방법 논문

간단한 유세포 방법은 전체 혈액에서 단핵구 부분 집단에 대한 당 흡수 및 포도당 운송업자 발현을 측정하는

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DOI:

10.3791/54255

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2016년 8월 12일

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Biomedical Research, Macfarlane Burnet Institute for Medical Research and Public Health, 2Department of Infectious Diseases, Monash University, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Melbourne, 4Department of Microbiology, The University of the West Indies, 5Division of Experimental Medicine, Department of Medicine, University of California, San Francisco, 6Department of Medicine, Monash University

이 논문에서

요약

단핵구는 활성화될 때 해당작용 대사에 의존하는 인간 선천성 면역 체계의 필수 구성 요소입니다. 우리는 신선한 전혈에서 총 단핵구 및 단핵구 하위 집단에 의한 포도당 수송체 발현 및 포도당 흡수를 측정하기 위한 유세포 분석 프로토콜을 설명합니다.

초록

단핵구 특정 만성 염증성 질환과 관련된 병원균과 염증에 의해 활성화 될 수있는 선천성 면역 세포이다. 단핵구의 활성화는 이펙터 기능과 향상된 글루코오스 트랜스 포터의 발현을 수반하는 산화 당분 해 대사에서 수반하는 변화를 유도한다. 이 증가 당분 대사는 훈련 된 단핵 세포의 면역 선천성 면역 메모리의 형태로 관찰된다. 단핵 세포에 의해 글루코스 수송 체 발현 및 당 흡수 검사 관내 프로토콜을 설명 하였지만, 없음은 전혈 세포 계측법 다중 파라미터 플로우에 의해 관찰되지 않았다. (중간체 (CD14 ++ CD16 +) 및 비 - 고전 - 우리는 전체 단핵구 및 고전 (CD14 ++ CD16)에 의해 전혈 형광 글루코오스 유사체 2-NBDG 흡수의 측정을위한 다중 파라미터 유세포 프로토콜을 설명 CD14 + CD16 ++) 단핵구소집단. 이 방법은 항상성 및 염증성 질환 중 총 단핵 세포 및 단핵 세포 개체군에 대한 글루코스 수송 체 발현 및 당 흡수를 조사하는데 사용될 수 쉽게 혈액 내의 다른 백혈구 및 백혈구 개체군에 대한 당 흡수를 조사하기 위해 수정 될 수있다.

서론

단핵구는 빠르게 감염과 염증 하나의 사이트로 동원 된 인간의 선천성 면역 시스템의 주요 구성 요소입니다. 단핵 세포의 활성화는 병원체에 의한 급성 손상을 제한하기위한 중요하며 또한 죽상 동맥 경화증 2, 암 3, HIV 4,5 등 여러 가지 만성 질환의 발병 기전의 핵심입니다.

휴식 활성화 단핵 세포의 신진 대사는 당분 대사를 (즉, 포도당의 발효 락트합니다)를 이용 산화 대사를 이용하여 휴식 단핵 세포 활성화 단핵 세포와 크게 다르다 6. 단핵 세포의 활성화는 당분 대사 7 증가 포도당 흡수를 허용 포도당 수송 체의 발현을 유도한다. 단핵구 포도당 수송 1 (GLUT1)의 활성화 중에 상향 조절 하나의 수송과 그 표현은 절에서 염증성 사이토 카인의 생산으로 이어질 것으로 나타났다itro 비만 쥐 (8)의 지방 조직입니다. 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스에 의한 단핵구 세포 라인의 감염 GLUT1 9의 휴대 상향 조절로 연결, 우리는 최근에 만성 HIV 감염시 GLUT1 발현 단핵 세포의 증가 비율이 치료와 함께 항 레트로 바이러스 치료 처리 감염 10시 존재하는 것으로 나타났다. 함께 찍은, 이러한 연구는 포도당 흡수 및 단핵 세포에 의한 당분 대사가 많은 염증성 질환의 중요한 측면이라는 것을 보여줍니다. 따라서, 간단한 방법 항상성 동안 단핵구 GLUT1 발현 당 흡수를 측정하고 염증성 질환 연구의 광범위에 유용 할 것으로 예상된다.

인간 단핵구의 세포 표면 마커 CD14 및 CD16 발현 (11, 12)의 차동에 의해 검사 될 수있는 세 개의 서로 다른 서브 세트들로 구성되는 이종이다. 클래식 단핵 세포는 CD14 높은 수준의 표현하지만 CD를 표명하지 아니합니다16 (CD14 ++ CD16은 -), 중간 단핵구는 CD14의 높은 수준 및 CD16 (CD14 + CD16 +)의 중간 레벨 및 단핵구는 CD14의 로우 레벨과 CD16의 높은 레벨을 발현 비 고전적 (CD14을 발현 + CD16 ++). CD16을 표현 단핵구는 CD16에 비해 CD16 + 단핵 세포를 불린다 - 단핵구 높은 염증성 사이토 카인의 발현과 기능을보다 효율적으로 존재하는 항원 (13, 14)에 있습니다. 단핵 세포의 약 10 %는 염증 15 일 동안 관찰 높은 비율과 항상성 동안 CD16를 표현한다. 단핵 세포 개체군은 특정 질병 상태와 관련된 질병과 질병의 진행 (16)의 유용한 생물 마커 될 수 있습니다.

