분자 결합의 고유 진동에 따라 코 히어 런트 반 스톡스 라만 산란 (CARS) 현미경 레이블없는 화학적으로 선택적 라이브 세포 이미징을 허용합니다. 사파이어 레이저와 OPO 레이저 본 작업은 펨토초의 Ti에 기초한 표준 광자 레이저 스캐닝 현미경에 상보 현미경 기술의 구현을 제공한다.
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방법 논문
사파이어와 OPO 레이저 기반 표준 레이저 스캐닝 현미경 :에 Ti에 코 히어 런트 반 스톡스 라만 산란 (CARS) 시스템의 구현
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
펨토초 티타늄 합성 레이저 스캐닝 현미경 : 레이저 라인을 복제하는 사파이어 레이저 및 광 파라 메트릭 발진 (OPO)은 생물학 가능하게되었다. 이 시스템은 기본적으로 멀티 채널 이광자 형광 현미경을 위해 설계된다. 그러나, 임의의 수정없이, 상기 제 2 고조파 발생 (SHG) 또는 3 고조파 발생 (THG) 보완 비선형 광학 현미경은 구성 분자 또는 수성 중간의 라벨없는 결상을 가능하게 세트해서 수행 될 수있다 지질 인터페이스. 이러한 기술은 생체의 관찰에 적합하지만, 화학적 특성으로 제한된다. 선택적 화학적 이미징 라만 산란에 기초한 고유 진동 신호로부터 얻을 수있다. 공 초점 라만 현미경은 3D 공간 해상도를 제공하지만, 높은 평균 전력 및 긴 획득 시간이 필요하다. 이러한 어려움을 극복하기 위해, 레이저 기술의 최근 발전은 (STABLE)을 허용했다비선형 광학 진동 현미경의 opment, 특히 코 히어 런트 반 스톡스 라만에 (CARS)을 산란. CARS 현미경 따라서 화학적으로 매핑 (OH 신축 진동을 통해) (CH 신축 진동을 통해) 지질, 물, 단백질이나 DNA에 의해 생물학적 라이브 세포 이미징을위한 강력한 도구로 떠오르고있다. 본 연구에서 우리는 표준 OPO 결합 광자 레이저 스캐닝 현미경에 CARS 기술의 구현을 설명한다. 이것은 레이저 빔의 경로 중 하나의 길이를 조정함으로써 2 개의 레이저 라인의 시간 동기에 근거한다. 우리는 기존 광자 시스템에서이 기법의 단계별 구현을 제시한다. 실험 광학의 기본 배경은 도움이되고 제시된 시스템은 고가의 추가 장비가 필요하지 않습니다. 우리는 또한 쥐의 좌골 신경의 수초에 얻은 이미징 CARS을 설명하고, 우리는이 영상이 같은 표준 t 다른 비선형 광학 이미징, 동시에 수행 할 수 있음을 보여WO 광자 형광 기법 및 제 고조파 발생.
서론
광학 현미경은 세포 내 해상도로 생물학적 시스템을 살고 동적 프로세스의 비파괴 시각화를위한 주요 기술이되었다. 형광 현미경으로 인해 높은 특이 도와 민감도 1 생균 현재 가장 많이 사용되는 영상의 대비이다. 형광 프로브의 큰 팔레트 (외인성 색소, 유전자 인코딩 단백질, 반도체 나노 입자를) 등장했습니다. 다양한 샘플 조명 형광 기반 기술은 3 차원 영상을 수행하고 2 photobleaching에되는이 기술의 주요 단점을 줄이기 위해 (예 촛점 또는 이광자 현미경 등) 번성하고있다. 분자 종의 대부분은 본질적으로 형광하지 않으며, 따라서 이러한 형광 인위적으로 몇 군데 샘플에 도입 할 필요가 있기 때문에 다른 제한은 형광 라벨의 요구 사항을 포함한다. 이 인공 조작은 작은 분자 특히 파괴적이거나 냄비를 유도 할 수있다ential 사진 독성. 이러한 이유는 생체 관측 형광 현미경하지가 적합합니다. 따라서, 형광성 분자의 사용없이 고감도 특정 분자 대조 광학 이미징 기술의 사용은 바이오 메디컬 사이언스에서 매우 바람직하다.
라벨이나 얼룩없이 여러 비선형 광학 이미징 기술은 두 번째 고조파 세대 (SHG) 3,4와 세 번째 고조파 세대 (THG) 5를....
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프로토콜
그림 1. 일반적인 셋업의 개략도 그것은 티타늄과 같습니다. 사파이어 (680 - 1080 ㎚)와 OPO (1,050 - 1,300 ㎚) 레이저, (M 4 M 1) 4 거울 지연 라인을, 빠른 오실로스코프, 포토 다이오드와 두 개의 고정 조리개 진동판 I 1 I 2. 미러 M 2 및 M 3 마이크로 미터의 분해능으로 지연 라인의 길이를 변경할 수 있도록 선형 병진 스테이지 상에 고정된다. 660 -. 685 나노 미터 대역 통과 필터가 CARS 이미징에 사용되는 광전자 증 배관 (PMT)의 전면에 배치 한 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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결과
표준의 Ti 펄스열 주파수 : 사파이어 레이저는 일반적으로 약 80 메가 헤르츠이다. 레이저 사파이어 다음 OPO은 상기 티타늄으로 펌핑되기 때문에, 동일한 주파수를 갖는다. 최소 200 MHz의 빠른 오실로스코프 따라서 필요합니다. 범위의 빠른 포토 다이오드 (600)에 1,100 내지도 필요합니다. 사파이어와 OPO 신호 1 / (2 × 80 × 106) = 6.2 나노초의 시프트 : TI의이 때 최대 시간적 변화가 발생합니다. 이는 1.9 m의 최대 빔 경로 변화에 대응하는 티 2는 OPO 레이저 광 (A)의 기록 펄스 열을 나타낸다 : 그리고. (지연 라인 (B)없이 사파이어 레이저 빔 및 상기 조정 가능 지연 라인으로 C를 ). 도 2a 및도 2c에 도시 된 바와 같이, 펄스 트레인 따라서 대략 구현 지연 라인.......
