이 프로토콜은 결합된 리보솜의 수를 기준으로 식물 조직에서 전사체를 추출하고 분획하는 쉬운 방법을 설명합니다. 이를 통해 translation activity의 전반적인 추정치와 특정 mRNA의 translational status 결정을 수행할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
mRNA를 단백질로 번역하는 것은 기본적이고 고도로 조절되는 생물학적 과정입니다. 폴리솜 프로파일링은 번역 조절 분석을 위한 황금 표준으로 간주됩니다. 여기에 설명된 방법은 다양한 식물 조직에서 폴리솜을 분별하는 쉽고 경제적인 방법입니다. 자당 그라디언트는 그래디언트 메이커 없이 각 레이어를 순차적으로 동결하여 만들어집니다. 그런 다음 사이토졸 추출물을 사이클로헥시미드(cycloheximide) 및 클로람페니콜(chloramphenicol)을 함유한 완충액에서 제조하여 사이토졸 및 클로로플라스틱 리보솜을 mRNA에 고정시키고 슈크로스 구배에 로드합니다. 원심분리 후, 초원심분리 튜브를 뚫지 않고 구배의 하단에서 상단까지 6개의 분획을 직접 수집합니다. 수집하는 동안 260nm에서의 흡광도를 지속적으로 판독하여 글로벌 번역 활성의 스냅샷을 제공하는 폴리솜 프로파일을 생성합니다. 그런 다음 분획을 모아 3개의 다른 mRNA 집단을 준비합니다: 폴리솜, 여러 리보솜에 결합된 mRNA; 모노솜, 하나의 리보솜에 결합된 mRNA; 및 리보솜에 결합되지 않은 mRNA. 그런 다음 mRNA를 추출합니다. 이 프로토콜은 애기장대(Arabidopsis thaliana) 묘목 및 성체 식물, 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana), 솔라눔 리코페르시쿰(Solanum lycopersicum) 및 오리자 사티바(Oryza sativa) 잎을 포함한 다양한 식물 및 조직에 대해 검증되었습니다.
서론
단백질 합성은 모든 세포 하나에 필수적이고 정력적으로 비용이 많이 드는 과정이다. 우선, 세포 변환 기계, 리보솜의 생산 에너지 투자해야한다. 예를 들어 적극적으로 분할 효모 세포는 분당 많은 2,000 리보솜을 생산하고 있습니다. 이러한 생산량은 전체 전사 활성의 60 %로하고, 전지 (2)의 전체 접합 활성의 90 %까지 필요하다. 또한, 에너지는 아미노산, 아미노 아실 tRNA의 결합 펩티드의 합성에 필요하다. 식물, ATP 3 4.5 5.9 분자 펩티드 사슬 비용으로 하나의 아미노산을 첨가. 따라서,이 단백질의 mRNA의 번역은 변화하는 환경 조건을 처리에 관해서 특히, 규정의 주요 사이트 것은 놀라운 일이 아니다.
리보솜을 가진 mRNA의 협회 인 번역의 개시 단계는,의 조절의 주요 표적이다번역 4. 번역의 조정의 결과뿐만 아니라 다른 후 - 전사 조절 단계로서, 단백질 농도의 변화의 40 %의 mRNA의 풍부 5,6- 의해 설명 될 수있다. 따라서, 전체의 mRNA의 연구는 단백질 풍부에 대한 상대적으로 빈약 한 정보를 제공합니다. 반면에, 리보솜과의 mRNA의 협회는 번역에 관련된 사람들의 mRNA에 대한 액세스를 제공함으로써 단....
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프로토콜
20 ~ 50 % (w / v)의 자당 그라디언트 1. 준비
주 : 그래디언트 13.2 mL를 초 원심 분리 튜브에 자당의 4 층 (50 %, 35 % 및 20 %의 2 층)으로 만들어진다. 우리의 경험에 의하면, 두 개의 분리 된 층에서 20 %의 자당을 붓는 크게 polysome 제제의 품질을 향상시킵니다.
- 주식 솔루션을 준비합니다. 전체 솔루션의 RNAse와 DNase를 무료 있는지 확인합니다.
- 400 mM 트리스 - 염산의 pH 8.4, 200 mM의 KCl을 100 밀리미터의 MgCl 2 : 10X 소금 솔루션을 준비합니다.
- 200 ml를 들어 1X 소금 솔루션에서 자당 137g을 용해 2 M 자당 솔루션을 준비합니다.
