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방법 논문

인간의 기본 영양막 세포 멜라토닌에 대해 저산소증의 보호 효과를 연구하기 위해 세포 배양 모델 / 재산 소화에 의한 혼란

15.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54228

⸱

2016년 7월 30일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1INRS-Institut Armand-Frappier

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 원고는 저산소증/재산소화 하에서 배양된 면역정제된 인간 융모 세포영양아세포 세포의 독특한 체외 모델을 제시합니다. 이 모델은 멜라토닌과 같은 유망한 치료법이 산화 스트레스 증가 및 태반 기능 변화와 관련된 임신 합병증에 대한 보호 효과를 연구하는 데 적합합니다.

초록

이 프로토콜은 융모 세포영양세포세포(villous cytotrophoblast cells)가 연속적인 효소 분해에 의해 만삭 태반에서 분리된 후 밀도 원심분리, 배지 구배 분리 및 면역자기 정제를 수행하는 방법을 설명합니다. in vivo에서 관찰된 바와 같이, 1차 배양에서 단핵 융모 세포영양아세포 세포는 72시간 후에 다핵 세포영양아세포 세포로 분화합니다. 정상산소(8% O2)와 비교했을 때, 저산소증/재산소화(0.5% / 8% O2)를 겪는 융모 세포영양세포세포는 산화 스트레스와 내인성 세포사멸(ininsic apoptosis)이 증가하는데, 이는 생체내에서 관찰되는 임신 중 임신 합병증(preeclampsia, 조산, 자궁 내 성장 제한)과 같은 합병증과 유사합니다. 이러한 맥락에서, 저산소증/재산소 조건에서 배양된 1차 융모막아세포는 인간 태반에서 변형되는 메커니즘과 신호 전달 경로를 더 잘 이해하고 특정 임신 장애를 예방하는 효과적인 약물을 찾는 것을 용이하게 하는 독특한 실험 시스템을 나타냅니다. 인간 융모영양아세포(villous trophoblast)는 멜라토닌을 생성하고 합성 효소와 수용체를 발현합니다. 멜라토닌은 자간전증과 자궁 내 성장 제한에 대한 치료법으로 제안되었는데, 이는 멜라토닌의 보호 항산화 효과 때문입니다. 이 논문에 기술된 1차 융모 세포영양아세포 모델에서 멜라토닌은 정상 산소 상태의 영양막세포에 영향을 미치지 않지만 저산소증/재산소화에 의해 파괴된 세포융합세포의 산화환원 균형을 회복시킵니다. 따라서 1차 배양에서 인간 융모 영양막 세포는 저산소증/재산소화 중 태반 기능에 대한 멜라토닌의 보호 효과 뒤에 있는 메커니즘을 연구하는 훌륭한 접근 방식입니다.

서론

인간 임신 중, 단핵 줄기 세포 인 cytotrophoblast 태반 세포는 빠르게 증식 또는 융모 extravillous cytotrophoblast 세포로 분화하거나. Extravillous cytotrophoblasts는 침략과 자궁 벽의 나선형 동맥을 개조. 융모 cytotrophoblasts 반면에, 다핵는 syncytiotrophoblast합니다 (syncytium) (1)를 형성하기 위해 증식 분화 퓨즈 계속한다. 융모 영양막 세포의 항상성의 유지 보수는 태아 웰빙과 건강한 임신을 위해 필수적이다. 사실, 융모 trophoblasts는 산소와 영양소의 모체 - 태아의 교환을 허용하고, 임신을위한 필수적인 호르몬을 생산하고 있습니다. 또한,는 syncytiotrophoblast는 모체 혈액 순환과 직접 접촉만을 셀형이며 필수적인 물리적 면역 장벽을 제공한다. 따라서,는 syncytiotrophoblast는 항상성 유지를위한 세포 사멸 및 교체를 받아야하고 AVO하기아이디 태반은 2-5 병리.

인간의 태반에서 차 융모 cytotrophoblasts를 분리하기 위해 1986 년 Kliman 등. (6)에 의해 개발 된이 기술은 융모 영양막 세포의 분화에 관여하는 분자 메커니즘 연구를 허용하여 태반 연구에 혁명을 일으켰습니다. 밀도 원심 분리 미디어에서 분리 한 다음 트립신과 DNase를 순차적 효소 digestions에 따라이 고전적인 기술은, (콜로 이달 실리카 입자는 폴리 비닐 피 롤리 돈에 의해 코팅, 또는 퍼콜)는 지금 융모 cytotrophoblast 세포를 분리하기위한 황금 표준으로 인식하고 있습니다. 이 기술은 자기 immunopurification, 이들 세포의 표면에 특이 항원의 발현 차이에 기초하여 비 융모 세포 융모 cytotrophoblasts 분리 절차에 의해 최적화 될 수있다. 우리 때문에 융모 membran 세포에 발현의 부재에 사람 백혈구 항원 ABC (HLA-ABC)를 선택한전자 7, 8.

