우리는 인간 피험자의 눈꺼풀 안쪽 가장자리의 결막에서 세포를 수집, 염색 및 이미지화했습니다. 세포 형태와 대사 활동을 특성화함으로써 이 방법은 안구 건조증에 대한 이해와 안구 표면 간의 마찰이 안구의 불편함을 인식하는 데 어떤 역할을 할 수 있는지에 대한 이해를 높일 수 있습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
눈꺼풀 안쪽의 눈꺼풀 와이퍼(LW) 영역의 세포 해부학적 구조에 대한 보고는 거의 없으며 세포학적 방법을 사용한 보고서는 하나뿐입니다. 본 연구에서는 인상세포학(IC)을 사용하여 LW 영역에서 세포를 수집, 염색 및 이미징하는 방법의 최적화에 대해 설명합니다. 친수성 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 멤브레인을 사용하여 인간 피험자의 위쪽 눈꺼풀 내부 표면에서 세포를 수집하고 세포학적 염료로 염색하여 배상 세포, 점액, 세포핵 및 다양한 정도의 사전 및 파라케라틴화의 존재를 나타냅니다. 면역세포화학 염료는 컨포칼 스캐닝 레이저 현미경을 사용하여 세포 에스테라제 활성과 손상된 세포막을 보여줍니다. 각 샘플에 대해 최대 100개의 현미경 디지털 이미지를 캡처하고 전체 IC 스팬의 고해상도 대형 이미지로 스티칭합니다. 우리는 이전에 보고된 것보다 더 높은 IC의 민감도를 보여주며, 이는 LW 영역에서 세포 형태 및 대사 활동을 식별하는 데 적합합니다. 우리가 아는 한, 이 형광 염료 선택이 LW IC 멤브레인을 이미지화하는 데 사용된 것은 이번이 처음입니다. 이 프로토콜은 콘택트렌즈 착용자 또는 안구 건조 또는 눈꺼풀 와이퍼 상피병증 환자의 세포 특수성 평가와 같이 LW 영역의 문서화되지 않은 세부 사항을 밝히기 위한 향후 연구에서 효과적일 것입니다.
서론
2mm 좁은 결막 지역 안구 세계를 반대 - 인간의 위 눈꺼풀 단지 1로, 1 만 깜박 매일 1 주위를 실행합니다. 깜짝 동안의 와이 핑 동작으로 인해, 뚜껑 마진이 부분은 "뚜껑 와이퍼"영역 (2)로 명명되었다. 이는 마찰에 의한 지구 위로 닦아 뚜껑에 습관적 깜박임 동안이 영역에서 증가하는 것으로한다. 이는 안구 시설에 중요한 역할을 할 수있다. 콘택트 렌즈는 특별한 경험 안구 불편에 착용자이 렌즈는 3 착용 중단의 주요 원인 중 하나입니다. 콘택트 렌즈는 눈에 위치 될 때 렌즈 재료 및 안구 표면 사이의 마찰 계수 4를 변경하는 것으로 나타났다. 건조 현상이 변경된 마찰 2,5,6- 관련 될 수 있음을 시사하는 증거가있다.
이 협회는 또한 임상 적으로 관찰 가능한 현상에 반영 될 수 있으며, 특히 뚜껑 위스콘신epitheliopathy (LWE)라고도 상부 덮개 마진 염색 (ULMS) 6 당. LWE은 안구 자극의 초기 기호 및 안구 건조 질환을 유발할 수있는 위험이 예측이다. 이 관찰 상하 뚜껑 마진 영역 생체 염색에 의해 측정된다. 이 등급 시스템 (2) 및 임상 적 유효성 (즉, 자각 증상과 상관 관계가) 논쟁에서 여전히 있지만, 안구 불편 함이 모두 의사와 과학자에 대한 수수께끼를 유지하고, 가장 중요한, 환자의 불편.
