 저장 공기로 채워진 주사기를 사용합니다. 실험실에서, 필터 홀더로부터 필터를 분리하고 분석 때까지 -20 ℃에서 저장한다.

figure-protocol-2
그림 1. VacuSIP의 올바른 설치의 예 : 흡입과 호기 물 샘플 노란색 (사진 녹색 사용되는 색상 코드와 맞춤형 조작을 사용하여 멍게 Polycarpa의 mytiligera (아카바 만, 홍해)를 샘플링 (A) ) 톰 Shelizenger 및 Yuval 교수 Yacobi에 의해; (B) (NW 지중해 스폰지 Agelas의 oroides를 샘플링VacuSIP 장치를 이용하여 3mm의 osculum 폭 바다). 사용되는 색상 코드 호기 물 시료 흡입과 빨간색 노란색이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-protocol-3
프로토콜 절에 설명 된 기술 VacuSIP 2. 개요도. 실험실 작업이 노란색 상자에 표시됩니다, 파란색 상자의 현장입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-protocol-4
표 1. 전체 평균 샘플링 속도는 ML (분 -1) 다른 용기 얻어물 컬렉션과 다른 진공 레벨에 사용 : 플라스크가 (없음) 진공되지 않았다; EPA 유리 병 및 HDPE 튜브는 볼륨 (½ 볼륨)의 절반을 진공 청소기로 청소했다; 멸균 플라스틱 튜브는 이미 제조 업체에서 진공 청소기로 청소했다. 5-8 분 깊이 18 ~ 22 ° C의 물 온도에서 작업 79cm의 길이 및 25 μm의 내경 PEEK 튜브를 사용.

figure-protocol-5
표 2 샘플링 용기 고정 제, 인라인 필터 조립체 저장 개요 및 프로토콜 절에서 설명하는 분석 방법. 분석 된 화합물이다 : 초 플랑크톤 풍부 (플랑크톤 <10 μm의), 규산 (그런가 4), 인산 (PO 4 3-), 아질산염 + 질산염 (NO 2 - + NO 3 -), 용존 유기물 (DOM) 암모늄 (NH 4 +) 미립자 유기물(POM). 모든 샘플링 용기는 실리콘 격막 캡을 샘플링하기 전에 진공 청소기로 청소한다. 고정 제는 다음과 같습니다 파라 포름 알데히드 + 글루 타르 알데히드 (공급 과잉 + Parafor), 오르토 인산 (H 3 PO 4), 염산 (HCl을). 사용되는 인 - 라인 필터 조립체는 : 폴리 카보네이트 필터 홀더 및 폴리 카보네이트 막을 0.2 ㎛의 필터 (PC 필터 홀더 + PC 막) 및 스테인레스 스틸 필터 홀더 및 바인더가없는 유리 섬유 GFF 필터.

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결과

해수 수집 방법의 최적화

컬렉터 튜브 및 청소 절차의 선택

VacuSIP 호환 수집 용기 샘플링 주사기 바늘 관통에 의해 개시 될 수있는 격벽을 가져야한다. 그들은 높은 수중 압력 (수심 작업 일반적인 스쿠버에서 2-3 바)를 견딜 수 있어야하며 진공을 유지해야한다. 대부분 (전부는 아니지만 브랜드) 휘발성 유기물의 분석을 위해 EPA의 승인을 유리 병의 이러한 기준을 충족. DOC와 DON 분석을 위해 승인 된 사전 청소 유리 병도 사용할 수 있습니다. 수집 및 분석 영양 및 청소 절차를 최적화하는 이러한 병의 적합성을 테스트하기 위해, 높은 품질의 증류수가 산 청소 폴리 ...

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토론

준비 단계

DOM 및 영양 분석을 위해 수집 튜브

수집 용기 용해 마이크로 성분과 상호 작용할 수 있고, 샘플러 벽 성장 30-34, DOM 영양 컬렉션 상이한 바이알 테스트 한 세균에 대한 기판 일 수 있기 때문이다. 샘플 신속 (30) 냉동하지 않는 경우 유리 병은 최대 두 배 실리카의 초기 농도를 증가시킬 수 있기 때문에 붕 규산염은 실리카 정량화 33, 35 사용하지 않는 것이 좋습니다. 우리의 결과는 미리 청소 EPA 유리 병을 사용하면 특히 암모늄을위한, DOC, DON, 무기 영양소에 대한 낮은 농도의 공백을 초래 것을 보여줍니다.

