간단한 유세포 방법은 전체 혈액에서 단핵구 부분 집단에 대한 당 흡수 및 포도당 운송업자 발현을 측정하는

요약

단핵구는 활성화될 때 해당작용 대사에 의존하는 인간 선천성 면역 체계의 필수 구성 요소입니다. 우리는 신선한 전혈에서 총 단핵구 및 단핵구 하위 집단에 의한 포도당 수송체 발현 및 포도당 흡수를 측정하기 위한 유세포 분석 프로토콜을 설명합니다.

초록

단핵구 특정 만성 염증성 질환과 관련된 병원균과 염증에 의해 활성화 될 수있는 선천성 면역 세포이다. 단핵구의 활성화는 이펙터 기능과 향상된 글루코오스 트랜스 포터의 발현을 수반하는 산화 당분 해 대사에서 수반하는 변화를 유도한다. 이 증가 당분 대사는 훈련 된 단핵 세포의 면역 선천성 면역 메모리의 형태로 관찰된다. 단핵 세포에 의해 글루코스 수송 체 발현 및 당 흡수 검사 관내 프로토콜을 설명 하였지만, 없음은 전혈 세포 계측법 다중 파라미터 플로우에 의해 관찰되지 않았다. (중간체 (CD14 ⁺⁺ CD16 ⁺⁾ 및 비 - 고전 ^- 우리는 전체 단핵구 및 고전 (CD14 ⁺⁺ CD16)에 의해 전혈 형광 글루코오스 유사체 2-NBDG 흡수의 측정을위한 다중 파라미터 유세포 프로토콜을 설명 CD14 ⁺ CD16 ⁺⁺⁾ 단핵구소집단. 이 방법은 항상성 및 염증성 질환 중 총 단핵 세포 및 단핵 세포 개체군에 대한 글루코스 수송 체 발현 및 당 흡수를 조사하는데 사용될 수 쉽게 혈액 내의 다른 백혈구 및 백혈구 개체군에 대한 당 흡수를 조사하기 위해 수정 될 수있다.

서론

단핵구는 빠르게 감염과 염증 ^하나의 사이트로 동원 된 인간의 선천성 면역 시스템의 주요 구성 요소입니다. 단핵 세포의 활성화는 병원체에 의한 급성 손상을 제한하기위한 중요하며 또한 죽상 동맥 경화증 ^2, 암 ^3, HIV ^4,5 등 여러 가지 만성 질환의 발병 기전의 핵심입니다.

휴식 활성화 단핵 세포의 신진 대사는 당분 대사를 (즉, 포도당의 발효 락트합니다)를 이용 산화 대사를 이용하여 휴식 단핵 세포 활성화 단핵 세포와 크게 다르다 ^6. 단핵 세포의 활성화는 당분 대사 ⁷ 증가 포도당 흡수를 허용 포도당 수송 체의 발현을 유도한다. 단핵구 포도당 수송 1 (GLUT1)의 활성화 중에 상향 조절 하나의 수송과 그 표현은 절에서 염증성 사이토 카인의 생산으로 이어질 것으로 나타났다itro 비만 쥐 ^(8)의 지방 조직입니다. 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스에 의한 단핵구 세포 라인의 감염 GLUT1 ^9의 휴대 상향 조절로 연결, 우리는 최근에 만성 HIV 감염시 GLUT1 발현 단핵 세포의 증가 비율이 치료와 함께 항 레트로 바이러스 치료 처리 감염 ^10시<....

프로토콜

참고 : HIV 감염과 HIV-감염되지 않은 과목은 멜버른, VIC, 호주에서 알프레드 병원에서 감염증 단위에서 모집하고, 각각 지역 사회에서했다. 동의서는 모든 참가자로부터 얻은 것, 그리고 연구는 알프레드 병원 연구 윤리위원회에 의해 승인되었다.