- 날짜, 작은 뚜껑 와이퍼 영역 (7)의 (서브) 세포 해부학과 생리학에 임상 적으로 관련 변화에 대해 알려진 단 하나의 보고서는 세포 학적 방법 (8)을 사용한다. 노출 세포진 검사 (IC)는 막 9,10의 응용 프로그램에 의해 안구 또는 눈꺼풀 결막의 상피 표면에서 세포를 수집하기 위해 40 년 이상 사용되어왔다. 제거시, 부착 세포는 C를 거쳐ytological 염색 및 현미경 영상. 때문에 뚜껑 와이퍼 영역의 해부학 적 및 세포의 차이로,이 기술은 최적화를 필요로한다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
윤리 문 : 이전 인체에서 세포를 수집에 대한 동의를 통보 윤리 승인을 취득해야합니다.
1. 얼룩 준비
주 : 실험의 날에 얼룩을 준비합니다.
- 15 ㎖의 원심 분리기 튜브에 2.5 ml의 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) 5 ㎕를 에티 디움 (4 μM) 5 ㎕를 칼 세인 AM (4 μM)를 추가; 혼합. 사용할 때까지 RT에서 빛과 가게에서 보호하는 알루미늄 호일에 싸서.
2. 수집 세포
- 자신의 패키지에서 세포 배양 삽입을 제거하고 각 눈꺼풀이 샘플링 될 때까지 레이블을 붙입니다. 영구 마커를 사용하여 막 플라스틱 홀더 측 셀 컬렉션 마크 방향. 행동은 IC를 받아야하는 지역의 적절한 건강을 확인하기 위해 적당한 배율 (약 20 배)에 램프 검사 슬릿.
- EA의 하부 결막 낭에 국소 마취 (0.5 % proparacaine 염산염) 한 방울을 분배채널 눈과 눈을 유지하기 위해 참가자를 지시 한 분 마감했다.
- 에버트 상부 눈 뚜껑과는 속눈썹에 의해 장소에서 개최; 뚜껑 와이퍼 영역과 접촉을 피하십시오.
옵션 : 보조 연구원의 도움이 단계를 수행해야 할 수 있습니다. - 최소 압력 뚜껑 와이퍼 영역의 중앙부에 수직으로 막을 적용한다.
- 5 초 - 3의 장소에서 막 잡아. 접촉 영역에 반투명하게 막을 관찰한다. 이 시점에서, 부드럽게 막을 제거하고 다시 제자리에 "플립"하는 참가자의 뚜껑을 허용합니다.
- 즉시 건조되는 것을 방지하기 위해, 샘플을 PBS 한 방울을 적용한다. 멤브레인은 반투명 설정하고이 건조를 나타냅니다으로, 언제든지 불투명 설정하지 않아야합니다. 보조 조사 샘플의 처리 (섹션 3) 즉시 진행해야합니다.
- 결막의 무결성을 보장하기 위해 마지막 눈 검사를 실시한다. 안구 윤활제를 분배하고 참가자 지시마취 효과가 떨어져 착용 할 때까지 자신의 눈을 문지르고 피하기 위해 (약. 15 분).
3. 시료 처리
- 마이크로 가위를 사용하여, 수직 셀 컬렉션의 중앙을 통하여 반 (하류 분석 각 절반)에서 멤브레인을 잘랐다. 플라스틱 홀더에서 분리하는 한 막 절반의 외연을 따라 절단; 막 자체에 접하지 않는 보장을 포함하는 막에 수집 된 세포와의 상호 작용을 피하십시오.
- 완전히 홀더에서 분리하기 전에 핀셋을 사용하여 멤브레인을 고정합니다. 95 % (v / v)의 에탄올 500 μl를 포함하고 (4.2 절)을 처리하기 전에 2 시간 최대 20 분의 최소 해결하기 위해 떠나라고 표시된 2 ML의 원심 분리기 튜브에 배치 막.
- (3.2 절에 설명 된대로) 즉시 4.1 절을 진행 막의 즉시 별도의 후반.
4. 샘플 염색
- Immunocytochemi칼 염색
- 조심스럽게 수집면이 아래로 향하게 35mm의 유리 바닥 배양 접시에 막 배치; 멤브레인이 평평 확인합니다.
