Method Article

공장 Polysom​​e 프로파일 링을위한 쉬운 방법

DOI:

10.3791/54231

⸱

August 28th, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Laboratoire de Génétique et Biophysique des Plantes, Aix-Marseille Université, 2UMR 7265 Biologie Végétale & Microbiologie Environnementales, CNRS, 3BIAM, CEA, 4Department of Biology, Biocenter, University of Copenhagen, 5Laboratoire de Chimie Bactérienne, 6CNRS, LCB UMR 7283, Aix Marseille Université

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 결합된 리보솜의 수를 기준으로 식물 조직에서 전사체를 추출하고 분획하는 쉬운 방법을 설명합니다. 이를 통해 translation activity의 전반적인 추정치와 특정 mRNA의 translational status 결정을 수행할 수 있습니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mRNA를 단백질로 번역하는 것은 기본적이고 고도로 조절되는 생물학적 과정입니다. 폴리솜 프로파일링은 번역 조절 분석을 위한 황금 표준으로 간주됩니다. 여기에 설명된 방법은 다양한 식물 조직에서 폴리솜을 분별하는 쉽고 경제적인 방법입니다. 자당 그라디언트는 그래디언트 메이커 없이 각 레이어를 순차적으로 동결하여 만들어집니다. 그런 다음 사이토졸 추출물을 사이클로헥시미드(cycloheximide) 및 클로람페니콜(chloramphenicol)을 함유한 완충액에서 제조하여 사이토졸 및 클로로플라스틱 리보솜을 mRNA에 고정시키고 슈크로스 구배에 로드합니다. 원심분리 후, 초원심분리 튜브를 뚫지 않고 구배의 하단에서 상단까지 6개의 분획을 직접 수집합니다. 수집하는 동안 260nm에서의 흡광도를 지속적으로 판독하여 글로벌 번역 활성의 스냅샷을 제공하는 폴리솜 프로파일을 생성합니다. 그런 다음 분획을 모아 3개의 다른 mRNA 집단을 준비합니다: 폴리솜, 여러 리보솜에 결합된 mRNA; 모노솜, 하나의 리보솜에 결합된 mRNA; 및 리보솜에 결합되지 않은 mRNA. 그런 다음 mRNA를 추출합니다. 이 프로토콜은 애기장대(Arabidopsis thaliana) 묘목 및 성체 식물, 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana), 솔라눔 리코페르시쿰(Solanum lycopersicum) 및 오리자 사티바(Oryza sativa) 잎을 포함한 다양한 식물 및 조직에 대해 검증되었습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

단백질 합성은 모든 세포 하나에 필수적이고 정력적으로 비용이 많이 드는 과정이다. 우선, 세포 변환 기계, 리보솜의 생산 에너지 투자해야한다. 예를 들어 적극적으로 분할 효모 세포는 분당 많은 2,000 리보솜을 생산하고 있습니다. 이러한 생산량은 전체 전사 활성의 60 %로하고, 전지 (2)의 전체 접합 활성의 90 %까지 필요하다. 또한, 에너지는 아미노산, 아미노 아실 tRNA의 결합 펩티드의 합성에 필요하다. 식물, ATP 3 4.5 5.9 분자 펩티드 사슬 비용으로 하나의 아미노산을 첨가. 따라서,이 단백질의 mRNA의 번역은 변화하는 환경 조건을 처리에 관해서 특히, 규정의 주요 사이트 것은 놀라운 일이 아니다.

리보솜을 가진 mRNA의 협회 인 번역의 개시 단계는,의 조절의 주요 표적이다번역 4. 번역의 조정의 결과뿐만 아니라 다른 후 - 전사 조절 단계로서, 단백질 농도의 변화의 40 %의 mRNA의 풍부 5,6- 의해 설명 될 수있다. 따라서, 전체의 mRNA의 연구는 단백질 풍부에 대한 상대적으로 빈약 한 정보를 제공합니다. 반면에, 리보솜과의 mRNA의 협회는 번역에 관련된 사람들의 mRNA에 대한 액세스를 제공함으로써 단백질 풍부에 대한 정보를 얻을 수 있습니다. 적극적 번역의 mRNA는 polysom​​es라는 구조에서 여러 가지 변이와 연관됩니다. 반대로, 제대로 번역의 mRNA는 하나의 리보솜 (monosome)와 연결됩니다. 결과적으로, mRNA의 번역의 리보솜 상태 (7)의 연결을 모니터링함으로써 평가 될 수있다.