단핵구와 단핵구 부분 집단 1. GLUT1 세포 표면 감지

1. 구연산 ACD-B 항 응고 튜브에 혈액을 수집하고 수집의 1 시간 내 생물 안전 캐비닛에 실험을 시작한다.
2. 폴리 프로필렌 튜브에 혈액 100 μl를 추가합니다. 얼음에, 피펫 부드럽게 혼합하면서 솔루션을 용균 1 배 2 ㎖를 추가 튜브 (재료 표 참조). 얼음에 15 분 동안 품어. 5 분 동안 220 XG에 원심 분리기.
3. 따르다 약 2-4 ml의 세척액 (1X PBS에서 0.5 % BSA)을 첨가하고 5 분 동안 220 × g으로 원심 분리하여 두 번 세척 하였다.
4. 파이프를 사용하여TTE 신중 가능한 세정 용액만큼 제거한다. 장소 튜브는 얼음에 세척 용액 100 μL에 다시 일시 중지합니다.
5. 5 ㎕를 항 CD3-PE, 5 ㎕의 항 CD14-APC, 5 ㎕의 항 CD16-PECy7, 5 μL의 GLUT1 : 특정 단....

결과

보상 형광 유출을 방지하기 위해 각각의 형광 색소에 대해 수행되어야한다. 단핵구 먼저 전방 및 측면 산란을 기반으로 게이팅에 의해 강화된다. . 인구 ^- 이전에 ^(10)는도 1a는 CD3 내 게이팅에 의해 세포 분산 및 T 세포의 배제에 의한 단핵구의 초기 게이팅을 보여줍니다보고 제시된 그래프는 6 개 이상 참가자 전체 혈액에서 수행 적어도 6 독립적 인 실험의 대표입니다. 각각,도 1b 및도 1c에 도시 된 바와 같이, 단핵구는 CD14 발현 단독 총 단핵구 또는 단핵 세포 개체군을 식별 CD16과 결합을 위해 게이팅된다. CD보다 대략 100 배 표현한다 ^- 고전 단핵구 (CD14 CD16 ⁺⁺⁾ 이전 ¹² 바와 같이 단핵 세포 개체군의 분석을 위해, 다음의 명명법이 적용되어야이.......

토론

여기에 설명 된 프로토콜은 전체 혈액의 단핵 세포 및 단핵 세포 개체군에 의해 글루코스 수송 식 형광 글루코오스 유사체 흡수를 조사하는 간단한 방법을 자세히. 전혈에서 2-NBDG 흡수를 평가하여,이 방법은 생체 내에서 유사한 조건을 허용한다. 이전의 연구는 밀도 원심 분리 ^(17)에 의해 전혈로부터 분리 된 단핵 세포에서 6 NBDG 흡수를 조사 하였다. 그러나,이 연구는 잠재적으로 특정 세포 표면 분자 ^(19)의 발현을 변경시킬 수 단핵 세포 개체군 및 전체 혈액 단핵 세포의 분리를 조사하지 않았다. 방사성 포도당 추적기는 포도당 ^{(20, 21)의} 단핵 세포 흡수를 측정하는 데 사용되었지만, 단핵 세포는 이전에 중요한 안전주의 사항을 필요로이 방법과 방사능의 사용을 위해 격리해야합니다. 우리의 일상 프로토콜 바이오 절차를 사용함으로써 2-NBDG의 유세포 측정을 허용 최소 조작이며생체 조건에서 모방 단핵 세포와 단핵구의 소집단으로의 흡수.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
VACUETT Tube 9 ml ACD-B 항응고제 튜브	Greiner Bio-One GmbH	455094
5 ml 멸균 폴리프로필렌 튜브	BD Biosciences	352063
소 혈청의 알부민(BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
16% 포름알데히드 용액	전자 현미경 과학	15710
BD FACS 용해 용액(10x)	BD Biosciences	349202	작업 농축을 위해 BD FACS 용해 용액 1/10을 탈이온수로 희석합니다(4°C에서 최대 1주일 동안 보관; C)
anti-CD3-PE	BD Biosciences	555340
anti CD14-APC	BD Biosciences	555399
anti-CD16-PECy7	BD Biosciences	557744
anti-Glut1-FITC	R & D 시스템	FAB1418F
IgG2b-FITC	R & D Systems	IC0041F
2-NBDG	Life technologies	N13195	14.60 mM 재고 용액을 만들기 위해 2-NBDG 5 mg을 1 ml의 탈이온수에 매달아 만듭니다 (4 °에서 최대 6개월 동안 유지; C). 작동 2-NBDG 농도를 만들기 위해, 1x DPBS로 주식 1/100을 희석하십시오. 호일로 덮으십시오. (4 °에서 최대 1주일 동안 보관; C)
둘베코' s 인산염 완충 식염수 (1x)	Life technologies	14190-144	세척 용액을 만들려면 100ml DPBS 당 0.5g BSA를 추가하십시오 (4 °에서 최대 2 주 동안 보관; 다)