태반은 임신 중 산소 수준에 극적인 변화를 겪는다 기관이다. 임신 초기에, 산소 비율은 생리 매우 낮음 (2 % O 2) 그러나 두 번째 및 세 번째 임신에서 산소화 온화한 수준 (8 % O 2)로 증가한다. 툴리 등. (9)는 태반 융모 내부 영양막 환경 시험 관내 재생 산소화 수준의 도전 및 변형도 표현형 변화를 초래할 수 있음을 설명했다. 따라서, 임신 8,9의 세 번째 임신시 태반 융모에있는 산소 장력을 모방 normoxia로 8 % 산소를 도입하는 것을 제안한다. Chen 등. (10)는 광범위 영양막 세포 배양 산소 장력과 관련된 여러 변수를 검토하고 pericellular 환경에서의 산소 농도를 결정하는 중요성을 입증 하였다. 융모의 산소 농도가 증가하는 경향혈관 생성에 기인. 계속 태반 융모 증가 혈류량과 과산화수소의 수준 (풍부한 반응성 산소 종) 혈관 형성 (11, 12)을 제어하는 중요한 신호이다. 임신 합병증, 혈관 생성의 결핍은 저산소증, 더욱 중요한 것은, 산소 간헐적 변동 (호출 저산소증 / 재산 소화)를 생성한다. 이러한 조건은 태반과 태아의 생존 13,14 타협 산화 스트레스의 비정상적인 증가로 이어집니다. 융모 cytotrophoblasts 그들이는 syncytiotrophoblast로 분화 될 때까지 정상 산소 상태 (8 % O 2)에서 유지되는 다음과 같이 영양막 세포가 저산소증 / 재산 소화의 에피소드 중 생체 내에서 받아야 변화는 시험 관내에서 모방 할 수 있습니다. 그들은 다음 normoxia (재산 소화)의 추가 18 시간 뒤에, 4 시간 동안 저산소 조건 (0.5 % O 2)을 실시한다. 이 저산소증 / 재산 소화 방식을 사용하여, 예를 trophoblasts특정 임신 합병증에서 관찰 된 바와 같이, 하이드 록시 에틸는, 산화 환원 상태 및 고유 세포 사멸 (8)의 증가 수준을 규제 완화. 따라서, 이는 태반 저산소증 / 재산 소화와 관련 임신 합병증을 방지하기 위해 새로운 예방 및 치료 방법을 평가하기 위해 시험 관내 모델에서 유용하다.

태반 세포는 산화 스트레스와 태반 기능 부전 (15)를 미연에 방지 할 수있는 능력 등 여러 가지 중요한 기능을 가지고 멜라토닌을 생산하고 있습니다. 여기, 우리는, 분자 세포 및 기능 수준 8시 태반의 영양막 세포에서 멜라토닌의 보호 효과를 입증하는 데 사용되는 실험 방법 및 세포 모델을 제시한다.

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프로토콜

태반은 정보를 환자의 동의와 윤리위원회 (CHUM - 세인트 루크 병원 INRS - 인스 티 투트 아르망 - Frappier의 승인을 즉시 미끼 - 세인트 루크 병원, 몬트리올, QC, 캐나다에서 복잡하지 않은 임신에서 자연 질식 분만 후 얻었다 라발, QC, 캐나다).