- 기울기를 제조 표 1에 기재된 바와 같이, 염 용액에 자당 용액을 희석. 주어진 볼륨은 여섯 그라디언트위한 것입니다.
| 최종 자당 농도 |
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결과
문헌에서, 정보는 종종 polysome 즉, 위에서 아래로, 기울기가 수집되는 방식의 결과로서 중량 분율로 가벼운 부분에서 도시된다. 여기에 설명 된 프로토콜에 그라디언트 가기 바닥에서 수집되기 때문에, 우리가 보여 프로파일은 무거운 부분합니다 (polysomes)로 시작하고 가벼운 부분 (무료 리보솜 서브 유닛 및 RNA를) (그림 2A)로 이동합니다. 그런 다음 여섯 2ml를 구배 각 분획을 수집하지만 polysome 함량의보다 상세한 분석이 수행되어야한다면 작은 분획을 회수 할 수있다.
병합 및 monosome 피크 (그림 2D)에 곡선을 정상화하는 것은 다른 선이나 성장 조건에서 프로파일의 비교를 할 수 있습니다. 이는 독립적 개시의 수준 polysomes의 상대적인 양에 대한 정보.......
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토론
여기에서 제시하는 프로토콜은 폴리솜 프로파일을 생성하고 폴리솜, 단일 리보솜 또는 리보솜이 없는 mRNA를 분리하는 쉽고 저렴한 방법입니다. 다양한 폴리솜 분획 방법이 문헌에 설명되어 있습니다. 여기에서 설명한 방법은 필요한 화합물만 유지하도록 최적화되었으며 식물 재료에 맞게 조정되었습니다. 특히, 세제11 의 양을 줄이고 클로람페니콜을 완충액에 첨가하여 엽록수성 리보솜을 mRNA에 고정시켰습니다(사이클로헥시미드가 세포질 리보솜에 대해 하는 것처럼)12 . 또한 총 초원심분리 시간도 단축했습니다7.
고품질 폴리솜 프로파일을 얻으려면 새로 채취한 식물 재료를 사용하고 모든 단계를 4°C에서 수행하는 것이 필수적입니다. 번역 활성이 낮은 조직을 사용할 때 더 많은 식물 물질이 구배에 로드될 수 있습니다(최대 600mg).
폴리솜 프로파일의 분석은 세포13 .......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다
감사의 글
이 작품은 프랑스 국립 연구 기관 (ANR-14 CE02-0010)에 의해 지원되었다. 우리는 원고의 중요한 읽기 박사 벤자민 필드 박사 엘로 디 Lanet 감사합니다. 우리는 비디오 편집과 그의 도움 씨 미셸 테 레스 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 초원심분리기 튜브, thinwall, 폴리알로머 - 13.2 ml | Beckman Coulter | 331372 | |
| 초원심분리 튜브, thinwall, 폴리알로머 - 38.5 ml | Beckman Coulter | 326823 | |
| 유리 모세관 | Drummond Scientific | 1-000-1000 | |
| 초원심분리기 | Beckman Coulter | Optima 시리즈 | |
| 초원심분리기 로터 SW41 | Beckman Coulter | 331362 | |
| 초원심분리기 로터 SW32 | Beckman Coulter | 369650 | |
| 연동 펌프 | Any | ||
| Tygon R3607 폴리비닐 클로라이드 튜빙 | Fisher Scientific | 070534-22 | 폴리비닐 클로라이드 튜빙, 2.29 mm |
| 분획 분취기: Model 2110 | Bio-Rad | 731-8120 | |
| UV 큐벳 | Hellma | 170.700-QS, | 석영 플로우 스루 큐벳 |
| UV 분광 광도계 | , Varian | Cary50 | 0.0125초마다 판독 |
| 모든 화학 물질 | 분자생물학 등급 | ||
| Murashige 및 Skoog 기초염 혼합물(MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| Rnase-Free 물 | 모든 | ||
| 페트리 접시 | Fisher Scientific | 10083251 | |
| 옥틸 페녹시 폴리 (에틸렌 옥시) 에탄올, 분 지형 (Nonidet P40) | Euromedex | UN3500 | |
| 선형 아크릴 아미드 (아크릴 담체) | ThermoFischer scientific | AM9520 | RNA 침전 담체 |
| OriginPro 8 | OriginLab | 분석 소프트웨어 |
참고문헌
- Nelson, C. J., Millar, A. H. Protein turnover in plant biology. Nat Plants. 1 (3), 15017(2015).
- Warner, J. R. The economics of ribosome biosynthesis in yeast. Trends Biochem Sci. 24 (11), 437-440 (1999).
- Amthor, J. S.
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