이식 반응 면역을 억제하는 조절 성 마크로파지의 기능적 특성 규명

Summary

대 식세포는 방어 면역과 항상성에 결정적인 역할을하는 조혈 시스템의 플라스틱 세포입니다. 이 보고서에서 우리는 관용적 조건 하에서 이식 장기에 축적되는 이식편 침윤 조절 macrophage를 표현형 및 기능적으로 특성화하기 위해 최적화 된 시험 관내 기술을 설명합니다.

Abstract

이식 장기의 대 식세포 축적은 동종 이식 거부 ¹ 의 특징으로 오래 동안 인식되어왔다. 면역 원성 단핵구는 이식 후 조기에 동종 이식종에 침투하고, 이식 장기에 대한 이식편 반응 반응을 일으키며 장기 거부 반응을 시작합니다 ² . 최근 데이터는 억제 성 대 식세포가 장기 이식 성공을 촉진하고 이식 내성의 유도에 필요하다는 것을 시사한다. 이것은 macrophage 기능의 분리 및 분석을위한 새로운 로드맵을 요구하는 macrophage ontogeny, activation 및 function의 다차원 개념을 제안합니다. 대 식세포의 소성 때문에 조직 환경에 따라 대 식세포를 분리하고 특성화하는 방법론을 제공하고 여러 시나리오에 따라 기능을 정의해야합니다. 여기, 우리는 descri이식편 침윤성 대 식세포의 면역 특성 규명 및 우리가 기능적으로 CD8 ⁺ T 증식을 억제 하고 체외에서 CD4 ⁺ Foxp3 ⁺ Treg 확장을 촉진시키는 능력을 기능적으로 평가하는 데 사용한 방법이 될 수 있습니다.

Introduction

이 프로토콜은 T 세포 반응을 조절하는 능력에 따라 심장 동종 이식으로부터 격리 된 조직 침윤성 대 식세포의 기능을 연구하기위한 시험 관내 기술을 기술한다. 문헌에 널리 기술되어 있듯이, 형광 세포 추적 염료는 유세포 분석과 함께 체외 및 특정 생체 내 특정 세포 유형 의 억제 기능을 연구하는 강력한 도구 입니다. 우리의 프로토콜 은 체외에서 림프구 증식을 모니터링하기 위해 carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) 방법을 따른다.

CFSE로 표지 된 세포가 분열하면 그 자손은 카르복시 플루 오레 신 표지 분자의 수의 절반을 얻습니다. 유동 세포 계측법에 의한 세포 형광의 감소는 T 세포 면역 반응을 조절하는 억제 성 대 식세포의 능력을 모니터링하는 세포 분열을 평가하는데 사용될 수있다. CFSE는 플루 오레 신계 염료이기 때문에 br다량의 유동 세포 계측법에 적용 할 수있는 다른 형광 크로마토 그래피의 범위를 제공합니다. phenotyping을위한 fluorochromes의 적절한 선택은 과도한 스펙트럼의 중복과 항원 양성 세포, 특히 CFSE ⁷ 와 같은 가시 ....

Protocol

이 연구에서 쥐는 미국 농무성 지침 및 실험 동물의 관리 및 사용을위한 보건 서비스 안내서의 권고에 따라 보관됩니다. 동물 실험과 관련된 모든 실험 기술은 Mount Sinai School of Medicine의 IACUC (Institutional Animal Care and Utilization Committee) 승인 프로토콜에 따라 수행되었습니다.

1. 미디어 준비

1. 2 MM L - 글루타민, 1 MM 나트륨 피루 베이트, 0.1 MM 비 필수 아미노산, 5 MM HEPES 및 0.05 MM 2를 사용하여 10 % FBS와 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (10,000 U / ML)와 완전한 RPMI 1640 매체를 준비 - 머 캅토 에탄올.

2. 동종 이식 및 단일 세포 현탁액

참고 : 폐동맥과 하대 정맥 정맥의 이식 및 문합 기법은 Corry와 공동 작업자에 의해 처음 설명되었으며 Liu & Kang에서 시각화 할 수 있습니다s = "xref"> 10 ^{, 11} ( 그림 1A ).