우리의 목표는 PHY에 가까운 조건에서 인간 단핵 세포와 단핵구 소집단에 의한 포도당 수송 체의 발현과 포도당 흡수를 측정 할 수있는 방법을 확인하는 것이 었습니다가능한 한 siological 조건. 이러한 방법은 생리적 조건 (19)에 비해 단백질 발현을 변경 한 수 절연 단핵구를 조사하더라도 이전의 연구는, 단구 글루코스 수송 체 발현 및 당 흡수 17,18을 측정하고, 더 이전의 연구는 인간 단핵 세포 개체군을 조사하지 않았다. 계측법 다중 파라미터의 흐름을 이용하여, 총 단핵 세포 및 단핵 세포 개체군에 의해 형광 글루코오스 유사체 2-NBDG 글루코오스 트랜스 포터의 발현 및 흡수를 검사하는 방법을 설명하는 전체 조작되지 혈액 내 (CD14 및 CD16의 발현에 기초하여).

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프로토콜

참고 : HIV 감염과 HIV-감염되지 않은 과목은 멜버른, VIC, 호주에서 알프레드 병원에서 감염증 단위에서 모집하고, 각각 지역 사회에서했다. 동의서는 모든 참가자로부터 얻은 것, 그리고 연구는 알프레드 병원 연구 윤리위원회에 의해 승인되었다.

단핵구와 단핵구 부분 집단 1. GLUT1 세포 표면 감지

  1. 구연산 ACD-B 항 응고 튜브에 혈액을 수집하고 수집의 1 시간 내 생물 안전 캐비닛에 실험을 시작한다.
  2. 폴리 프로필렌 튜브에 혈액 100 μl를 추가합니다. 얼음에, 피펫 부드럽게 혼합하면서 솔루션을 용균 1 배 2 ㎖를 추가 튜브 (재료 표 참조). 얼음에 15 분 동안 품어. 5 분 동안 220 XG에 원심 분리기.
  3. 따르다 약 2-4 ml의 세척액 (1X PBS에서 0.5 % BSA)을 첨가하고 5 분 동안 220 × g으로 원심 분리하여 두 번 세척 하였다.
  4. 파이프를 사용하여TTE 신중 가능한 세정 용액만큼 제거한다. 장소 튜브는 얼음에 세척 용액 100 μL에 다시 일시 중지합니다.
  5. 5 ㎕를 항 CD3-PE, 5 ㎕의 항 CD14-APC, 5 ㎕의 항 CD16-PECy7, 5 μL의 GLUT1 : 특정 단핵 세포 개체군 단계 1.4에서 제조 된 세포 현탁액 μL에 100 개의 항체의 다음 볼륨 세포를 염색 확인하려면 -FITC 또는 IgG2b에-FITC (이소 제어 튜브).
  6. 어둠 속에서 30 분 동안 얼음에 놓습니다. 세척 용액으로 2 회 반복한다. 1X PBS에서 만든 0.5 %의 포름 알데히드 200 ~ 300 μL로 수정합니다.
  7. 다음 여기 및 방출 파장 내에서 24 시간 내에 4 가지 색상을 검출 할 수있는 사이토 흐름 분석 (633, 660) 10 FITC (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC를.

