방법 논문

사람 골수에서 분리 Mesangiogenic 전구 세포 (MPC와)

DOI:

10.3791/54225

⸱

2016년 7월 15일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical and Experimental Medicine, University of Pisa

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 인간 골수(hBM)에서 중배엽 전구 세포(MPC)를 분리하기 위한 최적화되고 재현성이 높은 프로토콜에 대해 설명합니다. MPC는 유세포 분석과 nestin 발현을 특징으로 했습니다. 그들은 혈관 형성 잠재력을 유지하면서 기하급수적으로 증가하는 MSC와 같은 세포 배양을 일으킬 수 있는 능력을 보여주었습니다.

초록

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임상 적용을 위해 인간 골수(hBM) 유래 중간엽 기질 세포(MSC)를 분리하기 위한 연구 연구에서 우리는 인간 혈청 보충 배지에서 성장을 위해 특별히 선택된 새로운 세포 집단을 확인했습니다. 이 세포는 MSC와 구별되는 형태학적, 표현형적, 분자적 특징을 특징으로 하며 우리는 이를 MPC(Mesodermal Progenitor Cells)라고 명명했습니다. MPC는 둥글고 두껍고 굴절률이 높은 코어 영역이 있습니다. 그들은 플라스틱에 대한 강한 트립신 저항성 부착을 보여줍니다. MPC를 직접 확장하지 못하면 사이클링 속도가 느리다는 사실이 밝혀졌습니다. 이것은 Ki-67 부정성에서도 시사하는 바와 같습니다. 반면에, MSC 확장을 위해 설계된 표준 배지에서 MPC를 배양하면 MSC 유사 세포 집단이 기하급수적으로 증가했습니다. 중간엽 분화 능력을 보여주는 것 외에도 MPC는 혈관 형성 잠재력을 유지하여 다중 계통 전구 특성을 확인했습니다. 여기에서는 유세포분석법(CD73, CD90, CD31 및 CD45), nestin 발현 및 F-actin 조직을 통해 hBM-MPC를 분리하고 특성화하기 위한 최적화된 재현성 높은 프로토콜에 대해 설명합니다. MPC의 중간발생 및 혈관생성 분화를 위한 프로토콜도 제공됩니다. 여기에서 우리는 또한 "Mesangiogenic Progenitor Cells"로 이름이 변경된 이러한 세포에 대한 보다 적절한 명명법을 제안합니다.

서론

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간엽 기질 세포 (MSC들)은 그들의 다중 계통 분화 능력과 성장 인자 / 사이토 카인을 분비 할뿐만 아니라 면역 조절 하나의 역할을하는 조혈을지지하는 그들의 능력에 대한 중요한 임상 적 가치가있다. MSC 기반 치료법 셀 생산 및 적용의 정의에서 의약품 (CBMP) 치료 3 계 전지의 안전성과 효능에 대해 특정 국제 규정에 특별한주의와 광범위한 임상 및 전임상 연구 (2)의 대상이되어왔다. 인간 중간 엽 줄기 세포는 태아 소 혈청 (FBS) 및 소 트립신으로 보충과 동물 기원의 시약을 포함하는 배지에서 광범위하게 배양. 따라서, 세포 조작과 관련된 감염 위험이 환자는 프리온에게 노출뿐만 아니라 단백질, 펩타이드 또는 동물 유래의 다른 생체 분자에 연결 면역 학적 위험에 직면 함께와 세포 수확 및 transplan 후 계속 수있는테이션 4.

이 문제를 회피하기 위해, 우리는 풀링 된 인간 AB 형 혈청 (PhABS)를 FBS를 대체​​ 인간 골수 (HBM) 동물 배지에서 유래 중간 엽 줄기 세포를 배양 하였다. 이러한 조건에서 중간 엽 줄기 세포 성장과 함께, 우리는 새로운 세포 집단을 확인 하였다. 이러한 세포 형태학 및 중간 엽 줄기 세포에서 표현형 달랐다 독특한 유전자 발현 프로파일과 특성 성장 / 접착 성을 나타내었다. 그들은 유지 모두 mesengenic 및 잠재적 인 혈관 신생 따라서 선정됐다 중배엽 전구 세포 (MPC와) 5. 다음으로, 우리는 순도 6 높은 등급의 MPC를 생성하도록 선택적 및 재현성 배양 조건을 정의 할 수 있었다.

우리는 더 MPC와의 형태 학적 및 생물학적 특성을 조사 하였다. 된 MPC는 자전거에 긍정적 - 네 스틴 느린 것으로 보여, 기-67 음성, 긴 텔로미어 5 특징 염색체와. 그들은 plur 표현ipotency 관련 전사는 요인 10 월 4, Nanog를하기보다는 MSC 마스터 조절기 Runx2와 Sox9 7. 중간 엽 마커 CD73, CD90, CD166이 부족한 상태에서 표현형, MPC와는 중간 엽 줄기 세포보다 낮은 수준에서 endoglin (CD105)를 표명했다. MPC와는 구체적으로 podosome 같은 구조 팔을 지탱 접착 PECAM (CD31)의 일관된 표현을 특징으로 분자 인테그린 αL (CD11a에), αM (CD11b를) αX (중 CD11c)과 인테그린 β2 (CD18)의 독특한 패턴을 보여 주었다 . 표준 MSC 확장 미디어에서 MPC와 신속 9 신호 Wnt5 / 칼 모듈 린 세포의 활성화를 갖춘 중간 단계를 통해 중간 엽 줄기 세포로 분화. 쥐의 세포 외 기질 (ECM) 단백질의 3 차원 문화 회전 타원체에서 새싹 할 수있는 능력에 의해 입증으로하여 MPC는 또한, 혈관 신생 속성을 유지했다. 혈관 신생 가능성은 빠르게 mesengenic 혈통을 따라 MPC 분화 후 끊어졌습니다.