산모 Cytotrophoblast 세포의 1. 분리 및 정제

  1. 솔루션 및 미디어
    1. 보완하여 전송 매체를 준비 둘 베코의 이글의 중간 높은 포도당 1 % 부피 /의 부피 항생제와 (DMEM-HG) (10,000 단위 / ml의 페니실린 G, 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신 황산염) 및 저장 4 ℃에서 수정.
    2. 10 % 부피 / 부피 소 태아 혈청 (FBS), 25 mM의 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES), 1 % 부피 / 부피 항생제 (10,000 단위 / 가진 DMEM-HG를 보충하여 일차 배양 배지를 준비 ml의 페니실린 G 4 ° C에서 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신 황산염) 및 저장. 37 ° C에 따뜻한 미디어 전용도.
    3. 생리 식염수 (0.9 % 중량 / 부피의 염화나트륨)의 4 L를 준비한다.
    4. HBSS (PH 7.4) 1x에서 25 mM의 HEPES를 추가하여 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)를 수정 준비합니다.
    5. (변성 (1.1.4에서 제조) HBSS, 황산 마그네슘 (MgSO4로), 염화칼슘 (CaCl2를) 트립신, 데 옥시 리보 뉴 클레아 제의 IV (DNase의 4) 및 1 % 부피 / 부피 항생제 분해 용액 신선 네병 준비 표 1에 나타낸 바와 같이 10,000 단위 / ㎖ 페니실린 G, 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신 설페이트).
    6. 밀도 원심 분리 미디어 구배를 준비
      1. 10 % 부피 /의 부피 HBSS 10 배와 밀도 원심 분리 미디어를 보완하여 밀도 원심 분리 미디어 솔루션을 준비합니다.
      2. 표 2에 기재된 바와 같이, 밀도 원심 미디어 용액 변성 HBSS 14 분석 튜브를 준비한다.
      3. 적극적으로 그라데이션에 내용을 추가하기 전에 각각의 밀도 솔루션 (단계 1.1.6.2)를 섞는다. 부드럽게가장 높은 농도 (70 %)을 시작으로 연동 펌프 (1 ㎖ / 분)을 50 ㎖의 유리 원심 관에 밀도 솔루션을 추가한다. 구배의 각 층의 적절한 거리를 유지하기 관벽 용액을 배출하여 물방울을 피한다.
        1. 연동 펌프의 부재에서, 파스퇴르 피펫으로 매우 부드럽게 층을 적용합니다.
    7. 실행중인 버퍼를 보완하여 최종 실행 버퍼를 준비 (10,000 단위 / ml의 페니실린 G, 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신 설페이트), 항진균제 2 % 부피 / 부피 항생제 /과 (재료의 표 참조). 4 ℃에서 보관하십시오.
  2. 융모 cytotrophoblast 분리
    참고 : 사용 무균 수술 장비, 유리, 피펫, 플라스크 등
    1. 융모 cytotrophoblast 분리 날에, 37 ℃의 수욕 및 FBS 70 ㎖ (단계 1.1.5에서)를 digestions 용액을 가온. 주 : FBS 50ml의 사용은 digestions 및 인터럽트 할일단 해동 얼음에 배치 할 수있는 냉동 공정 (1.2.22) 20 ml의 나머지.
    2. 전달 후, 수 (이하, 1 시간) 빨리 (1.1.1)에서 빙냉 전송 매체에 실험실 태반을 가져온다.
    3. 취소 전송 매체 및 액체 쓰레기통에 태반 혈액. 태반의 무게를 차가운 생리 식염수에 담가.
    4. 측정하고 다음과 같은 기능 분석 : 탯줄의 길이; 탯줄 현지화; 태반 길이, 폭, 모양 (타원형 원반 모양); 막 색상; 떡잎 구조 병변. 주 : 데이터는 결과 섹션에 표시됩니다.
    5. (코드 주위에 추가 1cm 반경 원과의 기지에서, 즉)의 태반 삽입과 함께 탯줄을 잘라. 이상 조직 학적 분석 학적 조직 고정액 수용액 (포르말린 10 %) 300 ㎖에 담근다.
    6. 5 × 5 × 5cm의 큐브로 전체 태반을 잘라. 식염수 졸 (4 시간 X ~ 1 분) 철저하게 세척생리 식염수가 선명해질 때까지의 ution (0.9 %)는 혈액 세포를 제거한다. 액체를 씻어 버리십시오.
    7. 시계 유리, 혈관 석회화를 제거하는 태반 막과 말하다 조직을 제거합니다. 집게로 단단히 혈관을 잡고 Metzenbaum 가위의 뒷면을 사용하여 조직을 제거합니다.
      1. 흡인 여과기에 다진 태반을 놓습니다. 식염수 버퍼의 약 100 ㎖로 씻어. 다진 조직의 35g (보트와 규모 무게 사용 플라스틱)를 얻을 수있다 - (30)가 될 때까지 닦지 계속합니다. 35g 제제 - 필요한 경우, 추가로 30 세까지 얻었다 태반의 나머지 말하다. 이 시간 동안 얼음에 무게 보트에 다진 조직을했습니다.
        참고 :이 단계는 1 시간에 약 45 분 소요됩니다.
    8. trypsinizing 플라스크에 35g 다진 태반 조직 - 30를 추가합니다. 전송 150 trypsinizing 플라스크에 준비된 소화 용액 1 (표 1)의 용액과 잘 혼합한다.
    9. 에 trypsinizing 플라스크를 배치무 50 사이클 / 분의 속도로 30 분 동안 수욕 진탕 수동 trypsinizing 플라스크를 균일 소화 매 5 분 동안 혼합한다.
    10. 제 소화의 끝에, 수욕에서 trypsinizing 플라스크를 분리하고 태반 조직을 1 분 침강 대 (45)를 기울. 10 ㎖의 멸균 피펫으로 제거하고 상층 액의 약 80 ml의 폐기합니다. 조직을 흡입하지 마십시오.
    11. 전송합니다 trypsinizing 플라스크 소화 용액을 100㎖의 2 (표 1); 잘 혼합 단계 1.2.9를 반복합니다.
    12. 제 소화의 끝에, 수욕에서 trypsinizing 형틀을 제거하고 1 분 정도 45 ° 기울. 10 ㎖의 멸균 피펫으로, 80 ml의 상층 액을 제거하고 부드럽게 셀 스트레이너 (100 μm의 메쉬)와 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다. FBS 2 ㎖ 원심 분리 튜브가 가득마다 들어있는 비이커에 여과하여 상층 액을 이동.