이 프로토콜 여섯 일 이전 애기 장대 모종, RNA의 연속적인 분리에서 polysomes의 분리 및 결과의 분석을 설명한다. 포lysom​​es 및 monosomes은 자당 밀도 구배를 통해 분리된다. 그라디언트 여섯 분획으로 수집됩니다. polysom​​es, monosomes 및 변이와 연관되지 않은 자유 60S와 40S 리보솜 서브 유닛과의 mRNA를 포함하는 가벼운 부분 (이하라고 뜨는) : 분획물 중 일부는 세 가지 잘 분리 분획을 얻기 위해 풀링된다. 글로벌 번역 활성 및 polysom​​es 프로파일을 비교하여 곡선 아래의 면적의 적분에 의해 결정된다 polysom​​e / monosome 비율을 생성함으로써 추정 될 수있다. 의 mRNA와 단백질은 다른 분수에서 추출 및 RT-PCR, QRT-PCR, 노던 블롯, 마이크로 어레이, 웨스턴 블롯 또는 단백질 체학에 의한 분석에 사용됩니다. 이 프로토콜은 다른 식물과 조직에 대한 검증되었습니다.

이 프로토콜을 수행하는 데 필요한 장비는 일반적으로 대부분의 실험실에서 발견된다 : 구배 머신은 필요 없다. 다음 하나가되지 않도록 추가하기 전에 각 층을 동결층들 중 하나 또는 혼합 교란들. 어떠한 튜브 뚫음은 구배로 유리 모세관의 침지에 의해 달성 될 수 구배 컬렉션에 사용되지 않는다. 따라서, 고가의 초 원심 분리 튜브 손상을 유지하고 여러 번 재사용 될 수있다. 종합적으로,이 의정서 polysom​​e 프로파일에 대한 쉽고 저렴한 방법합니다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

20 ~ 50 % (w / v)의 자당 그라디언트 1. 준비

주 : 그래디언트 13.2 mL를 초 원심 분리 튜브에 자당의 4 층 (50 %, 35 % 및 20 %의 2 층)으로 만들어진다. 우리의 경험에 의하면, 두 개의 분리 된 층에서 20 %의 자당을 붓는 크게 polysom​​e 제제의 품질을 향상시킵니다.

  1. 주식 솔루션을 준비합니다. 전체 솔루션의 RNAse와 DNase를 무료 있는지 확인합니다.
    1. 400 mM 트리스 - 염산의 pH 8.4, 200 mM의 KCl을 100 밀리미터의 MgCl 2 : 10X 소금 솔루션을 준비합니다.
    2. 200 ml를 들어 1X 소금 솔루션에서 자당 137g을 용해 2 M 자당 솔루션을 준비합니다.
  2. 기울기를 제조 표 1에 기재된 바와 같이, 염 용액에 자당 용액을 희석. 주어진 볼륨은 여섯 그라디언트위한 것입니다.
최종 자당 농도 자당 2M (㎖) 소금 용액 1X (㎖) 최종 권. (㎖)
50 % 8.8 3.2 (12)
35 % 12.9 12.1 (25)
20 % 7.4 17.6 (25)
20 % 5.8 14.2 (20)

표 자당 솔루션 1. 희석 여섯 그라디언트를 준비합니다.

  1. 표 2에 따라 레이어를 따르십시오.
자당 층 50 % 35 % 20 % 20 %
집. (㎖) 1.85 3.65 3.6(5) 1.35

레이어 당 자당 용액의 표 2 권.

  1. 각 층을 붓는 후, -40 ° C에서 튜브를 유지하거나 -80 C의 냉동고 ° 완전 동결 될 때까지 다음 크로스 레이어를 추가하기 전에. 동결 통상 -40 ° C에서 2 시간 후에 달성되지만, 다음 층을 주입하기 전에 약 6 시간을 기다리고 권장한다. 마지막으로 20 %의 층을 동결하거나 실험 일에 새로 첨가 할 수있다.
    참고 : 다음 중 하나를 추가하기 전에 각 레이어를 동결하면 레이어의 혼합 또는 방해에서 방지 할 수 있습니다. 그라디언트는 -40 ° C에 보관하거나 할 수 있습니다 -80 C의 냉동고 ° 최소 6 개월.
  2. 아직 완료되지 않은 경우, 실험 당일 기울기로 최종 20 %의 층을 추가한다. 그 후, 그라디언트가 추운 방이나 냉장고에서 해동 할 수 있습니다.