여기에서 우리는 프로 제시tocols은 분리 및 HBM 혈액 샘플로부터 고도로 정제 된 MPC의 특성을 최적화. MPC의 mesengenic 및 혈관 분화 재현 프로토콜도 설명되어 있습니다.

프로토콜

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참고 : 서면 동의 후, HBM의 샘플 고관절 교체 정형 외과 수술 중 얻었다. 즉시 헤파린의 500 UI를 포함하는 20 ML의 주사기를 리밍 대퇴 경부 절골술 후 대퇴 전에, 새로운 BM을 흡인하는 데 사용되었다. 프로토콜은 BM 소스 널리 적용을 고려하여야한다.

사람 골수 단핵 세포의 1. 분리 (HBM-다국적 기업)

  1. 둘 베코 인산염 완충 식염수 (D-PBS)을인가 해, 50 ml의 신선한 BM 10 ㎖와 혼합하여 반전 - 5 희석. 마찬가지로, 두 개의 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 25 ml의 배포 각각의 튜브에 D-PBS 25 ml에 추가하고 반전으로 섞는다.
  2. 튜브를 용액으로부터 광물 뼈 조​​각의 분리 및 지방 들어, 실온에서 10 분간 방치한다.
  3. 조심스럽게 미네랄 뼈 조각 펠렛을 방해하지 않고 70 μm의 필터를 통해 멸균 파스퇴르 피펫 및 필터 세포 현탁액에 떠있는 지방을 제거합니다.
    4. <리> 불연속 밀도 구배 원심 분리 배지 15 ㎖ (1.077 g / ml)로 4 개의 50 ㎖ 튜브를 설정한다. 이 매체는 실온에 있는지 확인합니다.
  4. 밀도 구배 배지 위에서 희석 BM 25 ㎖의 - 부드럽게 20 누워. 혼합 층을 방지하기 위해 튜브 벽에 세포 현탁액의 물방울셔서,주의 깊게이 작업을 수행합니다.
  5. 비활성화 브레이크 실온에서 30 분 동안 400 XG에서 밀도 구배 원심 분리를 수행한다.
  6. 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 두 단계 사이에 위치하는 셀의 백탁 링 모아서 신선한 50 ㎖ 튜브에 옮긴다.
  7. 신선한 배지로 세포를 세척 : 페놀 레드가없는 저 글루코스 (1,000 ㎎ / ℓ) 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM), 10 % (v / v)로 풀링 된 인간 AB 형 혈청 (PhABS), 2 mM L- 글루타민 및 항생제 (DMEM / 10 % PhABS). 5 분 동안 400 XG에 원심 분리기.
  8. 신선한 DMEM 10 ㎖ / 10 % PhABS - 기음 뜨는 및 5 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
  9. 세포 수를 진행합니다.트리 판 1 희석 (1)에 의한 백혈구의 수를 결정한다. 혈구이 적용하고, 위상차 현미경 하에서 관찰한다. 셀 수에서 작은 완벽하게 둥근 적혈구와 블루 스테인드 죽은 세포를 제외합니다.
    주 : 매우 MPC 복구 성능을 위해 화면 PhABS 배치하는 것이 좋습니다. 다른 출처의 대부분의 혈청은 MSC와 같은 세포의 높은 비율과 MPC 문화 초래하면서 미국의 소스에서 PhABS 최상의 결과를 제공하고있다.

HBM-다국적 기업에서 MPC와의 2. 분리

  1. 신선한 DMEM / 10 % PhABS 15 ml의 소수성 T-75 플라스크를 설정하고 pH 및 온도는 30 분 동안, 5 % CO 2에서 37 ℃에서 미리 인큐베이션 평형하자.
  2. 시드 4 - 플라스크 당 6 × 10 7 HBM-다국적 기업과 48 시간 동안 5 % CO 2에서 37 ° C에서 품어.
  3. 기음과 플라스크에서 매체 및 비 부착 세포를 폐기합니다. 신선한 DMEM / 10 % PhABS의 15 ML을 추가하고 37 ° C에서 부화5 %의 CO 2. 매체마다 48 시간을 변경, 팔일 - 6 문화를 유지한다.
    OPTIONAL : MPC 수율을 높이기 위해 2.3에서 비 부착 성 세포는 새로운 배양 플라스크에 다시 도금 일차 배양 기술 한 바와 같이 유지 될 수있다.
  4. 대기음하고, 플라스크에서 배지를 버리고 신선한 DMEM으로 씻어 솔루션을 분리 동물 무료 프로테아제 2 ㎖를 추가합니다. 15 분 (장기간 배양을 방지) - (5) 37 ℃에서 인큐베이션.
  5. 5 분 동안 400 XG에 세포 현탁액을 원심 분리하고, 신선한 DMEM / 10 % PhABS 10ml의 추가 대기음
  6. 기음과 뜨는 버리고 1 펠렛을 다시 중단 - 신선한 DMEM 2 ㎖ / 10 % PhABS. 단계 1.10에 설명 된대로 세포 수를 진행합니다.
    참고 : 시약을 분리으로 트립신 / EDTA를 사용하지 마십시오. MPC와 내성 트립신된다. 배양의 형태 학적 검사는, 세포를 수확하기 전에 높은 방추형 MSC 유사 세포의 존재를 평가하기 위해 추천된다. MSC와 같은 세포의 경우에는 상당한 양의 D에있다etected는 선택적으로 오염 된 세포를 제거함으로써 세포 생성물의 순도를 증가시킨다. 이를 위해 트립신 소화 2 분 동안 트립신 2 ㎖ / EDTA 0.05 %를 첨가하여, MPC 수확하기 전에 수행 될 수있다. 워시 문화를 두 번 DMEM / 10 % PhABS 5 ㎖로, 다음과 같은 이상 치료를 프로테아제로 진행합니다.