    13. 기술 한 바와 같이 제 소화를 수행병행하여 75 ml의 소화 용액 (3)을 사용하여 초 소화 (1.2.11 및 1.2.12)은, 소화 2 1.2.16.1에 단계 1.2.15를 수행합니다.
    14. 소화 용액 (4) (75 ㎖)를 사용하여 제 소화 정확히 제 소화를 수행하지만, 상등액의 최대 양을 수집한다. 소화 3 병렬 1.2.16.1에 단계 1.2.15를 수행하고, 마지막으로 소화 4.
    15. 제 (digestions이 3 내지 4), 13.5 mL의 상층 액 부분으로 한 15 mL의 원심 분리 튜브에 나누어지는 각 부품. 22.8 cm 길이 유리 파스퇴르 피펫으로 아주 부드럽게 천천히 개별 층을 생성하기 위해 각 튜브의 하단 FBS 1.5 ㎖에 놓는다. FBS와 상층 액을 혼합하지 마십시오. 실온에서 1,250 × g으로 20 분 동안 브레이크없이 튜브를 원심 분리기.
      참고도 1에 나타낸 바와 같이 원심 분리 후에, 4 층의 튜브를 볼 수 트립신 및 영양막 세포의 분리 과도한 세포 분해를 피한다..
    16. 진공 펌프와 aspir먹고 두 층 사이에 백탁 막을 포함 상청액 (분해 용액) 및 FBS 층을 버린다. 따뜻한 세포 배양 배지 1 mL를 펠렛합니다 (trophoblasts과 적혈구 층) 재현 탁한다 (단계 1.1.2 아니오 FBS없이 HEPES로).
      1. 모든 관에서 재 부유 세포를 수집하고 1 관에서 그들을 결합. 튜브 모든 digestions이 끝날 때까지 실온에 서 보자. 참고 : 모든 digestions 후, 보통의 수율은 재현 탁 세포 (소화 당 하나)의 3 관입니다.
    17. 따뜻한 세포 배양 배지 15 ml의에 볼륨을 확인합니다. 실온에서 10 분 동안 1250 × g으로 원심 분리기. 진공 펌프와 뜨는을 제거합니다. 펠렛을 흡입하지 마십시오.
    18. 부드럽게 따뜻한 세포 배양 배지 1 ㎖로 3 개의 튜브에서 얻은 펠렛을 재현 탁. 1 관에서 자신의 콘텐츠를 풀. 8 ml의 수득 따뜻한 세포 배양 배지 부피를 완료.
    19. 아주 부드럽게 분리 래드에 세포 현탁액 레이어파스퇴르 피펫 ient. 실온에서 507 XG에 30 분 동안 브레이크없이 원심 분리기.
    20. 원심 분리 후, 다시 조명 기울기에 세포의 다른 레이어를 식별합니다. 밀도 원심 분리 매체의 50 % - 레이어 영양막 세포를 포함하는 40 사이에 세포 오염을 찾습니다. 진공 펌프로, 상위 계층들 (> 50 %)을 제거한다.
    21. 파스퇴르 피펫 관심 층에있는 세포를 수집하고 50 ML의 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다. 세포 배양 배지 50 ㎖에 볼륨을 확인합니다. 상온에서 1,250 XG에서 10 분 동안 원심 분리기.
    22. 멸균 조건 하에서, 상층 액을 제거 FBS 20 ㎖로 펠렛을 재현 탁하고 혈구를 이용하여 세포의 수를 계산. 얼음 멸균 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 2.22 mL를 추가하고 젖혀 부드럽게 혼합한다. 저온 바이알에 세포 현탁액의 분취 량 1.5 ㎖를, -​​80 ° C에서 밤새 냉동 및 액체 질소 탱크로 옮긴다.
    3. <리> 영양막 세포 정화
    1. 헹굼 및 실행 버퍼와 제조업체의 지침에 따라 자기 정화 장비에 새 필터 컬럼을 설치합니다. 음 1, 양 1, 양 2 포트를 청소하고 제조업체의 지침에 따라 각 포트에서 50 ml의 튜브를 소개하는 "클린 프로그램"을 수행합니다.
    2. 37 ° C의 물을 욕조에 빠르게 단계 1.2.22에 동결 된 세포를 해동. 50 ㎖의 튜브에 세포를 전송 천천히 차가운 완충액 20 ㎖로 재현 탁 셀. 450 XG에 5 분, 4 ℃로의 튜브를 원심 분리기.
    3. 상층 액을 버린다. 차가운 버퍼로 세척 단계를 반복합니다. 생존을 결정하는 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. 원심 분리를 반복합니다 (5 분, 4 ° C에서 450 XG의 경우). 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. 1 % 권 / 마우스 항 - HLA-ABC 항체의 부피를 포함하는 차가운 버퍼의 1 ML을 추가합니다. 30 분 동안 4 ° C에서 품어, 믹시부드럽게 매 5 분 ng를.
    4. 차가운 버퍼 6 ML을 추가합니다. 450 XG에 5 분, 4 ° C에 대한 원심 분리기. 뜨는을 취소하고이 단계를 반복합니다. 10 % 부피 / 항 - 마우스 이차 항체 결합 된 자성 비드의 체적을 포함하는 차가운 완충액 1 ㎖에 재현 탁 된 세포. 부드럽게 매 5 분을 혼합, 15 분 동안 4 ° C에서 품어.
    5. 차가운 버퍼 6 ML을 추가합니다. 450 XG에 5 분, 4 ° C에 대한 원심 분리기. 5 ml의 차가운 버퍼에 뜨는에 resuspend 폐기하십시오.
    6. 자기 정화 장비를 사용하여 영양막 세포를 분리합니다. 부정적인 포트에서 세포를 수집하고 차가운 버퍼 20 ㎖를 추가합니다.
      주 : 영양막 세포는 복잡한 HLA-ABC 포함하지 않으며, 따라서 음의 1 포트쪽으로 다른 유형의 세포로부터 분리에 관한 것이다.
    7. 450 XG에 5 분, 4 ° C에 대한 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 부드럽게 20 ㎖ 따뜻한 차 배지에서 세포를 재현 탁. 저기서 세포를 계산조지아 혈구는 가능성을 확인합니다.
    8. 판 다음 밀도의 세포 : 0.15 × 10 6 세포 / 웰에서 96 웰 플레이트, 1.6 × 10 6 세포 / 웰에서 24 웰 플레이트 4.5 × 10 6 세포 / 웰 6 웰 플레이트. 37 ° C와 5 % CO 2에서 접시를 품어.
    9. 16, 17 계측법 및 / 또는 18 면역 세포에 의해 흐름에 의해 영양막 세포의 순도를 확인합니다.
      주 : immunopurified 세포의 순도는 사이토 케라틴 -7- 멘틴 및 17-19에 대해 FITC 접합 된 모노클로 날 항체를 사용하여 측정 하였다. 이 프로토콜은 Lanoix 등의 알 잘 상세한입니다. 2008 년 7.
    10. 적어도 4 시간 후 비 부착 세포를 제거하고 8 % O 2 (도 2, 섹션 2 참조)로 구성된다 normoxia 챔버에 플레이트를 전송하는 따뜻한 배지로 두 번 세포를 씻어.