세포질 추출물 2. 준비

참고 : 우리는 권장 합생물학적 샘플 당 두 그라디언트를 사용하여 종료. 300 mg을 6 일 이전 애기 장대 모종 작업 할 때 두 그라디언트를 준비하는 식물 재료의 최적의 양이다. 이하 병진 활성 조직 작업시 식물 재료의 양은 600 mg을까지 증가 될 수있다.

  1. ½ 무라 시게 및 스쿡에서 재배 수확 육일 된 모종은 8 매체는 액체 질소로 급속 냉동하여 1 % 자당 또는 이에 상응하는 미디어로 보충
  2. 액체 질소와 미리 냉각 박격포와 유 봉에서 분쇄 식물 재료.
  3. 예냉 무게 접시에 가루 물질 300 mg의 무게. 샘플의 해동을 피하기 위해 빨리이 단계를 수행합니다.
    주 : -80 ° C의 냉동고에 더 일주일 이상 냉동 샘플을 보관하십시오.
  4. 분기 미리 냉각 polysome 버퍼의 2.4 ㎖ (소금 솔루션 4 배, 5.26 mM의 EGTA, 0.5 % (v / v)의 옥틸 페녹시 폴리 (에틸렌 옥시) 에탄올, 50 μg.ml -1 사이클로 헥시 미드를 추가, 50 μg.ml 1클로람페니콜) 및 피펫 팁과 혼합하여 균질화. 이 1.5 ml의 튜브에 전송합니다. 온난화에서 샘플을 방지하기 위해 신속하게 작업 할 수 있습니다.
  5. 미세 원심에서 4 ° C에서 15 분 동안 16,000 XG에 원심 분리기 파편 펠렛합니다.
    참고 : 항상 RNA 저하를 방지 4 ° C에서 샘플을 유지하기 위해,의 RNase / DNase의 무료 조건에서의 RNase / DNase의 무료 솔루션 및 작업을 사용합니다. 헤파린은 RNA 보호를 강화하기 위해, 300 μg.ml -1의 최종 농도는 polysome 완충액에 첨가 할 수있다. 그러나, 하류 분석을 방해 할 수 헤파린 때문에, 염화 리튬 석출 대신 에탄올 침전 (참조, 참고 4.7)을 수행하여 RNA를 침전 단계에서 제거 될 것이다.

3. Polysom​​e 프로파일

  1. 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 피펫. 식물 조각이 피펫 된 경우, 단계 2.5를 반복합니다. 부드럽게 pipettin에 의해 그라디언트의 상단에 뜨는로드일정한 스트림 튜브의 측벽 상 g. 각 1.5 ML 튜브에 대해 하나의 그라데이션을 사용합니다.
  2. (A SW41 로터를 사용하는 경우 예를 들어, 32,000 rpm으로) 초 원심 분리기에서 4 ° C에서 2 시간 45 분 동안 175,000 XG에 양동이와 원심 분리기를 예비 냉각에 전송합니다.
  3. 도 1에 기재된 바와 같이 기울기 수집 시스템을 설정한다. 자외선 큐벳은 1mm의 경로 길이를 갖는다.

figure-protocol-1
도 1 그라데이션 수집 시스템. 자외선 큐벳 경사 아래쪽으로 하강 유리 모세관에 폴리 염화 비닐 튜브에 의해 연결된다. 구배 연동 펌프 시스템 덕분으로 진행한다. OD 260 계속 읽기 2 ml의 분수가 수집됩니다. 의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림.

  1. RT에 분수 콜렉터를 조정하고 2 ml의 분수의 수집을 허용 속도로 회전 목마를 설정합니다. 사전 냉각 수집 튜브를 사용합니다.
  2. 그래디언트 수집 시스템에 폴리 염화 비닐 튜브에 의해 접속 된 유리 모세관을 이용하여 아래에서 위로 분획을 수집한다. 폴리 염화 비닐 튜브, 유리 모세관 튜브 사이의 연결을 고정 파라핀 플라스틱 필름을 사용한다.
  3. 그라디언트의 상단에 바닥에서 260 nm에서의 흡광도를 참조하십시오. 전체 기울기가 수집되면, RNA 추출 전에 얼음에 수집 튜브를 배치합니다.