3. 세포의 특성 분석

  1. 유동 세포 계측법
    1. 세척 용액 105 새롭게 분리 된 세포 시료의 중복 설정 : D-PBS 0.5 % (v / v)의 소 혈청 알부민 (BSA)과 0.02 % (w / v)의 아 지드 화 나트륨으로 보충. 5 분 동안 400 XG에 원심 분리기.
      주의 : 나트륨 아 지드 독성이다.
    2. 세척 용액을 200 μL의 펠릿을 다시 중지 및 항 CD90, 항 CD45, 항 CD73과 형광 염료 ( "TEST")에 접합 된 항 CD31 항체를 추가; 병렬 아이소 타입 컨트롤 ( "CTRL")을 설정합니다.
      참고 : 항체 염색의 금액이 적정 또는 코르에 의해 결정되어야한다제조업체의 지침에 땡.
    3. 30 분 동안 4 ° C에서 샘플을 품어.
    4. 5 분 동안 400 XG에 원심 분리기. 세정액 500 ㎕의 세포를 다시 일시 7 9 10 사이토 다색 흐름을 적어도 5 × 104의 이벤트를 취득.
    5. 도트 플롯으로 결과를 분석하고 사분면을 설정하는 "CTRL"기록 된 이벤트를 사용합니다.
      참고 : MPC 문화와 문화를 정의하기 위해 CD73 음수 CD90의 음수의 CD45 + CD31 + 세포의 비율이 95 % 이상이어야한다. 98 % - 일부 특정 애플리케이션의 경우, 즉, 유전자 발현 분석, 복구 차단 97로 증가되어야한다.
  2. 네 스틴 탐지 및 F - 굴지 조직 분석
    1. 문화 챔버 슬라이드 플레이트 갓 격리 된 MPC (20,000 / cm 2). 세포가 5 % CO 2, 37 ℃에서 하룻밤 배양하여 부착 할 수 있습니다.
    2. 세척 용액 Fi를에 세포를 씻으4 %의 X 15 분 동안 실온에서 (w / v)의 파라 포름 알데히드. 정착이, 세정액을 추가 2 분 동안 품어과 부어 제거합니다.
    3. 두 번 세척을 반복합니다.
    4. D-PBS에서 Permeabilize 하시려면 세포는 실온에서 15 분 동안 0.05 % (v / v) 트리톤 X-100을 보충.
    5. 단백질이없는 신호 인핸서 (RT에서 30 분) 또는 표준 블로킹 용액, 반응 정지 (D-PBS 3 %로 보충 (W / v)의 BSA).
    6. 솔루션을 차단 / 신호 증강을 제거합니다.
    7. 7 μg의 / ㎖를 추가 항 - 인간 스틴 차 항체 (V / w)와 가습 실에서 밤새 4 ° C에서 품어. 평행이 아닌 특정 형광 신호를 평가하는 제어 이소 타입 항체를 사용한다.
    8. D-PBS를 추가하여 슬라이드를 씻으, 2 분 동안 떠나 붓는다. 두 번 반복합니다.
    9. 2 μg의 / ㎖를 추가 형광 염료 복합 이차 항체 (V / w)와 어둠 속에서 1 시간 동안 4 ° C에서 품어.
    10. 워시는 위의 슬라이드.
    11. 형광 Phalloidin의 (5 UI / ㎖)를 추가, 30m RT에서 떠나그리고 어둠 속에서하는 D-PBS로 3 회 세척한다.
    12. 챔버 벽을 제거하고 핵을 검출 antifade 시약 4 ', 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI)로 보충 수성 장착 매체에 슬라이드 마운트. 7 9 10 이미징로 이동합니다.

