대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF) 분화된 인간 단핵구 유래 대식세포의 세포 배양을 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜은 대식세포로의 벌크 분화와 결합된 단핵구의 동결 보존을 활용합니다. 그런 다음 수확된 대식세포를 실험 수행에 필요한 세포 밀도의 배양 웰에 파종할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF) 분화된 인간 단핵구 유래 대식세포의 세포 배양을 위한 프로토콜이 제시됩니다. 실험을 시작하기 위해 신선 또는 냉동 단핵구를 M-CSF로 플라스크에서 1주일 동안 배양하여 대식세포로의 분화를 유도합니다. 그런 다음 대식세포를 수확하여 실험 수행에 필요한 세포 밀도의 배양 웰에 파종할 수 있습니다. 실험을 위한 대식세포 배양을 시작하기 위해 정의된 수의 단핵구가 아닌 정의된 수의 대식세포를 사용하면 원하는 세포 밀도를 보다 일관되게 달성할 수 있는 대식세포 배양을 얻을 수 있습니다. 동결 보존된 단핵구를 사용하면 공여자 가용성에 대한 의존도가 줄어들고 보다 균일한 대식세포 배양이 생성됩니다.
서론
배양된 대식세포에 대한 연구는 죽상경화성 플라크에서 발생하는 것과 같은 염증에서 이러한 세포의 기능을 이해하는 데 유용한 모델입니다. 연구의 초점이 대식세포와 관련된 인간 질병에 맞춰져 있는 경우, 종 차이를 피하기 위해 인간이 아닌 대식세포보다는 1차 인간 대식세포를 연구하는 것이 유용합니다. 또한, 세포 형질전환의 영향은 대식세포 세포주보다는 1차 대식세포를 사용함으로써 피할 수 있습니다. 이러한 목적을 위해, 인간의 혈액에서 분리된 단핵구와 구별된 대식세포는 1차 인간 대식세포를 얻는 수단으로 사용됩니다.
조직 대식세포는 조직 내에 상주할 수도 있고, 조직으로 이동하여 대식세포로 분화하는 단핵구에서 유래할 수도 있습니다 1. 인간 단핵구 유래 대식세포의 두 가지 유형이 정의되었으며, 이는 형태뿐만 아니라 유전자 발현 및 세포 기능에서도 차이가 있습니다 2. 이 두 가지 유형은 M-CSF + 소태아혈청(FBS)이 존재할 때 대식세포로 분화된 단핵구와 과립구-대식세포 집락자극인자(GM-CSF) + FBS 2-6이 존재할 때 대식세포로 분화된 단핵구에서 얻을 수 있습니다. 우리의 경험(미발표 관찰)에 따르면, FBS가 아닌 인간 혈청을 사용하면 M-CSF 또는 GM-CSF가 분화 배....
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프로토콜
백혈구 성분 채집은 보건 기관 검토위원회의 국립 연구소의 승인을 인간 대상의 연구 프로토콜에 따라 수행 하였다.
1. 분리 및 단핵구의 냉동 보존
- 인간의 기증자의 백혈구 성분 채집하여 단핵 세포를 확보하고, 참고 문헌 7,8에 설명 된대로 단핵 세포의 연속 역류 원심 분리 세광에 의해 단핵구을 풍부. 제조자가 지정한 세광 버퍼 - (90 % 단핵구 약 80) 약 100 × 106 씻겨져 걸러진 세포를 얻습니다. 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다.
- 300 XG에 15 ml의 폴리 프로필렌 튜브에 원심 분리기 단핵구 실온에서 5 분간.
- 최종 90 % FBS / 10 % 디메틸 술폭 시드 농도 50 × 106 세포 / ml를 달성하는 디메틸 술폭 시드 이어 FBS에서 세포를 재현 탁 조심스럽게 상층 액을 제거하고.
- 세포 현탁액의 t의 각 ML을 추가개인 cryovial을 오.
- 셀 냉동 컨테이너에 배치 크리오 바이알 (cryovial)로 전송하고 -80 ° C의 냉동고에 24 시간 동안의 장기 저장을 위해 액체 질소 cryovial 저장 탱크로 전환하기 전에.