- 피펫 막에에 부 (1)에 조립 된 면역 세포 화학 스테인 조성물의 20 μL. 샘플 컬 업,주의 깊게 가장자리를 아래로 밀어 막을 평평하게 일회용 피펫 팁을 사용하는 경우. 세포 수집 지역과의 접촉을 피하십시오.
- 부드럽게 유리 커버 슬립으로 막 커버. 샘플의 불필요한 이동을하지 마십시오. 뚜껑 접시를 덮고 가장자리 주위에 랩 필름 밀봉. 접시 (상단과 하단) 및 샘플의 가시성의 투명성을 방해하지 마십시오. 실험실 마커 레이블.
- 즉시 영상 (5.1 절)을 진행 한 후 멤브레인의 나머지 절반의 세포 학적 염색 계속 4.2로 돌아갑니다.
- 세포 학적 염색
- 점차적으로 천천히 튜브 U 증류수 500 μL를 첨가하여 막을 수화3.4 절에 고정하기위한 나오지. 피펫 팁에 흡인 내용을 여러 번 다음 내용을 제거, 혼합합니다.
- 증류수 500 μl를 추가합니다. 몇 초 동안 서하자, 다음 제거합니다. 알 시안 블루 얼룩의 500 μl를 추가하고 3 분 동안 둡니다. 얼룩을 제거하고 3 연속 500 ㎕의 증류수 린스 또는 액체 분명 린스까지 수행합니다.
- 헤 마톡 실린 # 1 얼룩의 500 μl를 추가하고 3 분 동안 둡니다. 얼룩을 제거하고 세 개의 연속 500 μL를 증류수 린스를 수행하거나 액체는 명확 린스까지. 맑은 액체를 흡입하여 (섹션 4.2.1의 역)를 탈수.
- 파파 니콜라 OG-6 얼룩의 500 μl를 추가하고 3 분 동안 둡니다. 얼룩을 제거하고 한 500 μl의 95 % (v / v)의 에탄올 린스를 수행합니다.
- 파파 니콜라 EA-65 얼룩의 500 μl를 추가하고 3 분 동안 둡니다. 얼룩을 제거하고 3 연속 500 μl의 95 %를 수행 (V는 / v)의 에탄올 린스.
- 완전 세 개의 연속 500 ㎕를 100 % 에탄올 린스를 사용하여 탈수. TWE를 사용하여ezers, 솔루션의 샘플을 제거; 감동 세포 수집 영역을 피하십시오.
- 유리 슬라이드에 막 배치; 해당 셀 컬렉션 라인을 보장하는 것은 병렬 또는 이미징 동안 쉽게 정렬 마진을 슬라이드에 수직 중 하나입니다.
- 100 % 에탄올의 드롭을 적용하고 유리 슬립으로 다룹니다. 즉시 영상 (5.2 절)를 진행합니다.
5. 샘플 영상
- 이미징 형광 면역 세포 화학 얼룩
- 화상 획득 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터에 연결된 디지털 컬러 카메라를 구비 한 공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM) 11 형광 현미경 (12)을 사용한다. 샘플에 배양 접시에 포함되지 인해 거꾸로 현미경이 필요할 수 있습니다.
- 에티 디움 호모 다이머-1 (DNA의 존재 617분의 528 nm의 예 / 엠 최대 값)와 칼 세인 AM의 흡수와 방출 스펙트럼 (517분의 494 내지 E에 따라 현미경 (11, 12)을 설정X / 엠 최대).
- (예를 들어, 2.5 배 목적) 현미경의 낮은 배율을 선택하고 디지털 이미징 시스템을 활성화; 컴퓨터 모니터에 표시되는 샘플을 관찰한다.
- 관심의 세포 기능에 대한 샘플을 검사합니다.
- 원하는 현미경의 배율을 선택 및 이미징 소프트웨어를 사용하여 이미지를 획득.
- 기본 현미경 파일 형식 또는 압축되지 않은 파일 형식 (예를 들어, * .RAW, * .TIFF) 중 하나에 파일을 저장합니다.