MPC와의 4 Mesengenic 차별화

  1. 플레이트 (2) × 104 / ㎠ TC 처리 T75 배양 플라스크에서 갓 격리 된 MPC 세포는 5 % CO 2에서 37 ° C에 DMEM / 10 % PhABS 밤새 부착하자.
  2. 중간 엽 기질 세포 확장 (MSC-RS 매체) 용으로 설계된 표준 감소 혈청 배지, 약 200 μL / cm 2로 DMEM / 10 % PhABS를 교체합니다. 유도에서 7 ~​​ 10 일에서 일반적으로 (P1-중간 엽 줄기 세포)를 합류하는 세포를 성장. 2 일마다 배지 새로 고칩니다.
  3. 대기음하고, 플라스크에서 배지를 버리고 신선한 MSC-RS 배지로 세척 및 솔루션을 분리 동물 무료 프로테아제 2 ㎖를 추가합니다. 37 품어76; 5 C - 15 분 (연장 보육을 방지).
  4. 5 분 동안 400 XG에 세포 현탁액을 원심 분리하고, 신선한 MSC-RS 배지 10 ㎖를 추가 대기음
  5. 신선한 MSC-RS 배지 2 ㎖ - 대기음 뜨는 및 1 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 단계 1.10에 기재된 바와 같이 세포 수로 진행
  6. 5 × 103 세포 / cm 2-3를 파종하여 그 하위 문화로 넘어갑니다. (P2-중간 엽 줄기 세포)를 합류하는 세포를 성장.
  7. 4.5 단계 및 3 장에 설명 된대로 특성을 진행 단계 4.3에서 설명 된 바와 같이 단백질 분해 효소 소화에 의해 수확 세포.
    주 : CD73 + CD90 + CD45 CD31 NEG의 NEG 세포의 비율 95 % 이상 만 편미분을 나타내며, 또 배양 통로를 요구한다.
  8. 플레이트 P2-중간 엽 줄기 세포 2 × 여섯 잘 TC-처리 판 10 4 / cm 2 및 성장에는 MSC-RS 매체에 합류합니다.
  9. 마크 "아니오의 Diff"로 두 우물과는 MSC-RS 매체를 새로 고칩니다.
  10. 마크이 아니라"Osteo"특히 MSC 분화 용으로 설계된 200 μL / 표준 골 형성 매체의 cm 2와 매체를 교체 등의.
  11. 마크 두 개의 "Adipo"로 우물 특히 MSC 분화 용으로 설계된 200 μL / 표준 지방 세포 배지 cm 2와 매체를 교체하십시오.
  12. 전체 미디어 각 48 시간을 변경하여 5 % CO 2 37 ° C에서 문화를 유지한다.
    참고 : 높은 시험 재현성 표준 상업적으로 이용 가능한 차별화 된 미디어를 사용하는 것이 좋습니다. 세포 내 지질 방울의 축적이 지방 세포에 의한 세포에서 분명하다 동안 차별화 된 조건에서 2/3 주 후, 칼슘 예금, 골 형성 유도 문화에 나타납니다.
  13. 기음 문화 미디어 다음 D-PBS로 씻어 버리고.
  14. 실온에서 15 분 동안 파라 포름 알데히드 (/ V W) 4 % 1 ㎖를 첨가하여 배양을 수정.
  15. 정착이, D-PBS를 추가 2 분 동안 품어과 부어 제거합니다. 반복 세탁두번.
  16. 두 "Adipo는"200 nM의 나일 레드 솔루션에 우물을 표시와 함께 두 개의 "Osteo는"함께 하이드 록시 아파타이트 특정 형광 용액 일 "아니오의 Diff"에 우물을 표시와 함께 한 "아니오의 Diff"를 얼룩. 실온 (11, 12)에서 30 분 동안 인큐베이션.
  17. 솔루션을 염색 제거를 두 번 D-PBS로 씻는다.
  18. 추가, D-PBS를 제거 D-PBS는 50 % (v / v)의 글리세린 보충 및 이미징 (7) (9) (10)를 진행합니다.

5. MPC 회전 타원체 돋 분석

  1. 3D 회전 타원체를 생산하기 위해 페트리 접시 뚜껑의 내부 표면에 갓 격리 MPC 현탁액 (1.5 × 104 세포 / 드롭)의 20 μl의 방울을 배치합니다.
    참고 : 취급 상품들이 파열로 이어질 수있는 바와 같이, 그것은 초과를 배치하는 것이 매우 추천입니다.
  2. 조심스럽게 D-PBS가 걸려 증발을 삭제 방지하기 위해 포함 된 배양 접시를 정리해하기 위해 뚜껑을 사용합니다. CO 2 5 %에서 37 ° C에서 품어하룻밤 세포를 3 차원 회전 타원체에 통합 할 수 있습니다.
  3. 미리 냉각 24- 웰 배양 플레이트에 표준 ECM 단백질을 300 ㎕의 분취 량을 첨가하여 쥐의 세포 외 기질 (ECM) 단백질의 두꺼운 겔을 설정하고, 30 분 동안 37 ℃에서 배양한다.
  4. 조심스럽게 페트리 접시의 뚜껑을 뒤집어 부드럽게 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 회전 타원체를 선택합니다.
  5. 상기 ECM 단백질 겔상에서 구 상체를 마련 표준 VEGF 풍부한 내피 세포 성장 배지 700 ㎕의 분취 액을 추가 5 % CO 2에서 37 ℃에서 배양한다.
  6. 24 시간 후와 문화 7 일에서 4 배 확대 배율에서 3D 문화의 사진을 찍을. 마지막 침입 셀 및 구형 에지 사이의 반경 방향 거리를 측정하여 화상 해석 소프트웨어를 적용 타원체 돋아 평가한다. 적어도 20 서로 다른 방향을 따라 반복 측정합니다. 평균 거리는 경우 50 μm의 이상 긍정적으로 간주된다.