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결과
트리 판 블루 (9) 염색으로 결정 신선 또는 냉동 보존 단핵 세포의 생존 도표 1. 95 % 이상이고 그림 2는 낮은과 높은 배율에서 비교, 각각 식세포에 신선하고 냉동 보관 (즉, 냉동) 단핵구의 분화의 진행. 냉동 보관 단핵구 확산하지만 반올림 남아 있지 않습니다 단핵 세포를 분화의 모집단을 보여와 신선한 비교합니다. 상 - 루슨트의 공포는 두 조건에서 단핵구 유래 대 식세포에서 발생한다. 이전 10, 11 설명 된대로이 액포는 M-CSF 형 식세포의 macropinosomes 특성을 나타냅니다.
그들은 단핵 세포에서 분화 된의 플라스크에서 자신의 수확 후 Cryopreserving 대 식세포는 (성공 식세포 .......
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토론
정의 식세포 유형을 생성하는 대 식세포 생물학을 연구 할 때 조사자에 의해 얻어진 결과가 충돌의 일부를 명확하게 할 수있다. 다양한 배양 조건 및 분화 인자의 사용은 차 인간 대 식세포는 아주 다른 식세포 타입을 초래할 수 연구자에 의해 인식되지 않을 수있는 점을 생성한다. 예를 들어, 대 식세포는 때때로 어떤 혈청, 인간 혈청 형, FBS 만 M-CSF, 또는 M-CSF 또는 GM-CSF를 함유 FBS 보충 된 인간 혈청을 사용하지 않고, 인간 단핵 세포에서 생성된다. 이전에보고 우리가 관찰 한 바와 같이, 단핵구 3 가능한 남아 있지 않은 추가 분화 인자없이 FBS 혈청없이 또는 함께 일주일 동안 배양로. 전술 한 바와 같이, 단핵구는 단독으로 인간 혈청 배양 또는 FBS 플러스 GM-CSF로 분화 단핵구의 "튀김 달걀"형태 특성을 보여 식세포를 생성 M-CSF로 보충. 따라서, 인간 혈청 M-의 존재단핵 세포는 M-CSF로 분화되었다하더라도 더 긴 형태를 도시 CSF 형 식세포는 얻어.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
미국 국립보건원(National Institutes of Health) 임상 센터 수혈 의학과(Department of Transfusion Medicine, Clinical Center, Clinical Center)에서 용출 단핵구를 제공했습니다. 이 연구는 국립보건원(National Institutes of Health)의 국립심장폐혈액연구소(National Heart, Lung, and Blood Institute)의 교내 연구 프로그램(Intramural Research Program)의 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Cellbind 12-well 배양 플레이트 | Corning | 3336 | |
| CELLSTAR, T-75 플라스크, 조직 배양 처리 | Greiner Bio-One North America | 658157 | |
| RPMI 1640 배양 배지 | Cellgro Mediatech | 15-040-CM | 37°C로 예열; C |
| L-글루타민 | Cellgro Mediatech | 25-005-CI | |
| 태아 소 세럼 | Gibco | 16000-036 | |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| DMSO | 시그마 | D2650 | |
| Cryovial | 써모 사이언티픽 | ||
| Ca2+ 및 Mg2+ 없이 DPBS를 375418 | 코닝 cellgro | 21-031-CV | |
| 0.25% 트립신-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 50ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브 | Falcon | 352070 | |
| Trypan Blue | Lonza | 17-942E | |
| Neubauer 개선 밝은 광 혈구계 | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 610031 | http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html |
| CoolCell LX 세포 동결 | 컨테이너 BioCision | BCS-405 | 다른 냉동 컨테이너도 이 단계에 적합해야 합니다 |
| 액체 질소 저장 시스템, CryoPlus 1 | Thermo Scientific | 7400 | 모든 액체 질소 탱크가 적절해야 합니다. |
참고문헌
- Dey, A., Allen, J., Hankey-Giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation: blood monocytes versus tissue macrophages. Front. Immunol. 5, 683(2014).
- Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages ....
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재인쇄 및 허가