- 이미징 세포 학적 얼룩
- 화상 획득 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터에 연결된 디지털 컬러 카메라 장착 없음 필터 표준 실험실 명 시야 현미경을 사용한다.
- 장소 및 현미경 무대에서 (단계 4.2.8에서) 잠금 유리 슬라이드. 필요에 따라 전체 촬상 과정에 걸쳐 100 % 에탄올 샘플 재수.
- (예를 들어, 2.5 배 목적) 현미경의 낮은 배율을 선택하고 일을 활성화즉 디지털 이미징 시스템; 컴퓨터 모니터에 표시되는 샘플을 관찰한다.
- 확인 셀 컬렉션 현미경 스테이지 제어의 X 또는 Y 축 중 하나와 정렬된다. 커버 슬립을 제거하고 피펫 팁이나 핀셋을 사용하여 샘플을 회전시켜, 필요하다면 조정한다.
- 이미징 소프트웨어 최저 현미경 배율 전체 샘플의 캡쳐 된 이미지 (들)를 사용.
- 보통 현미경 배율로 전환 (예를 들어, 10 - 20 배 목표) 및 현미경 광원 및 소프트웨어 이미징 매개 변수 (노출, 대비, 화이트 밸런스 등을) 조정 및 자동화 소프트웨어 계량을 사용하지 않도록 설정합니다. 나중에 사용하기 위해 이러한 설정을 저장합니다.
- 스캔 (예를 들어, 왼쪽 상단 셀 컬렉션의 오른쪽 아래 모서리)의 시작과 끝 지점을 결정합니다.
- 이미징 소프트웨어의 시점과 종점 내의 전체 셀 집적 영역의 캡처 된 이미지 (들)를 사용. 20 % 나란히 및 위에서 아래로 중복 betw 확인모든 인접한 이미지 EEN.
- 기본 현미경 파일 형식 또는 압축되지 않은 파일 형식 (예를 들어, * .RAW, * .TIFF)를 사용하여 파일을 저장합니다.
- (예를 들어, 어도비 포토샵 요소) 선택의 자동 스티칭 소프트웨어를 사용하여 최종 파노라마 이미지를 생성합니다. 최종 이미지에 자동 스티치의 정확성을 확인하는 단계 5.2.5에서 찍은 사진 참조 이미지)를 사용합니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
플라스틱 홀더 위에 스팬 세포 배양 막은 덮개 와이퍼 결막 상피 세포에서의 핸드 헬드 컬렉션 편리한 도구이다. 이 방법은 일반적으로 제조 및 IC 막을 처리하는 데 추가적인 멸균 장비에 대한 필요성을 제거한다. (1) 세포 배양 삽입물을 이용하여 뚜껑 와이퍼 영역의 IC를 보여주고있다. 우리는 새로운 방식으로 뚜껑 와이퍼 영역에서 상피 세포의 특성을 서로 보완 개의 상이한 염색 프로토콜을 최적화. 도 2에 도시 된 바와 같이, 형광 면역 조직 화학적 염색은 에스 테라 제 활성, 세포 생존의 지표 및 핵산 공개, 염색있는 세포막 손상을 반영한다. 세포 학적 염색 프로토콜 각질화도 사이의 미세한 차이에 대한 허용한다.도 3으로 천이를 도시 눈꺼풀 결막 및 고급 각질 낮은 각질화 사이뚜껑 와이퍼 결막 및 표피 화. 선택된 관심 영역 반대로 세포학 염색 세...
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
노출은 통상적 세포학 혼합 셀룰로오스 에스테르 막을 사용하여, 구 결막에 대해 수행된다. 샘플, 대량 재료의 시트에서 크기로 잘라 멸균 집게를 사용하여 결막 표면에서 적용되고 제거됩니다. 동일한 막 재료를 사용하여 피스톤 제어 IC 디바이스의 최근 어플리케이션 (13) 사이 일관된 압력을 구 결막의 표면 형상과 일치하고, 유지하도록 설계되었다. 이러한 접근은 지역 와이퍼 좁은, 눈에 띄게 곡선 뚜껑 비효율적이다 (그림 1 참조). 또한, 혼합 된 셀룰로오스 에스테르 막는 명 시야 현미경 형광 촬상 전에 샘플을 정렬 할 필요가 셋업에 필요한 투명성을 제공하지 않는다. 이 프로토콜에서 제시 세포 배양 삽입물은 이상적인 크기 멸균 신속한 수집을 보장하는 추가 장비없이, 수동으로 취급 될 수 있기 때문에 편리하다. 막은에서 만들어집니다공 초점 현미경 분석을위한 충분한 투명성을 제공 친수성 PTFE.