결과

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여기에서 설명한 선택적 배양 조건은 HBM-다국적 1.0 %의 신규 점착 거의 단형 세포군의 분리를 허용 할 (0.5-2.0 × 105 내지 6 HBM-다국적 - 신선한 BM 시료 10 mL) 중 5,6- . MPC와 5로, 대기, 기-67 음성 세포를 반올림, - 우리는이 큰 (60 μm의 직경 40)를 확인했다. 형태 학적으로, 그들은 (그림 1 A.1에 흰색 ​​화살표)을 높은 배율 전력에서 filopodia을 많이 보여주는 평면 얇은 주변에 둘러싸여 두꺼운 핵심 영역과 특유의 기름에 튀긴 된 계란 모양을 특징으로한다. 외부 셀 경계 폴라 신도들은 (도 1에 검은 색 화살표 A.1)를 관찰한다. 이러한 형태는 표준 MSC 문화에보고 된 전형적인 방추형 중간 엽 기질 세포 모양에서 분명히 다르다. 유동 세포 계측법 m 동안 CD31과 CD45를 표현하는 갓 격리 된 MPC의 95 % 이상을 보여 주었다esenchymal 관련 마커 CD90 및 CD73 (13)는 탐지 (그림 1 A.2)이었다. 우리는 MPC와 네 항원이 제한 집합으로 나타내는 생각. MPC와의 또 다른 구별 특징은 세포에서 감지되지 않습니다 (그림 1 A.3 빨간색)을 podosome 같은 구조의 수를 공개 점 F-굴지의 유통 및 네 스틴의 강렬한 식 (그림 1 A.3 녹색)입니다 이소 타입 대조군 항체로 염색 (데이터는 보이지 않음).

표준 RS에서 배양 된 MPC는 매체 기하 급수적으로 증가 MSC와 같은 세포 (그림 1 B.1)에 급속한 분화 MSC 확장 결과를 디자인했다. 이 구절 후 세포는 마지막으로 CD73 + CD90 + CD45 음수 CD31의 NEG (그림 1 B.2)에 CD73 음수 CD90의 음수 CD45 + CD31 +에서 자신의 표현형을 전환합니다. 이 과정에서 MPC와 재 ORGA네 스틴 표현은 몇 가지 희귀 세포 (그림 1 B.3)에 국한된다 동안 nize 스트레스 섬유로 F는 액틴. 명확한 MSC와 같은 표현형에 MPC mesengenic 분화는 다른 세포의 형태학에 의해 밝혀 두 가지 단계를 통해 발생합니다. MSC RS 매체 일주 MPC 유사 세포의 잔류 인구 후에도 (도 2의 P1-MSC들) 평평한 다각형의 다 분지 셀 합류 층 내에서 검출된다. 추가의 통로 (도 2 (A)에 P2-MSC들) 방추형 MSC 유사 세포의 거의 단형 배양을 얻을 필요가있다. 따라서 자신의 MSC 자연을 확인, 최소 2 주 동안 선택적 미디어에 전송 할 때이 기하 급수적으로 증가 세포는 쉽게 조골 세포 나 지방 세포로 분화 할 수 있습니다. 골 형성 유도 배양 물에 칼슘 침착은 어느 비색 알리자린-S 염색 또는 특정 형광 염료 (도 2의 B 녹색)에 의해 검출 될 수있다. 지방 세포 유도 세포 후(그림 2 B 빨간색) 중 하나 비색 오일 레드 또는 형광 나일 레드 얼룩에 의해 계시 된 지질 축적을 보여줍니다.

MPC 입력은 혈관 신생 분석을 돋에 의해 확인되었다. MPC와는 24 시간 VEGF-자극 (그림 2 C) 후 3 차원 회전 타원체에서 쥐 ECM 단백질 젤 침공 (μm의 50 이상) 할 수있는 능력을 보여 주었다. 600 μm의 거리 - 일주 침입 세포 (300)에서 검출 한 후. 반대로, 침략 용량은 mesengenic 분화 (그림 2 D) 후 P2-중간 엽 줄기 세포에서 분실되었다.

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그림 1. 갓 고립 된 MPC는 독특한 특징을 가지고있다. DMEM / 10 % PhABS에서 배양 HBM-다국적 기업을 이레 동안은 중간 엽 줄기 세포와 쉽게 구별 정지 된 MPC (A)의 인구 (B)을 발생시킨다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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2. MPC와 중간 MSC 확장을 위해 설계 상업적으로 이용 가능한 RS와 DMEM / PhABS의 체외. 교체의 표준 중간 엽 줄기 세포 및 표시 돋 혈관으로 분화 그림 MPC와의 mesengenic 유도를 트리거합니다. 문화 일주 후 몇 잔류 된 MPC는 여전히 MSC-RS 매체에 추가 통로 합류 MSC와 같은 세포 집단 (P2-중간 엽 줄기 세포, 스케일 바 = 100 μm의)로 연결하는 동안 검출 (P1-중간 엽 줄기 세포)입니다. 피칼슘 침착 (B 녹색) 및 지질 축적 (B 빨간색, 스케일 바 = 200 μm의)에 의해 계시 된 2 중간 엽 줄기 세포는 말기 각각 적절한 자극에서 골 세포 나 지방 세포로 분화. MPC와는 P2-중간 엽 줄기 세포 (D, 스케일 바 = 1.0 mm)과의 차이에 쥐 ECM 단백질 겔 (C)의 회전 타원체에서 일관된 발아을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

지난 수십 년 동안 MSC는 다양한 뼈/관절, 면역학적, 신경학적, 심혈관, 위장 및 혈액 장애의 치료에 적용할 수 있는 가능성에 대해 광범위하게 연구되고 전임상 평가되었습니다14,15. 많은 다른 조직에서 다능성 중간엽 줄기세포를 쉽고 저렴하게 분리하고 유의미한 면역원성16의 부족과 함께 이러한 세포를 세포 기반 요법에 적용할 수 있는 가장 흥미로운 세포 집단 중 하나로 만드는 데 기여합니다. 그럼에도 불구하고, 기원 조직의 매우 낮은 빈도는 클리닉에서 MSC 적용에 큰 제한을 나타내며, 주입 또는 이식 전에 시험관 내에서 이러한 세포의 확장을 강요합니다.