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토론
작품의 가장 어려운 부분은 레이저 빔의 시간 동기화된다. 그것은 빠른 오실로스코프와 결합 된 빠른 광 다이오드를 필요로하지만, 시간 만 거친 중복 처음에 수행 할 수 있습니다. 그 후 몇 cm의 추가적인 조정이 필요하다. 마지막으로, 선형 변환 스테이지 마이크로 미터에 의해 이동은 CARS 신호를 트리거하기 위해 지연 라인 길이의 최종 미세 조정을 행하는 허용한다. 변환 스테이지 마이크로 드라이브를 조정하여 관찰이 신호는, 약 20 마이크로 미터의 좁은 범위로 유지된다. 이는 펄스 폭의 절반 정도, 즉 140 FSEC의 빔의 피크 시프트에 대응한다. 차 신호에 필요한 두 빔의 공간적 중첩은 레이저 주사 현미경 시스템을위한 통상의 광 배향과 유사하다.
지연 라인의 구현은 실험의 기본 배경을 가진 생물 학자에 의해 몇 주 안에 달성 될 수있다물리학 자와 알 광학 또는 협력한다. 특별한주의 반사 손실을 최소화하기 위해 미러의 선택에 대해 수행되어야한다. 지연 라인을.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
저자는 고속 오실로스코프를 대여해 준 Philippe Combette 박사(IES, UM, 프랑스 몽펠리에)에게 감사의 뜻을 전하며, 몽펠리에 RIO Imaging(MRI)의 재정적 지원에 감사를 표합니다. HR은 ANR이 일관된 라만 이미징 개발을 위해 France Bio Imaging(ANR-10-INSB-04-01) 및 France Life Imaging(ANR-11-INSB-0006) 인프라 네트워크를 승인한 것을 인정합니다. 이 연구는 주로 유럽연구위원회(European Research Council) 보조금(FP7-IDEAS-ERC 311610)과 NT에 대한 INSERM - AVENIR 보조금의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 오실로스코프 | Tektronix | TDS 520D | 500 MHz |
| 광검출기 | Thorlabs | DET08C/M, T4290 | 5 GHz InGaAs, 800 - 1,700 nm |
| Ti:Sapphire laser Chameleon Ultra Family II | Coherent | ||
| Optical parametric oscillator OPO Compact Family | APE Berlin | ||
| Axio Examiner microscope LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Motorized | periscope Newport | ||
| Objective W Plan-Apochromat 20X/1.0 | Carl Zeiss | ||
| Beam combiner | Carl Zeiss | ||
| Acousto-optic modulator | Carl Zeiss | ||
| OPO 전력 감쇠기 | Carl Zeiss | ||
| 광전자 증배관 | Carl Zeiss | ||
| ZEN 소프트웨어 | Carl Zeiss | ||
| Bandpass | 필터 Carl Zeiss | LSM BiG 1935-176 | 400 - 480 nm; 500 - 550 nm; 465 - 610 nm |
| 이색성 거울 | Carl Zeiss | 컷오프 파장 760 nm | |
| 실버 미러 | Newport | 10D20ER.2 | &람다;/10, 480 - 20,000 nm, 수량 4 |
| 표준 마이크로미터가 있는 단축 변환 스테이지 | Thorlabs | PT1/M | 수량 1 |
| 알루미늄 브레드보드 | Thorlabs | MB1015/M | 수량 1 |
| 미러 마운트 | Thorlabs | KMSS/M | 수량 4 |
| Ø용 미러 홀더; 1" 광학 | Thorlabs | MH25 | 수량 4 |
| 아이리스 다이어프램 | Thorlabs | ID8/M | 수량 3 |
| 보호 상자 | Thorlabs | TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S | 수량 1 |
| 광학 포스트 | Thorlabs | TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M | 수량 8 (설정에 따라 길이) |
| 661 - 690 nm 대역통과 필터 | Semrock | 676/29 nm BrightLine® 단일대역 대역통과 필터 | 수량 1 |
| 형광 비드 | ThermoFisher | TetraSpeck™ 형광 마이크로스피어 크기 키트 | |
| 레이저 보기 카드 | Thorlabs | IR 레이저 보기 카드 | |
| 레이저 안전 유리 | Newport | LV-F22. P5L07 | |
| 플루오로미엘린&트레이드; 레드 형광 미엘린 염색 | 써모피셔 | F34652 |
참고문헌
- Valeur, B., Berberan-Santos, M. N. Molecular Fluorescence: Principles and Applications. , 2nd Edition, Wiley-VCH Verlag GmbH. (2012).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Moreaux, L., Sandre, O., Mertz, J.
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재인쇄 및 허가