전반적으로, 수집 된 세포의 형...
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개할 관련 자금이나 갈등이 없습니다.
감사의 글
이 연구에 큰 도움을 준 뚜껑 와이퍼 주제에 대한 통찰력과 전문 지식을 제공해 준 동료 Jalaiah Varikooty 박사에게 감사드립니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Alcian Blue, 3% 아세트산 | 시그마 | B8438-250ML | |
| 헤마톡실린, 아가미 1 | 시그마 | GHS116-500ML | |
| 파파니콜라우 염색, OG-6 | 시그마 | HT40116-500ml | |
| 파파니콜라우 염색, 변형된 EA | 시그마 | HT40232-1L | |
| 생/사 생존력/세포 독성 키트 | Life Technologies | L-3224 | 에티듐 호모디머-1과 칼세인 AM 염료 |
| 포함 알카인 (0.5% 프로파라카인 염산염) | 알콘 | ||
| 밀리셀 세포 배양 삽입물, 12 mm, 친수성 PTFE, 0.4 &마이크로; m | EMD 밀리포어 | PICM01250 | |
| 35mm 유리 바닥 접시 | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |
참고문헌
- Barbato, G., et al. Diurnal variation in spontaneous eye-blink rate. Psychiatry Res. 93, 145-151 (2000).
- Korb, D. R., et al. Lid-Wiper Epitheliopathy and Dry-Eye Symptoms in Contact Lens Wearers. Eye & Contact Lens. 28, 211-216 (2002).
- Dumbleton, K., Woods, C. A., Jones, L. W., Fonn, D. The impact of contemporary contact lenses on contact lens discontinuation. Eye & Contact Lens. 39, 93-99 (2013).
- Roba, M., Duncan, E., Hill, G., Spencer, N., Tosatti, S. Friction measurements on contact lenses in their operating environment. Tribol Lett. 44, 387-397 (2011).
- Sickenberger, W., Pult, H., Sickenberger, B. LIPCOF and contact lens wearers: a new tool to forecast subjective dryness and degree of comfort of contact lens wearers. Contactologia. 22, 74-79 (2000).
- Pult, H., Purslow, C., Berry, M., Murphy, P. J. Clinical tests for successful contact lens wear: relationship and predictive potential. Optom Vis Sci. 85, E924-E929 (2008).
- Doughty, M. J. Morphological features of cells along Marx's line of the marginal conjunctiva of the human eyelid. Clin Exp Optom. 96, 76-84 (2013).
- Jalbert, I., et al. Assessing the human lid margin epithelium using impression cytology. Acta Ophthalm. 90, e547-e552 (2012).
- Nelson, J. D. Impression cytology. Cornea. 7, 71-81 (1988).
- Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. A simple conjunctival biopsy. Am J Ophthalmol. 84, 798-801 (1977).
- Wilson, T. Confocal microscopy. , Academic Press. London. 1-64 (1990).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Tomlins, P., Roy, P., Curnow, J., Rauz, S. Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival Impression for Flow Cytometry. Invest Ophthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).
- Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease. Res Proj Dry Eye Syn. 45, 108-122 (2010).
- Knop, E., et al. The lid wiper and muco-cutaneous junction anatomy of the human eyelid margins: an in vivo confocal and histological study. J Anat. 218, 449-461 (2011).
- Christensen, J. A., Skaarland, E. Nuclear and cell area measurements in the cytological evaluation of pleural effusions: a study of subjective assessments and morphometric measurements. Diag Cytopathol. 3, 50-54 (1987).
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