확장된 MSC 배양은 높은 등급의 이질성과 가변성을 밝혀냈으며17-19 MSC 생산 및 특성화 프로토콜에 대한 합의에 도달하기 어렵습니다. 더욱이, 최근 조사는 배양 이질성에 기여하는 광범위한 조직에 여러 생 체 내 MSC 조상이 존재함을 시사했습니다10,20. 실제로, 특정 배양 조건은 골수(hBM-MNC) 또는 지방 조직(간질 혈관 분획)과 같은 "조잡한" 및 처리되지 않은 샘플에 다양한 비율로 존재하는 중간엽 줄기세포 전구세포의 특정 하위 집단을 선택하거나 단순히 촉진할 수 있다고 제안되었습니다2. 따라서 MSC 개시 세포 집단의 가변성과 적용된 수많은 다양한 농축/분리 및 배양 프로토콜은 실현 가능한 MSC 기반 치료법의 정의에 큰 장애물을 나타냅니다.

MSC 배양의 이질성에 영향을 미치는 중요한 요소는 혈청 보충입니다21. 소수성 플라스틱에 고밀도 파종을 결합하여 hBM-MNC의 1차 배양에서 FBS를 PhABS로 대체함으로써 MPC라는 뚜렷한 생물학적 특징을 가진 새로운 고접착 세포 집단이 분리되었습니다5,6. 우리는 FBS 1차 배양에 소량의 PhABS를 추가하면 MPC 분리도 가능하다는 것을 관찰했으며, 이는 인간 혈청6에 MPC 유도제가 존재함을 시사합니다. 현재 MPC 분리/특성화 프로토콜은 거의 순수한 MPC를 얻는 데 사용할 수 있는 고유한 방법입니다. 프로토콜은 신중하게 조정되었으며 추가 적용 전에 MPC 제제의 품질 스크리닝을 위해 재현성이 높습니다.

MPC는 MSC 생산의 공급원으로 사용될 수 있으므로 분획되지 않은 출발 물질의 사용으로 인해 발생하는 변동성을 제한할 수 있습니다. 보고된 MPC 중간유성 분화를 특성화하는 여러 단계의 정확한 정의는9 동기화된 중간엽 세포 확장을 허용할 것입니다. 그럼에도 불구하고, 이 최신 조건은 고도로 정제된 MPC 집단을 독점적으로 적용하여 실현될 수 있으며, 결과적으로 여기에 설명된 프로토콜에 의해 얻은 세포 산물의 특성화는 매우 중요한 결과입니다. 이 분리 방법은 일반적으로 약 95%의 순도로 MPC를 회수할 수 있는 것으로 보고되었습니다. 그러나 기증자/환자 가변성은 적용된 인간 풀링 혈청의 다양한 배치와 관련된 가변성과 함께 선택적 조건에서 MPC와 함께 공동 분리된 중간엽 줄기세포 유사 세포의 상당 비율로 이어질 수 있습니다.

이러한 "오염된" MSC 유사 세포가 골수22에 기술된 다른 다른 생체 내 전구세포로부터 발생할 수 있는지 또는 제어되지 않고 자발적인 MPC 분화로부터 발생할 수 있는지는 명확하지 않습니다. 어쨌든, MPC 산물에서 MSC 유사 세포의 일관된 비율은 이러한 세포를 MSC 확장을 위한 균질한 출발 물질로 적용할 가능성을 무효화합니다. 따라서 여기서는 트립신 소화에 대한 MPC 저항성을 기반으로 MPC 산물의 순도를 높이는 간단하고 저렴한 방법이 제안되었습니다. MPc 배양 정제에서 CD73 및/또는 CD90 고갈을 수행하는 형광 또는 자기 세포 분류를 통해 유사하거나 더 나은 결과를 얻을 수 있지만 공정 시간이 크게 연장되고 비용이 증가합니다.

더욱이, MPC는 다능성 관련 마커와 Nestin의 발현을 보였으며, 모두 중생 분화 중에 빠르게 손실되었습니다7. 발아 분석은 쥐 ECM 단백질 겔을 침범하는 MPC 능력을 밝혔습니다. 종합하면, 이러한 결과는 MPC가 혈관신생 잠재력을 유지하는 보다 미성숙한 전구로 간주되어야 함을 나타냅니다. 그럼에도 불구하고 MPC의 중배엽 분화 가능성에 대한 초기 열정은 실제로 약해지고 있습니다. 사실, MPC에 대한 7년 이상의 연구 끝에 중생 및 혈관신생 잠재력이 광범위하게 설명되었지만5-9, 중배엽 기원의 다른 세포에 대한 분화는 여전히 부족합니다. 따라서 여기에서 우리는 이러한 세포에 대한 새롭고 보다 엄격한 정의를 "Mesangiogenic Progenitor Cells"로 제안하고 MPC라는 약어를 유지합니다.