4. RNA 추출

  1. 다음과 같이 원심 분리기 튜브 출장 50 ㎖에 두 그라디언트에서 수집 분수, 수영장 :
    Polysom​​es : 분획 1 내지 3 (12 mL) 중
    Monosomes : 분수 4 (4 ㎖)
    상청액 : 분획 5, 6 (8 mL) 중
  2. 각 부분에, 1 권을 추가합니다. 8 M 구아니딘 히드로 클로라이드,50 μg의 아크릴 캐리어 1.5 VOL. 이소프로판올.
    주 : 아크릴 담체는 알코올 침전 중 핵산의 회수를 향상시키기 coprecipitant로서 사용 선형 아크릴 아미드이다.
  3. 튜브를 반전하여 혼합 및 -20 ° C에서 O / N을 침전.
  4. 초 원심 분리기에서 4 ° C에서 1 시간,의 (a SW32 로터에서 32,000 rpm으로)에 대한 175,000 XG에 원심 분리기. 침전 공정은 초 원심 분리와 호환되지 튜브에서 수행되는 경우, 적합한 관에 옮긴다.
  5. 뜨는을 취소하고 200 μL의 RNA 분해 효소 무료 TE 완충액 (10 mM 트리스 - 염산의 pH 7.5-1 mM의 EDTA)에서 펠렛을 녹인다. 신선한 1.5 ML 튜브로 전송합니다.
  6. 1 권을 추가하여 RNA를 추출합니다. 물 포화 페놀 (PH 6.6) 1 권. 클로로포름 : 이소 아밀 알코올 (24 : 1). 적극적으로 섞는다. 4 ℃에서 20 분 동안 15,000 XG에 원심 분리기. 새로운 1.5 ML 튜브에 수성 단계를 전송합니다.
    주 : 페놀 산 (PH 4.5) DNA의 오염을 최소화하기 위해 사용될 수있다.
  7. 1/10 부피를 첨가하여 RNA를 침전. 3 M 아세트산 나트륨 3 VOL. 100 % 에탄올. -20 ° C에서 20 분 또는 O / N에 대한 -80 ° C에서 침전을 허용합니다. 4 ℃에서 15 분 동안 15,000 XG에 원심 분리기.
    참고 : polysome 버퍼 (참조, 참고 2.5)에 헤파린을 사용하여 제대로 다운 스트림 분석 (9)을 방해 할 수 헤파린의 흔적을 제거하기 위해 에탄올 침전 대신에 염화 리튬 (LiCl을) 침전을 수행합니다. 추출 후, 4 ° C에서 -20 ° C 또는 O / N에서 30 분 동안 침전을 허용 2.5 M.의 최종 농도로하여 LiCl을 추가합니다. 4 ℃에서 15 분 동안 15,000 XG에 원심 분리기.
  8. 500 ㎕를 75 % 에탄올로 펠렛을 씻으십시오. 공기는 건조 된 펠릿을 30 ㎕의 TE 완충액에 용해. RN 아제 (RNase) 자유 1.2 % 아가 로스 겔 (100V, 15 분) 또는 모세관 전기 영동 방법에서 전기 영동에 의해 RNA의 품질을 평가한다.

5. 데이터 분석

  1. 그래픽 및 데이터 분석 소프트웨어를 수출 원시 데이터.
    노트:도 2A 및 B에 도시 된 바와 같이, 원시 정보는 질적 정보를 제공 : 알 수 polysome 피크의 수, monosome 피크의 높이와 자유 리보좀 서브 유닛에 대응하는 어깨의 존재.
  2. 샘플 사이의 프로파일의 비교를 할 수 있도록 프로필을 병합합니다. 각 샘플에 대한 monosome 피크의 X 값을 결정하기 위해 스크린 리더 도구를 사용하여 곡선의 시작 부분에 추가 데이터 포인트를 제거하여 monosome 피크를 정렬. 곡선의 가장 낮은 지점을 확인하고 Y 값 (화면 판독기 도구를 사용)를 결정합니다. 은 "세트 열 값"기능을 사용하여 0에 가장 낮은 지점의 Y 값을 설정합니다.
  3. 원시 정보 (도 3c)의 곡선 아래의 면적을 적분하여 polysomes / monosomes 비율을 결정한다. 지역의 경계가 통합 될 정의 할 데이터 선택 도구를 사용합니다. 그런 다음 통합 기능 (분석 - 수학)를 사용합니다.
  4. 정규화monosome 피크의 정상 회담의 Y 값에 의한 곡선의 모든 데이터 포인트를 분할하여 monosome 피크에 곡선 (화면 판독기 도구를 사용하여 결정). 열을 선택하고 분석 - 수학에서, 표준화를 선택하고 "특정 값으로 나눈"방법을 선택합니다. 이 단계는 polysomes의 상대적 수준 (그림 3D)의 비교를 할 수 있습니다.