2. 체외 유도 전열Normoxia의 n 및 저산소증 / 재산 소화

  1. 인큐베이터 챔버 작업 (셋업에 대한도 2A 참조).
    1. 층류 후드에서 건조 함을 방지하기 위해 인큐베이터 챔버의 바닥에 멸균 수를 함유하는 페트리 접시로; 그 실의 우수한 가구에 미리 제조 세포 배양 플레이트 또는 플라스크 (단계 1.3.10)을 배치했다.
    2. 후드 이외의 가스 호스 챔버 (입구 포트) 연결 (그림 2A : 5A, B 및 C) 가스 (8 % O 2 0.5 % O 2)의 튜브에 도달하는 (그림 2A : 7). 챔버의 양쪽 입구와 출구 포트를 엽니 다. 이 때, 가스 레귤레이터 (그림 2A : 4) 폐쇄 상태를 유지해야합니다.
    3. 조심스럽게 가스 조절 밸브를 엽니 다 (그림 2A : 4). 25 L의 공기 흐름을 4 분 동안 세척 / min으로 완전히 챔버 내부의 공기를 대체한다.
    4. 챔버를 세척 한 후, 그 입구 및 OU를 가스 조절기를 닫고챔버의 tlet 포트.
    5. 유량계 출구 호스 빼고 (도 2a를 : 5C) 상기 챔버의 입구로부터 37 ℃ 세포 배양 인큐베이터 챔버를 배치했다.
    6. 단계 2.1.3 후 가스를 1 시간으로 챔버를 작성하여 배지에서 현재 판, 플라스크에 존재하는 용존 공기를 교체합니다.
    7. 를 반복하여 다른 가스 조성에 대한 2.1.6에 2.1.1 단계 (예를 들어, 2 % 임신 초기의 영양막 세포 배양 9 O 2).
  2. 산소 비율을 확인 (도 2B-C)
    1. 상기 챔버 내부 (셀)없이 세포 배양 배지 내의 산소의 농도를 확인하기 위해, 산소 어댑터에 연결된 산소 전극을 사용한다. 전압계에 산소 전극을 연결합니다.
    2. 동일한 용액에서 검량선을 작성 (예를 들어, 세포 배양 배지) 공지의 산소 함량 (기체로 용액에 노출시킴으로써 예를 들어, 0 % 및21 % 산소). 판독은 각 농도에 대해 안정화 된 후, 챔버 내의 매질에 전극을 소개한다.
      주 : 산소 농도 10 편견을 피하기 위해 동일한 깊이에서 모든 측정을 수행.
  3. trophoblasts에서 normoxia 및 저산소증 / 재산 소화 유도.
    1. 적절한 세포 배양 플라스크, 플레이트 또는 페트리 접시에 차 영양막 세포를 추가 한 후, 필요에 따라 치료를 수행합니다.
    2. 병행하여, 챔버 내부 특정 조건마다 24 시간 (도 3)를 재생하기 원하는 가스 혼합물에 셀을 노출.

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결과

질식 분만에 의해 얻어진 일반 용어 태반에서 분리 및 융모 cytotrophoblast 세포의 immunopurification 1 × 10 8 가능한 세포를 얻었다. 태반은 350g 무게 원반 모양과 투명 막에 4cm 높이 직경 19cm였다. 더 자엽 기형은 발견되지 않았다. 탯줄은 paracentral 현지화 및 56cm의 길이를 가지고 있었다. 순도는 멘틴 및 사이토 케라틴-7 마커를 사용하여 유동 세포 계측법에 의해 평가되었다. 세포의 98 % 이상은 immunopurification 얻은 융모 trophoblasts 세포의 순도를 확인하는 사이토 케라틴-7 멘틴 대한 음성 및 양성이었다. 융모 cytotrophoblast 세포는 1mM의 멜라토닌의 존재 또는 부재하에 정상 산소의 조건 하에서 96 웰 배양 플레이트에 첨가 하였다. 융모 cytotrophoblasts의 생화학 적 분화는 β-인간 융모 성 성선 자극 호르몬의 수준을 결정하여 모...

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토론

포유 동물에서 태아의 발달은 적절한 태반 기능에 직접적으로 의존한다. 건강 장애의 발달 기원은 이후의 삶에서 나타난 질환의 원인은 초기 개발 및 태반 태아 프로그래밍 30-32에서 기계적 역할을하고 있음을 다시 추적 될 수 있다는 가설에 기초한다. 그것은 영양 전달을 조절 유해한 노출 방지 및 주요 내분비 기능을 가지고 : 태반은 태아의 성장과 발전의 중요한 매개체이다. Kliman 등으로 개발. 실행 가능한 기본 cytotrophoblasts을 분리하는 재현 기술의 정상 및 비정상 태반 기능 (6)의 연구의 이정표입니다. 많은 연구자 태반 18,20,33,34 생리를 이해 시험 관내에서 특정 조건을 재현하기 위해이 기술을 채택했다. Petroff 등의 알에 의해 설명 된 바와 같이. 많은 단계가 격리 된 사이토의 정제하고 강력한 수율을 보장하는 것이 중요합니다영양막 세포 18. 예를 ...

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공개 사항

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감사의 글

캐나다 자연과학 및 공학 연구 위원회(NSERC) (no. 262011-2009)에서 CV 및 CV 및 JTS에 대한 March of Dimes Social and Behavioral Sciences Research 보조금(#12-FY12-179)의 보조금으로 지원됨; Ministère de l'éducation, de l'Enseignement supérieurs et de la recherche (MEESR)-Fonds de recherche du Québec (FRQ)-Nature et technologies (NT) 및 Fondation Universitaire Armand-Frappier INRS에서 LSF로 학생 지원, Réseau Québécois en Reproduction-NSERC-CREATE의 HC, 캐나다 보건 연구소 (CIHR) 및 FRQ-Santé의 AAHT, NSERC의 JBP로; Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientìfico e Tecnològico (CNPq) 및 Programme de bourses d'excellence pour étudiants étrangers MEESR-FRQNT의 EMAS 펠로우십을 통해.