우리는 또한 MSC 혈관신생 가능성에 대한 대부분의 논란이 다양한 비율의 MPC 및 MSC의 하위 집단으로 구성된 확장된 배양의 이질적인 구성과 관련이 있을 수 있다고 믿습니다23.

마지막으로, MPC는 이러한 세포가 신생 혈관 형성을 지원할 수 있기 때문에 조직 재건에 적용할 수 있는 CBMP의 구현에 중요한 역할을 할 수도 있습니다. 사실, 재생에 대한 향후 연구는 새로 형성된 조직 성장이 수반되는 신생혈관신생에 의해 지원되어야 한다는 점을 고려해야 합니다. MPC에서 mesengenic 및 angiogenic 잠재력의 공존은 이러한 흥미로운 세포를 포함하는 새로운 치료 접근법의 재생 잠재력을 크게 향상시킬 수 있습니다.

공개 사항

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계나 기타 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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저자는 특히 골수 샘플과 인간의 골관절염 조상에서 자신의 전문 지식을 제공하기 위해, 박사 파올로 Parchi, 외과의 부서, 의료 및 분자 병리학 및 중환자 의학, 피사의 대학을 감사드립니다

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Matrigel Basement Membrane MatrixBD Bioscience (San Jose, CA-USA)354230Murine ECM proteins
재고 농도: 100%(9 - 12 mg/ml)
최종 농도: 100%
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS)Sigma (St. Louis, MO, USA)D8537
70 μ m FiltersMiltenyi Biotec (BergischGladbach, Germany)130-095-823
Ficoll-Paque PREMIUM GE 헬스케어 (스웨덴 웁살라)17-5442-03discontinuos density gradient centrifugation pooled
human AB type serum (PhABS)LONZA (Walkersville MD-USA)14-490E최종 농도: 10%
Glutamax-IThermoFisher (Waltham,  MA USA)35050-038안정화된 L-글루타민
원료 농도: 100x
최종 농도: 2 mM
소 혈청 알부민(BSA)시그마(미국 미주리주 세인트루이스)A8412원료 농도: 7.5%
최종 농도: 0.5%
아지드나트륨시그마(미국 미주리주 세인트루이스)S8032최종 농도: 0.02%
페니실린/스트렙토마이신(펜 연쇄상구균)Gibco ( Grand Island, NY, USA)15070-063항생제
재고 농도: 5,000 UI/ml 페니실린, 5,000 μ g/ml 스트렙토마이신
최종 농도: 50 UI/ml 페니실린, 50 μ g/ml 현
탁액 배양을 위한 스트렙토마이신 T-75 배양 플라스크Greiner Bio-one  (프리켄하우젠, 독일)658 190
T-75 배양 플라스크 TC 처리Greiner Bio-one  (프리켄하우젠, 독일)658170
TrypLE SelectThermoFisher (Waltham,  MA USA)12563-011동물성 없는 프로테아제 분리 용액
재고 농도: 1x
최종 농도: 1x
트립신/EDTAThermoFisher (Waltham,  MA USA)15400-054페놀 레드 프리
재고 농도: 0.5%
최종 농도: 0.25%
anti-CD90 APC 항체  (CD90)MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)130-095-402최종 농도 : 1:40
anti-CD45 APC-Vio770 항체 (CD45)MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)130-096-609최종 농도 : 1:40
anti-CD73 PE 항체 (CD73)MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)130-095-182최종 농도 : 1:40
anti-CD31 PE Vio-770 항체 (CD31)MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)130-105-260최종 농도: 1:40
마우스 IgG1 APC 항체MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)130-098-846최종 농도: 1:40
마우스 IgG2a APC Vio770 항체MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)130-096-637최종 농도: 1:40
마우스 IgG1 PE 항체MiltenyiBiotec ( BergischGladbach, Germany)130-098-845최종 농도: 1:40
Mouse IgG1 PE Vio-770 항체MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)130-098-563최종 농도: 1:40
Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium  (DMEM)써모피셔(ThermoFisher, Waltham,  MA USA)13-1331-82페놀 레드-프리 미니멀 필수 매체
재고 농도: 1,000 mg/L 포도당
태아 소 혈청  (증권 시세 표시기)써모피셔(ThermoFisher, Waltham,  MA USA)10500재고 농도 : 0.2 mg / ml
최종 농도 : 2 μ g/ml
Prolong Gold antifade reagent with 4',6-diamidino-2-phenylindoleInvitrogen (Waltham, MA,  미국)P-36931수성 장착 매체 + DAPI
최종 농도: 1x
파라포름알데히드시그마(미국 미주리주 세인트루이스)P6148고정제
최종 농도: 4%
LAB-TEK 2웰 챔버 슬라이드시그마(미국 미주리주 세인트루이스)C6682
안티-네스틴 항체[클론 10C2]Abcam(영국 케임브리지)ab2035재고 농도 : 1 mg / ml
최종 농도 : 7 μ g/ml
Alexa Fluor 555 PhalloidinThermoFisher (Waltham,  MA USA)A34055재고 농도: 200 UI/ml
최종 농도: 5 UI/ml
Triton X-100Euroclone (이탈리아 밀라노)EMR237500최종 농도: 0.05%
MesenPRO RS Medium  (MSC-RS 매체)써모피셔(ThermoFisher, Waltham,  MA USA)12746-012
Alexa Fluor 488 안티-마우스 SFX 키트ThermoFisher (Waltham,  MA USA)A31619염소 안티 마우스 2 차 항체 + 신호 강화제
재고 농도 : 2 mg / ml < > 최종 농도 : 2 μ g/ml
파스퇴르 피펫Kartell Labware  (Noviglio (MI), 이탈리아 )329
스템맥스 아디포디프  MediaMiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)130-091-679
StemMACS OsteoDiff  MediaMiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany)130-091-678
Osteoimage Bone mineralization AssayLONZA (Walkersville MD-USA)PA-1503하이드록시아파타이트 특이적 형광 염색 용액
50 ml 폴리스티렌 원추형 튜브Greiner bio-one (Kremsmü nster
Austria)227261
Nile RedThermoFisher (Waltham,  MA USA)N1142지질용 형광 염색 용액
원료 농도: 100 mM
최종 농도: 200 nm
글리세린시그마(미국 미주리주 세인트루이스)G2289최종 농도: 50%
Polistirene 페트리 접시시그마(미국 미주리주 세인트루이스)P5606
24웰 플레이트 TC 처리Greiner Bio-one GmbH(독일 프리켄하우젠)662160
내피 성장 매체, EGM-2 BulletKit  (주얼베드-2)LONZA (Walkersville MD-USA)CC-3162VEGF가 풍부한 내피 세포 성장 매체
Leica Qwin Image Analisys SoftwareLeica (Wetzlar, Germany)이미지 분석 소프트웨어