1. 유도 챔버에서 4-5 % iso....

Results

대표적인 결과는 위의 프로토콜에 설명 된 게이팅 전략을 보여줍니다. 결과는 또한 이식편 - 침투 대 식세포와의 공 - 배양 후 T- 세포 증식 활성의 분석을 나타낸다. 그림 4 에서 대 식세포 하위 집합의 체외 억제 능력을 분석했습니다. 결과는 용인 된 수용자로부터 얻은 Ly6C ^lo Ly6G ^- 대 식세포가 억압 적이라는 것을 나타낸다. 결과는 또한 Ly6C ^int Ly6G ⁺ 세포가 완만 한 억제 능력을 나타낸다는 것을 나타낸다. Ly6C ^lo Ly6G ^- 세포 만이 체외에서 CD4 ⁺ Foxp3 ⁺ Treg의 확장을 촉진했다. 함께, 이식편 - 침투 CD11b ⁺ Ly6C ^lo Ly6G ^- macropha.......

Discussion

이 프로토콜은 심장 이식의 실험 쥐 모델에서 이식편 - 침윤 골수 세포 서브 세트를 면역화하는 데 사용한 방법을 기술하며, 이는 다른 쥐 실험 모델의 다른 조직에도 적용 가능합니다. 20 psi에서의 저압 셀 분류는 순수한 셀 하위 집합의 좋은 수율을 격리하는 데 선호되는 방법이었습니다. 각 골수 하위 집합의 순도를 유지하는 것은 다른 골수 집단 사이의 억제 능력의 결정적인 결과를 확립하는 데 중요합니다. 그러나, 상업적 농축 키트와 같은 다양한 백혈구 집단의 분리를 위해 다른 방법이 사용될 수있다. 관심있는 세포 집단과 관계없이 최적의 표면 염색 및 유동 세포 계측 결과를 얻기 위해서는 이식 조직에서 생존 가능한 단일 세포 현탁액을 얻는 것이 필요합니다. 부정확 한 조직 조작은 세포 손실을 초래할 수 있으며 따라서 골수량 하위 집합의 낮은 수율을 초래할 수 있습니다. 수율을 높이려면 샘플을 처리해야합니다.차가운 버퍼를 노래하고 낮은 세포 부착 (폴리 프로필렌 튜브)과 용기에 세포를 유지합니다. 이 프로토콜에서 우리는 .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 미디어	라이프 테크놀로지	11875119
10% FBS	라이프 테크놀	26140-079
1,000x 2-메르토에탄올	라이프 테크놀	21985023
100x 펜/스트렙	라이프 테크놀	15140122
100x L-글루타민	라이프 테크놀	25030081
100x Non Esential 아미노산	Corning	25025039
1 M HEPES 완충액	Corning	25060CL
100 mM 피루브산 나트륨	ThermoScientific	SH30239.01
페니실린/스트렙타비딘	ThermoScientific	15140122
콜라겐 A	Roche	70381322
DPBS (칼슘 및 칼슘 없음) 마그네슘)	Corning	21031CV
70 µ m 세포 여과기	Fisher	22363548
ACK 용해 버퍼	Life Technologies	A10492-01
DAPI	Sigma	32670-5mg-F
CFSE-FITC	Invitrogen	C34554
Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28	Life Technologies	11452D
96 well  U-바닥판	Corning	353077
항체:
anti-Ly6C-APC	eBioscience	175932-80
anti-Ly6G-Pe/Cy7	Biolegend	127617
anti-CD11b-Percp/Cy5.5	eBioscience	45011282
anti-CD45-APC/Cy7	eBioscience	47045182
anti-CD4-APC	eBioscience	17004181
anti-CD8-P/ Cy7	eBioscience	25008181
LSRII 플로우 사이토미터	BD Bioscience
FACSDiva Software	BD Bioscience
C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J	잭슨 연구소	008374
C57BL/6	잭슨 연구소	000664
Balb/c	잭슨 연구소	000651