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재료

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이름회사카탈로그 번호댓글
곡선 형 Metzenbaum 가위Shandon9212수술 장비 (세포 분리) (2 개)
스플린터 집게 미세 41/2 인치Fisherbrand13-812-42수술 장비 (세포 분리) (2 개)
가위 4.5 Str 해부Fisherbrand08-940수술 장비 (세포 분리) (2 개)
거즈 스폰지 10cm x 10cmCardinal Health
361020733 직사각형 유리 베이킹 디쉬Pyrex1105397유리제품 (2.8 L)
Funnel BuchnerCoorstek Inc10-356E유리제품 (지름 114mm)
시계 유리 pyrex9985100EMD유리 제품
포르말린 용액, 중성 완충, 10%Sigma-AldrichHT501128-4L조직학적 조직 고칠 용액
Trypsinizing FlasksWheaton355395Glassware (1 unit)
일회용 배양 튜브Kimble73750-13100유리 제품
붕규산 유리 파스퇴르 피펫(22.8cm)FisherbrandK63B1367820C유리제품
250 ml 유리 비커FisherbrandKFS14005250유리제품
유리 미디어 병 캡 포함FisherbrandKFS14395250유리제품 (8개)
50 ml Corex Tube Corning8422-A(1 unit)
15 ml 폴리스티렌 원심분리기 튜브Corning430791
50 ml 폴리스티렌 원심분리기 튜브Corning430829
10 ml 혈청학적 피펫Corning11415038
세포 여과기 100 μ m 나일론코닝431752
흡수 라이너사이언스웨어1199918
500  ml 병 상단 필터코닝모공: 0.22  &마이크로; m / medium 및 HBSS 준비
2 ml Criogenic 바이알Corning430488
냉동 용기, Nalgene Mr.Frosty Sigma-AldrichC1562-1EA
연동 펌프Pharmacia Fine ChemicalsP3 모델
흔들리는 수조피셔모델 127
진공 펌프ABM4EKFS6CX-4
염화나트륨FisherbrandEC231-598-3식염수 0.9%
행크' s 완충염 용액 (Hbss)Sigma-AldrichH2387수량 : 소화 용액 1 L에 대해 9.25 (1 바이알)
Hydroxypiperazineethansulphonic Acid (Hepes)Life Technologies15630-08025ml(1M) 분해액 1L용
트립신 I형Sigma-AldrichT80039,888 U
Deoxyribonuclease Type Iv Roche10-104-159-001402,000 U
염화칼슘Sigma-AldrichC4901100mM
황산 마그네슘베이커2500-01800mM
둘베코' s Modified Eagle Medium High Glucose (Dmem)Life Technologies10564-045
페니실린 / 스트렙토 마이신 황산염HycloneSV30010
Fetal Bovine SerumCorning35-010-CV
PercollSigma-AldrichP1644밀도 원심 분리 매체 구배. 용량: 36 ml
이소프로판올아크로스42383-001050 ml
디메틸 설폭사이드시그마-알드리치472301
오토맥스 자기 분리기 Miltenyi Biotec모델 003
오토맥  칼럼 Miltenyi Biotec130-021-101
자동 실행 버퍼 Miltenyi Biotec130-091-221
http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1 자동 헹굼 솔루션 Miltenyi Biotec130-091-222http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx
Anti-Human Hla Abc 정제 클론 W6/32Affymetrix eBioscience14-9983-82안티-마우스 항체
Anti Mouse Igg MicrobeadsMiltenyi Biotec130048401
다중 웰 플레이트 -  6 웰 포함 뚜껑Corning3335셀 바인딩 표면
다중 웰 플레이트 -  뚜껑이 있는 24Corning3337셀 바인딩 표면
다중 웰 플레이트 -  뚜껑이 있는 96Corning3300셀 바인딩 표면
모듈식 인큐베이터 챔버 Billups-RothenbergMIC-101두 개 세트는 정상 산소 및 저산소증/재산소 조건을 동시에 생성하는 데 필요합니다
. 단일 유량계Billups-RothenbergSFM3001
50mm 인라인 필터Whatman6721-5010PTFE, 기공: 1.0 &마이크로; m
가스 레귤레이터Pro StarPRS301233노르목시아와 저산소/재산소 조건을 동시에 생성하기 위해 두 세트가 필요합니다
. 가스 호스 Class Vi Clear 5/16 Parker100-050701023개 ~ 0.5 m
17 mm 조절 가능한 가스 호스 클램프타이랩THCSS-16
Normoxia 가스 실린더 PraxairNI CDOXR1U-K사이즈 K (3rd 삼분기 구성: 5% CO2, 8% O2, Bal. N2)
Normoxia 가스 실린더 PraxairNI CDOXR1U-K크기 K (3rd 삼분기 구성: 5% CO2, 0.5% O2, Bal. N2)
산소 미세전극 Mi-730미세전극 INC84477
산소 어댑터미세전극 INC3572
ROS 검출 시약: CM-H2DCFDA InvitrogenC-400
β-hCG ELISA 키트 DRG internatinalEIA-4115
Anti-Vimentin 정제 항체eBioscience14-9897호스트: 마우스
Anti-Cytokeratin 7 (FITC) 항체 Abcamab119697호스트: 마우스
Alexa Fluor 488 염소 안티 무스 IgG H& L 항체Life TechnologiesA-11029
웰 웰