단핵구 2. 당 흡수

  1. 혈액의 피펫 90 μl의 폴리 프로필렌 튜브의 단계 1.1에서 수집. 14.60 μM 2 NBDG 작업 용액 10 μL에 추가90 혈액의 μL (1.46 mM의 최종 농도)와 영화는 가볍게 혼합한다. 이 알루미늄 호일로 피복함으로써 튜브 광 -2- NBDG 노출을 제한하는 것이 중요하다.
  2. 15 ~ 30 분 동안 어둠 속에서 37 ° C에서 품어 후 즉시 얼음에 놓습니다. 얼음 동안 튜브에 솔루션을 용균 1 배 FACS의 4 ML을 추가합니다. 4 220 XG에 원심 분리기 5 분 동안 C를 °.
  3. 세척액 (1X PBS에서 0.5 % BSA) 4 mL를 첨가 한 번 씻는다. 4 220 XG에 원심 분리기 5 분 동안 C를 °. 가만히 따르다과 얼음에 장소.
  4. 항체와 얼룩 세포 : 5 ㎕를 항 CD3-PE, 5 ㎕의 항 CD14-APC 5 ㎕의 항 CD16-PECy7. 믹스와 어둠 속에서 30 분 동안 얼음에 배치합니다.
    참고 :이 기간 동안 흐름이 사이토 즉각적인 분석을위한 준비가되어 있는지 확인합니다. 다음 여기 및 방출 파장 내에서 세포를 획득 : 2 NBDG (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660).
  5. 튜브에 얼음 차가운 세척 버퍼 (1X PBS에서 0.5 % BSA)의 4 ML을 추가합니다.4에서 220 XG에 원심 분리하여 한 번 씻으 5 분 동안 C를 °. 가만히 따르다과 얼음 오래 PBS의 200 ~ 300 μl를 추가하고 어둠 속에서 얼음 (알루미늄 호일로 덮여)에 보관하십시오. 사이토 단계 2.4에서와 같이 여기 및 발광 파장 설정을 사용하여 10 분 이내에 흐름 분석.

3. 데이터 수집 및 분석

주 : 유세포 분석 및 데이터 분석 기술이 가정된다.

  1. 흠 개별적으로 염색 된 샘플을 이용하여 보정을 설정 적어도 4 색 분석 할 수있는 유세포 사용.
    주 : FITC 표지 된 CD4 및 CD14을 사용하여 단일 염색 GLUT1 2-NBDG 보상에 사용될 수있다.
  2. 설정 및 샘플을 획득하기 전에 해당 창 레이블을 붙입니다. 단핵구 인구 주위에 게이트를 그리기, 중간 속도로 샘플 당 10 만 30 만에 이벤트를 취득. 보상 샘플 50,000 이벤트는 충분하다.
    참고 : 보상은 샘플링 이전에 수행 될 수있다표준 절차에 따라 획득 또는 단일 세포 분석 소프트웨어.
  3. 수출 및 적절한 위치에 데이터를 저장합니다. 이러한 FlowJo 또는 다른 분석 소프트웨어 지정 (보충 그림 2)로 (보충 그림 1)과 드래그 앤 드롭 샘플로 단일 세포 분석 소프트웨어를 엽니 다.
  4. 두 파일 (보충 그림 3)를 클릭하여 엽니 다. . 게이트 앞으로 기반 단핵구 그림 1A 및 보충 그림 4와 같이 측면 산란 특성에 원을 그립니다 두 번 단핵 세포 인구를 클릭합니다. 관찰하고 CD3 주위에 상자를 그립니다 - 인구 (보충 그림 4).
  5. 더블 CD3을 클릭 - 인구. 단핵구의 소집단이 'X'축에 CD14-APC를 선택 관찰하고, 'y'- 축에 CD16-PECy7, 따라서 (보충 그림 5) 레이블을합니다.
  6. 뚜렷한이없는 경우양 및 음의 인구 특정 단핵 세포 소집단에서 GLUT1의 발현 또는 2-NBDG 흡수를 측정한다. 이소 타입없이 2 NBDG 배경 (보충 그림 6)를 뺀 GLUT1과 2 NBDG의 평균 형광 강도 (MFI)를 결정합니다.
  7. 정의 된 집단이 존재하는 경우, 비율 양성 세포 (그림 3) 게이트를 설정하고 결정하기 위해 IgG2b의-FITC를 사용합니다.
    참고 : 전체 CD14 + 단핵 세포를 분석하려면이 절차를 사용하십시오. 2-NBDG 흡수는 일반적으로 형광의 변화에​​ 의해 표시되기 때문에, 데이터가 가장 MFI 및 히스토그램으로 표현된다 강도.

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결과

보상 형광 유출을 방지하기 위해 각각의 형광 색소에 대해 수행되어야한다. 단핵구 먼저 전방 및 측면 산란을 기반으로 게이팅에 의해 강화된다. . 인구 - 이전에 (10)는도 1a는 CD3 내 게이팅에 의해 세포 분산 및 T 세포의 배제에 의한 단핵구의 초기 게이팅을 보여줍니다보고 제시된 그래프는 6 개 이상 참가자 전체 혈액에서 수행 적어도 6 독립적 인 실험의 대표입니다. 각각,도 1b 및도 1c에 도시 된 바와 같이, 단핵구는 CD14 발현 단독 총 단핵구 또는 단핵 세포 개체군을 식별 CD16과 결합을 위해 게이팅된다. CD보다 대략 100 배 표현한다 - 고전 단핵구 (CD14 CD16 ++) 이전 12 바와 같이 단핵 세포 개체군의 분석을 위해, 다음의 명명법이 적용되어야이...