figure-protocol-2
그림 2. 대표 polysome 프로필. 애기 장대 야생형이 (중량, 생태형의 골-0) 및 돌연변이 모종 긴 하루 photoperiods (16 시간 빛, 8 시간의 어두운)에서 ½ 무라 시게 및 스쿡 매체에 육일 동안 성장했다. A : 중량 모종 원시 polysom​​e 프로필. B : 돌연변이 모종 원시 polysom​​e 프로필. C : 곡선 D에서 영역의 통합에 의해 polysom​​es 및 monosomes의 비율의 결정 : Polysom​​e PROFI레는 monosome 피크에 정규화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Results

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문헌에서, 정보는 종종 polysom​​e 즉, 위에서 아래로, 기울기가 수집되는 방식의 결과로서 중량 분율로 가벼운 부분에서 도시된다. 여기에 설명 된 프로토콜에 그라디언트 가기 바닥에서 수집되기 때문에, 우리가 보여 프로파일은 무거운 부분합니다 (polysomes)로 시작하고 가벼운 부분 (무료 리보솜 서브 유닛 및 RNA를) (그림 2A)로 이동합니다. 그런 다음 여섯 2ml를 구배 각 분획을 수집하지만 polysom​​e 함량의보다 상세한 분석이 수행되어야한다면 작은 분획을 회수 할 수있다.

병합 및 monosome 피크 (그림 2D)에 곡선을 정상화하는 것은 다른 선이나 성장 조건에서 프로파일의 비교를 할 수 있습니다. 이는 독립적 개시의 수준 polysom​​es의 상대적인 양에 대한 정보...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서 제시하는 프로토콜은 폴리솜 프로파일을 생성하고 폴리솜, 단일 리보솜 또는 리보솜이 없는 mRNA를 분리하는 쉽고 저렴한 방법입니다. 다양한 폴리솜 분획 방법이 문헌에 설명되어 있습니다. 여기에서 설명한 방법은 필요한 화합물만 유지하도록 최적화되었으며 식물 재료에 맞게 조정되었습니다. 특히, 세제11 의 양을 줄이고 클로람페니콜을 완충액에 첨가하여 엽록수성 리보솜을 mRNA에 고정시켰습니다(사이클로헥시미드가 세포질 리보솜에 대해 하는 것처럼)12 . 또한 총 초원심분리 시간도 단축했습니다7.

고품질 폴리솜 프로파일을 얻으려면 새로 채취한 식물 재료를 사용하고 모든 단계를 4°C에서 수행하는 것이 필수적입니다. 번역 활성이 낮은 조직을 사용할 때 더 많은 식물 물질이 구배에 로드될 수 있습니다(최대 600mg).

폴리솜 프로파일의 분석은 세포13 ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 것이 없습니다

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 프랑스 국립 연구 기관 (ANR-14 CE02-0010)에 의해 지원되었다. 우리는 원고의 중요한 읽기 박사 벤자민 필드 박사 엘로 디 Lanet 감사합니다. 우리는 비디오 편집과 그의 도움 씨 미셸 테 레스 감사합니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
초원심분리기 튜브, thinwall, 폴리알로머 - 13.2 mlBeckman Coulter331372
초원심분리 튜브, thinwall, 폴리알로머 - 38.5 mlBeckman Coulter326823
유리 모세관Drummond Scientific1-000-1000
초원심분리기 Beckman CoulterOptima 시리즈
초원심분리기 로터 SW41Beckman Coulter331362
초원심분리기 로터 SW32Beckman Coulter369650
연동 펌프Any
Tygon R3607 폴리비닐 클로라이드 튜빙 Fisher Scientific070534-22폴리비닐 클로라이드 튜빙, 2.29 mm 
분획 분취기: Model 2110Bio-Rad731-8120
UV 큐벳Hellma170.700-QS,석영 플로우 스루 큐벳
UV 분광 광도계, VarianCary500.0125초마다 판독
모든 화학 물질분자생물학 등급
Murashige 및 Skoog 기초염 혼합물(MS)Sigma-AldrichM5524
Rnase-Free 물모든
페트리 접시Fisher Scientific10083251 
옥틸 페녹시 폴리 (에틸렌 옥시) 에탄올, 분 지형 (Nonidet P40)EuromedexUN3500
선형 아크릴 아미드 (아크릴 담체)ThermoFischer scientificAM9520RNA 침전 담체
OriginPro 8OriginLab분석 소프트웨어
, , , , , , , , :

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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