참고문헌

  1. Vaillancourt, C., Lanoix, D., Le Bellego, F., Daoud, G., Lafond, J. Involvement of MAPK signalling in human villous trophoblast differentiation. Mini Rev Med Chem. 9 (8), 962-973 (2009).
  2. Gauster, M., Moser, G., Orendi, K., Huppertz, B. Factors involved in regulating trophoblast fusion: potential role in the development of preeclampsia. Placenta. 30, Suppl A 49-54 (2009).
  3. Huppertz, B., Kadyrov, M., Kingdom, J. C. Apoptosis and its role in the trophoblast. Am J Obstet Gynecol. 195 (1), 29-39 (2006).
  4. Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: the smart killer: the human trophoblast as a model. Mol Cell Endocrinol. 348 (1), 1-11 (2012).
  5. Huppertz, B., Frank, H. G., Reister, F., Kingdom, J., Korr, H., Kaufmann, P. Apoptosis cascade progresses during turnover of human trophoblast: analysis of villous cytotrophoblast and syncytial fragments in vitro. Lab Invest. 79 (12), 1687-1702 (1999).
  6. Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F., 3rd, Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
  7. Lanoix, D., Beghdadi, H., Lafond, J., Vaillancourt, C. Human placental trophoblasts synthesize melatonin and express its receptors. J Pineal Res. 45 (1), 50-60 (2008).
  8. Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: The watchdog of villous trophoblast homeostasis against hypoxia/reoxygenation-induced oxidative stress and apoptosis. Mol Cell Endocrinol. 381 (1-2), 35-45 (2013).
  9. Tuuli, M. G., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Review: Oxygen and trophoblast biology--a source of controversy. Placenta. 32, Supple 2 109-118 (2011).
  10. Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Pericellular oxygen concentration of cultured primary human trophoblasts. Placenta. 34 (2), 106-109 (2013).
  11. Roberts, J. M., Hubel, C. A. Is oxidative stress the link in the two-stage model of pre-eclampsia. Lancet. 354 (9181), 788-789 (1999).
  12. Burton, G. J., Jauniaux, E. Oxidative stress. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 25 (3), 287-299 (2011).
  13. Ji, L., Brkic, J., Liu, M., Fu, G., Peng, C., Wang, Y. L. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Mol Aspects Med. 34 (5), 981-1023 (2013).
  14. Redman, C. W., Sargent, I. L. Placental stress and pre-eclampsia: a revised view. Placenta. 30, Suppl A 38-42 (2009).
  15. Sagrillo-Fagundes, L., Soliman, A., Vaillancourt, C. Maternal and placental melatonin: actions and implication for successful pregnancies. Minerva Ginecol. 66 (3), 251-266 (2014).
  16. Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21 (7), 733-741 (2000).
  17. Potgens, A. J., Gaus, G., Frank, H. G., Kaufmann, P. Characterization of trophoblast cell isolations by a modified flow cytometry assay. Placenta. 22 (2-3), 251-255 (2001).
  18. Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol Med. 121, 203-217 (2006).
  19. Maldonado-Estrada, J., Menu, E., Roques, P., Barre-Sinoussi, F., Chaouat, G. Evaluation of Cytokeratin 7 as an accurate intracellular marker with which to assess the purity of human placental villous trophoblast cells by flow cytometry. J Immunol Methods. 286 (1-2), 21-34 (2004).
  20. Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol Biol. 550, 73-87 (2009).
  21. Mounier, C., Barbeau, B., Vaillancourt, C., Lafond, J. Endocrinology and cell signaling in human villous trophoblast. Methods Mol Biol. 550, 89-102 (2009).
  22. Chen, B., et al. Pomegranate juice and punicalagin attenuate oxidative stress and apoptosis in human placenta and in human placental trophoblasts. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (9), 1142-1152 (2012).
  23. Reti, N. G., et al. Effect of high oxygen on placental function in short-term explant cultures. Cell Tissue Res. 328 (3), 607-616 (2007).
  24. Pidoux, G., et al. Biochemical characterization and modulation of LH/CG-receptor during human trophoblast differentiation. J Cell Physiol. 212 (1), 26-35 (2007).
  25. Pidoux, G., et al. ZO-1 is involved in trophoblastic cell differentiation in human placenta. Am J Physiol Cell Physiol. 298 (6), 1517-1526 (2010).
  26. Williams, J. L., Fyfe, G. K., Sibley, C. P., Baker, P. N., Greenwood, S. L. K+ channel inhibition modulates the biochemical and morphological differentiation of human placental cytotrophoblast cells in vitro. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295 (4), 1204-1213 (2008).
  27. Schild, R. L., Schaiff, W. T., Carlson, M. G., Cronbach, E. J., Nelson, D. M., Sadovsky, Y. The activity of PPAR gamma in primary human trophoblasts is enhanced by oxidized lipids. J Clin Endocrinol Metab. 87 (3), 1105-1110 (2002).
  28. Menendez-Pelaez, A., Reiter, R. J. Distribution of melatonin in mammalian tissues: the relative importance of nuclear versus cytosolic localization. J Pineal Res. 15 (2), 59-69 (1993).
  29. Perrone, S., Stazzoni, G., Tataranno, M. L., Buonocore, G. New pharmacologic and therapeutic approaches for hypoxic-ischemic encephalopathy in the newborn. J Matern Fetal Neonatal Med. 25, Suppl 1 83-88 (2012).
  30. Nelissen, E. C., van Montfoort, A. P., Dumoulin, J. C., Evers, J. L. Epigenetics and the placenta. Hum Reprod Update. 17 (3), 397-417 (2011).