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토론

여기에 설명 된 프로토콜은 전체 혈액의 단핵 세포 및 단핵 세포 개체군에 의해 글루코스 수송 식 형광 글루코오스 유사체 흡수를 조사하는 간단한 방법을 자세히. 전혈에서 2-NBDG 흡수를 평가하여,이 방법은 생체 내에서 유사한 조건을 허용한다. 이전의 연구는 밀도 원심 분리 (17)에 의해 전혈로부터 분리 된 단핵 세포에서 6 NBDG 흡수를 조사 하였다. 그러나,이 연구는 잠재적으로 특정 세포 표면 분자 (19)의 발현을 변경시킬 수 단핵 세포 개체군 및 전체 혈액 단핵 세포의 분리를 조사하지 않았다. 방사성 포도당 추적기는 포도당 (20, 21)의 단핵 세포 흡수를 측정하는 데 사용되었지만, 단핵 세포는 이전에 중요한 안전주의 사항을 필요로이 방법과 방사능의 사용을 위해 격리해야합니다. 우리의 일상 프로토콜 바이오 절차를 사용함으로써 2-NBDG의 유세포 측정을 허용 최소 조작이며생체 조건에서 모방 단핵 세포와 단핵구의 소집단으로의 흡수.

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 HIV와 간염 바이러스학 연구 AIDS 연구를위한 워싱턴 센터의 대학 (CFAR), 지원되는 보너스 번호 AI027757 아래 NIH 자금 지원 프로그램 (ACH 2), 2010 년 개발 보조금 (CNIHR)에 대한 호주 센터에 의해 투자되었다 다음 NIH 연구소 및 센터 (NIAID, NCI, NIMH, NIDA, NICHD, NHLBI, NIA)에 의해. CSP는 CNIHR 및 ACH 2 보조금받는 사람입니다. SMC는 호주 (NHMRC) 주요 연구 활동의 국립 보건 의료 연구위원회의받는 사람입니다. 저자는 기꺼이 버네 연구소에 의해 수신 된 빅토리아 운영 ​​인프라 지원 프로그램의이 작품에 대한 기여를 인정합니다. 우리는 교육 및 기술 자문 유동 세포 계측법에 대한 AMREP 유동 세포 계측법 핵심 시설에서 게자 Paukovic 에바 ORLOWSKI - 올리버의 도움을 인정합니다. 우리는 미디어 코칭 및 비디오 촬영 조직 앵거스 모건 감사합니다. 우리의 감사제시 메이슨과 뽑아 낸 압둘라지즈 K. Alzahrani에 비디오 촬영 중 실험실 지원. 우리는 중요한 방법론적인 조언을 제공하는 의료 과학, UNSW, 호주의 학교에서 박사 데이비드 SIMAR의 노력을 주셔서 감사합니다. CSP는 감사의 말씀을 www.nice-consultants.com를 그래픽 협의.

저자의 기여 :

CSP는 프로젝트를 구상 설계 및 실험을 실시, 분석 및 데이터를 해석하고, 원고를 썼다. JJA 데이터를 해석하고 원고를 썼다. TRB는 원고를 썼다. JMM는, 데이터를 해석 중요한 지적 제안을했고, 원고를 검토했다. SMC는, 데이터를 해석 중요한 지적 제안을했고 원고를 검토했다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
VACUETT Tube 9 ml ACD-B 항응고제 튜브Greiner Bio-One GmbH455094
5 ml 멸균 폴리프로필렌 튜브BD Biosciences352063
소 혈청의 알부민(BSA)Sigma-AldrichA7906
16% 포름알데히드 용액전자 현미경 과학15710
BD FACS 용해 용액(10x)BD Biosciences349202작업 농축을 위해 BD FACS 용해 용액 1/10을 탈이온수로 희석합니다(4°C에서 최대 1주일 동안 보관; C)
anti-CD3-PEBD Biosciences555340
anti CD14-APCBD Biosciences555399
anti-CD16-PECy7BD Biosciences557744
anti-Glut1-FITCR & D 시스템FAB1418F
IgG2b-FITCR & D SystemsIC0041F
2-NBDGLife technologiesN1319514.60 mM 재고 용액을 만들기 위해 2-NBDG 5 mg을 1 ml의 탈이온수에 매달아 만듭니다 (4 °에서 최대 6개월 동안 유지; C). 작동 2-NBDG 농도를 만들기 위해, 1x DPBS로 주식 1/100을 희석하십시오. 호일로 덮으십시오. (4 °에서 최대 1주일 동안 보관; C)
둘베코' s 인산염 완충 식염수 (1x)Life technologies14190-144세척 용액을 만들려면 100ml DPBS 당 0.5g BSA를 추가하십시오 (4 °에서 최대 2 주 동안 보관; 다)

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2 NBDGCD14 CD16HIV

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