참고문헌

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  1. Stoltz, J. F., et al. Stem Cells and Regenerative Medicine: Myth or Reality of the 21th Century. Stem Cells Int. 2015, 734731(2015).
  2. Pacini, S. Deterministic and stochastic approaches in the clinical application of mesenchymal stromal cells (MSCs). Front Cell Dev Biol. 2, 50(2014).
  3. Galvez, P., Clares, B., Hmadcha, A., Ruiz, A., Soria, B. Development of a cell-based medicinal product: regulatory structures in the European Union. Br Med Bull. 105, 85-105 (2013).
  4. Herberts, C. A., Kwa, M. S., Hermsen, H. P. Risk factors in the development of stem cell therapy. J Transl Med. 9, 29(2011).
  5. Petrini, M., et al. Identification and purification of mesodermal progenitor cells from human adult bone marrow. Stem Cells Dev. 18 (6), 857-866 (2009).
  6. Trombi, L., et al. Selective culture of mesodermal progenitor cells. Stem Cells Dev. 18 (8), 1227-1234 (2009).
  7. Pacini, S., et al. Constitutive expression of pluripotency-associated genes in mesodermal progenitor cells (MPCs). PLoS One. 5 (3), 9861(2010).
  8. Pacini, S., et al. Specific integrin expression is associated with podosome-like structures on mesodermal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (12), 1830-1838 (2013).
  9. Fazzi, R., et al. Mesodermal progenitor cells (MPCs) differentiate into mesenchymal stromal cells (MSCs) by activation of Wnt5/calmodulin signalling pathway. PLoS One. 6 (9), 25600(2011).
  10. Tormin, A., et al. CD146 expression on primary nonhematopoietic bone marrow stem cells is correlated with in situ localization. Blood. 117 (19), 5067-5077 (2011).
  11. Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
  12. Wang, Y. H., Liu, Y., Maye, P., Rowe, D. W. Examination of mineralized nodule formation in living osteoblastic cultures using fluorescent dyes. Biotechnol Prog. 22 (6), 1697-1701 (2006).
  13. Horwitz, E. M., et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 7 (5), 393-395 (2005).
  14. Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19(2012).
  15. Si, Y. L., Zhao, Y. L., Hao, H. J., Fu, X. B., Han, W. D. MSCs: Biological characteristics, clinical applications and their outstanding concerns. Ageing Res Rev. 10 (1), 93-103 (2011).
  16. Le Blanc, K., Tammik, C., Rosendahl, K., Zetterberg, E., Ringden, O. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. Exp Hematol. 31 (10), 890-896 (2003).
  17. Phinney, D. G. Biochemical heterogeneity of mesenchymal stem cell populations: clues to their therapeutic efficacy. Cell Cycle. 6 (23), 2884-2889 (2007).
  18. Phinney, D. G. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: implications for cell therapy. J Cell Biochem. 113 (9), 2806-2812 (2012).
  19. Tolar, J., Le Blanc, K., Keating, A., Blazar, B. R. Concise review: hitting the right spot with mesenchymal stromal cells. Stem Cells. 28 (8), 1446-1455 (2010).
  20. Corselli, M., et al. The tunica adventitia of human arteries and veins as a source of mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 21 (8), 1299-1308 (2012).
  21. Bieback, K., et al. Human alternatives to fetal bovine serum for the expansion of mesenchymal stromal cells from bone marrow. Stem Cells. 27 (9), 2331-2341 (2009).
  22. Watson, L., Elliman, S. J., Coleman, C. M. From isolation to implantation: a concise review of mesenchymal stem cell therapy in bone fracture repair. Stem Cell Res Ther. 5 (2), 51(2014).
  23. Pacini, S., Petrini, I. Are MSCs angiogenic cells? New insights on human nestin-positive bone marrow-derived multipotent cells. Front Cell Dev Biol. 2, 20(2014).

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