  31. Barker, D. J. Intrauterine programming of adult disease. Mol Med Today. 1 (9), 418-423 (1995).
  32. Barker, J. R., Thomas, C. F., Behan, M. Serotonergic projections from the caudal raphe nuclei to the hypoglossal nucleus in male and female rats. Respir Physiol Neurobiol. 165 (2-3), 175-184 (2009).
  33. Yui, J., et al. Functional, long-term cultures of human term trophoblasts purified by column-elimination of CD9 expressing cells. Placenta. 15 (3), 231-246 (1994).
  34. Kilani, R. T., Chang, L. J., Garcia-Lloret, M. I., Hemmings, D., Winkler-Lowen, B., Guilbert, L. J. Placental trophoblasts resist infection by multiple human immunodeficiency virus (HIV) type 1 variants even with cytomegalovirus coinfection but support HIV replication after provirus transfection. J Virol. 71 (9), 6359-6372 (1997).
  35. Knofler, M., Stenzel, M., Husslein, P. Shedding of tumour necrosis factor receptors from purified villous term trophoblasts and cytotrophoblastic BeWo cells. Hum Reprod. 13 (8), 2308-2316 (1998).
  36. Douglas, G. C., King, B. F. Isolation of pure villous cytotrophoblast from term human placenta using immunomagnetic microspheres. J Immunol Methods. 119 (2), 259-268 (1989).
  37. Li, L., Schust, D. J. Isolation, purification and in vitro differentiation of cytotrophoblast cells from human term placenta. Reprod Biol Endocrinol. 13, 71(2015).
  38. Stenqvist, A. C., et al. An efficient optimized method for isolation of villous trophoblast cells from human early pregnancy placenta suitable for functional and molecular studies. Am J Reprod Immunol. 60 (1), 33-42 (2008).
  39. Potgens, A. J., Kataoka, H., Ferstl, S., Frank, H. G., Kaufmann, P. A positive immunoselection method to isolate villous cytotrophoblast cells from first trimester and term placenta to high purity. Placenta. 24 (4), 412-423 (2003).
  40. Lanoix, D., Vaillancourt, C. Cell culture media formulation and supplementation affect villous trophoblast HCG release. Placenta. 31 (6), 558-559 (2010).
  41. Vaillancourt, C., Lafond, J. Human embryogenesis: overview. Methods Mol Biol. 550, 3-7 (2009).
  42. Armant, D. R., et al. Human trophoblast survival at low oxygen concentrations requires metalloproteinase-mediated shedding of heparin-binding EGF-like growth factor. Development. 133 (4), 751-759 (2006).
  43. McCaig, D., Lyall, F. Hypoxia upregulates GCM1 in human placenta explants. Hypertens Pregnancy. 28 (4), 457-472 (2009).
  44. Burton, G. J., et al. Optimising sample collection for placental research. Placenta. 35 (1), 9-22 (2014).
  45. Lanoix, D., et al. Quantitative PCR pitfalls: the case of the human placenta. Mol Biotechnol. 52 (3), 234-243 (2012).
  46. Bilban, M., et al. Trophoblast invasion: assessment of cellular models using gene expression signatures. Placenta. 31 (11), 989-996 (2010).
  47. Novakovic, B., et al. Wide-ranging DNA methylation differences of primary trophoblast cell populations and derived cell lines: implications and opportunities for understanding trophoblast function. Mol Hum Reprod. 17 (6), 344-353 (2011).
  48. Burleigh, D. W., et al. Microarray analysis of BeWo and JEG3 trophoblast cell lines: identification of differentially expressed transcripts. Placenta. 28 (5-6), 383-389 (2007).
  49. Hung, T. H., Skepper, J. N., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J. Hypoxia-reoxygenation: a potent inducer of apoptotic changes in the human placenta and possible etiological factor in preeclampsia. Circ Res. 90 (12), 1274-1281 (2002).
  50. Heazell, A. E., Moll, S. J., Jones, C. J., Baker, P. N., Crocker, I. P. Formation of syncytial knots is increased by hyperoxia, hypoxia and reactive oxygen species. Placenta. 28, Suppl A 33-40 (2007).
  51. Heazell, A. E., Lacey, H. A., Jones, C. J., Huppertz, B., Baker, P. N., Crocker, I. P. Effects of oxygen on cell turnover and expression of regulators of apoptosis in human placental trophoblast. Placenta. 29 (2), 175-186 (2008).
  52. Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Hypoxia induces autophagy in primary human trophoblasts. Endocrinology. 153 (10), 4946-4954 (2012).
  53. Lanoix, D., Guerin, P., Vaillancourt, C. Placental melatonin production and melatonin receptor expression are altered in preeclampsia: new insights into the role of this hormone in pregnancy. J Pineal Res. 53 (4), 417-425 (2012).
  54. Galano, A., Tan, D. X., Reiter, R. J. Melatonin as a natural ally against oxidative stress: a physicochemical examination. J Pineal Res. 51 (1), 1-16 (2011).
  55. Alers, N. O., Jenkin, G., Miller, S. L., Wallace, E. M. Antenatal melatonin as an antioxidant in human pregnancies complicated by fetal growth restriction--a phase I pilot clinical trial: study protocol. BMJ Open. 3 (12), 004141(2013).
  56. Hobson, S. R., Lim, R., Gardiner, E. E., Alers, N. O., Wallace, E. M. Phase I pilot clinical trial of antenatal maternally administered melatonin to decrease the level of oxidative stress in human pregnancies affected by pre-eclampsia (PAMPR): study protocol. BMJ Open. 3 (9), 003788(2013).

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