DOC 여과 및 저장

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

우리는 현장에서 자신의 도움을 MANEL 리바 감사합니다. 우리는 우리의 연구 및 샘플링 권한 그들의 지원을위한 "파크 천연 델 Montgrì, 레 레스 메디아 나는 엘 Baix 테르"에 감사하고 있습니다. 수중 매니퓰레이터는 Ayelet Dadon-Pilosof에 의해 설계된 씨 Pilosof에 의해 제작 하였다. 이 작품은 스페인 정부 프로젝트 CSI-산호 [RC 및 MR에 허가 번호 CGL2013-43106-R]에 의해 TM에 "Ministerio 드 EDUCACION, Cultura y를 Deporte (MECD)"에서 FPU의 교제에 의해 지원되었다. 이 G. 야헬에 카탈로니아 정부 [허가 번호 2014SGR1029]와 ISF 부여 13분의 1,280 및 BSF 보조금 2,012,089에 의해 자금 해양 생지 화학의 기여와 글로벌 변화 연구 그룹입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
GorillaPod, 오리지널JobyGP000001유연한 휴대용 삼각대 
플랜지리스 페룰IDEX 건강 및 과학 P-200X1/16" 블루/pk
남성 너트IDEX 건강 & 과학P-205X 1/16" 그린/10  PK
여성에서 여성으로 LuerIDEX 건강 & 과학 P-658
암-수 LuerIDEX 건강 & 과학 P-655
Peek 튜빙 (254  &마이크로; m ID)IDEX 건강 및 과학 15311/16" 외경 x 0.01  ID x 5  피트 길이. 대체 ID를 사용할 수 있습니다.
2액형 수지 에폭시IVEGOR9257사용 전에 2액형 수지를 잘 혼합
(TOC) EPA 바이알Cole -Parmer03756-2040ml 유리 바이알. Thomas Scientific에서 제조했습니다(참조 번호 9711F09).
HDPE 바이알Wheaton986701 (E78620)20ml 고밀도 폴리에틸렌 바이알
Vacuette Z 첨가제 없음Greiner bio-one455001제조업체에 의한 사전 진공 
셉텀 샘플 병토마스 사이언티픽1755C01250 ml 유리병 
Septum Cap 1WheatonW240844SP (E7865R)22-400 
Septum Cap 2WheatonW240846 (1078-5553)24-400 유리병 및 병용. 또한 Thermo Scientific National에서 제조합니다(ref. 03-377-42).
인라인 스테인레스 스틸 Swinney 필터 홀더Pall516-9067직경 13 mm
PTFE 씰 워셔Pall 516-8064스테인리스 스틸 필터 홀더용
링 TCLP 유리 필터Pall 516-9126바인더가 없는 유리 섬유 필터, 13  직경의 mm, 기공 크기 0.7  &마이크로; m
폴리카보네이트 필터 홀더Cole -Parmer1729513 mm 직경의
Isopore 멤브레인 필터MilliporeGTTP0130013  직경의 mm, 기공 크기 0.2  &마이크로; m
Contrad 70 솔루션 Decon Labs1002음이온 및 비이온 계면활성제 용액의 고용해성 기본 혼합물 
멸균 주사기 필터VWR International Eurolab S.L.514-0061P25  직경의 mm, 기공 크기 0.2  &마이크로; m
플루오레세인시그마-알드리치(구 참조28802) 46955-100G100  g
Holdex, 일회용, 멸균Greiner bio-one450263멸균, 일회용 튜브 홀더, Vacuette 멸균 바늘용 오프센터 루어가 있는
IcoGammaPlus51600.7  mm x 30  mm
Cryovials NalgeneNalgeneV5007(Cat. No.5000-0020)2  ml
크라이오박스 카톤 루비라보르M-600145x145x55  mm p/마이크로튜브 1.5  ml
Orthophosphoric AcidSigma79617 또는 대안적으로 초순수 염산을 사용, 최종 콘서테이션 0.1%
ParaformaldehydeSigmaP6148500  g
글루타알데히드Merck8,206,031,00025%, 1 L
핸드 진공 펌프 Bü 알클 5620-2181 또는 표준 실험실 진공 펌프
하십시오HDPE 바이알용 를 사용하십시오.

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