여기에서는 인간 만능 줄기세포(hPSC)를 위한 강력하고 빠르며 확장 가능한 심근세포 분화 프로토콜을 제시합니다. 이 대규모 방법을 사용하여 파생된 심근세포는 인간 심혈관 질환 모델링, 고처리량 약물 스크리닝 및 잠재적인 임상 응용 분야에서 효과적으로 사용할 수 있는 충분한 세포 수를 제공할 수 있습니다.
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방법 논문
고도의 재현 작은 분자 기반의 차별화 프로토콜을 사용하여 인간 다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포의 대규모 생산
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
연구, 질병 모델링, 제약 및 임상 적용을위한 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSCs)의 이점을 극대화 심근 비롯한 기능성 세포 유형의 대규모 생산을위한 견고한 방법이 필요하다. 여기에서 우리는 WNT, TGF-β, 및 SHH의 시간 조작 경로를 시그널링 정적 서스펜션과 교반 서스펜션 생물 반응기 시스템 모두에 단일 셀의 고효율 심근 분화 계대 hPSC 라인에 이르게 것을 보여줍니다. 이 전략을 채택하는 것은 지속적으로 여러 hPSC 라인에서 검증 배양 15 일 후> 80 % 심장 트로포 닌 T 양성 세포를 포함, ~ 100 % 상회 회전 타원체의 결과. 우리는 또한 현재 42 hPSC 라인에서 검증 된 성공있는 단일 세포 계대에 적응하지 세포주에 사용이 프로토콜의 변형에보고한다. 이러한 프로토콜을 사용하여 생성 된 심근는 혈통 특정 마커와 쇼 예상 electrophys을 표현학적 기능. 우리 프로토콜 인간 심장 근세포의 대규모 제조를위한 간단하고 효율적이고 강력한 플랫폼을 제공한다.
서론
인간 배아 줄기 세포 (hESCs는)와 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)를 포함하여, 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSCs)는 세 개의 배아 배엽 -1,2-의 세포로 분화하는 자기 갱신 및 용량의 능력을 가지고있다. 때문에 이러한 특성으로, hPSCs 임상 응용 프로그램 8 가능성이 높은 처리량 약물 검사 및 독성 분석 6,7 대한 인간의 질병 3-5, 모델링 질환 관련 세포 유형의 생성과 확장 성 생산을위한 가치있는 무제한 소스를 제공하고, . hPSCs에서 심근 세포의 발생으로 인해 중요한 동물 모델의 결여 및 / 또는 영향을받는 주요 조직의 이용에 특별히 이전에 우리의 능력의 범위를 넘어서는 복잡한 인간 심혈관 질환의 메카니즘과 가능한 치료법을 조사 할 기회를 제공한다.
hPSCs (n)의 전술 응용 프로그램의 모든고도로 농축 된 기능성 심근 엄청난 수의 생산 ecessitate. 따라서,의 가용성이 중요 여러 hPSC 라인을위한 효율적인 재현 적합한 시험 관내 심장 분화 프로토콜의 확장 인. 종래 심근 분화 프로토콜은 사이토킨 11 단백질 전달 수단 (12)의 칵테일 배아 체 형성....
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프로토콜
문화 미디어, 미분화 hPSCs의 세포 배양 플레이트의 코팅 및 유지 보수 1. 준비
- 미디어 준비
참고 : 최대 4 주 동안 빛으로부터 보호 4 ° C에서 0.22 μm의 여과 장치와 저장소를 사용하여 미디어를 소독. 시약 이름, 공급 업체 및 카탈로그 번호는 자료 표에 나열되어 있습니다.- 마우스 배아 섬유 아세포 (MEF) 매체, 445 mL의 DMEM 50 ml의 우 태아 혈청 (FBS) 및 5 mL의 세포 배양 배지 (예를 들면, 루타)를 결합한다.
- hESC의 매체, 390 ml의 녹아웃-DMEM (KO-DMEM), 100 ml의 넉 아웃 혈청 교환 (KO-SR), 5 ㎖ 세포 배양 배지, 5 ㎖ MEM 최소 필수 아미노산 용액 0.5 ml를 55 밀리미터 β 머 캅토 에탄올을 결합한다.
주의 : β-머 캅토 에탄올 독성이다. 흡입, 섭취, 피부 접촉을 피하십시오. - RPMI-B27 (RB) 보통의 경우, 475 ml의 RPMI 1640을 결합, 10 ML의 B27 마이너스인슐린, 5 ㎖ 세포 배양 배지, 5 ㎖ MEM 최소 필수 아미노산 용액, 5 mL의....
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결과
hPSCs에서 심근 세포의 대규모 분화하기위한 간단한 방법을 확립하기 위해, 우리는 (16)과 후속 WNT의 억제제로 세포를 WNT / β 카테닌 활성제 (CHIR99021)로 처음 처리 하였다하는 프로토콜을 작성 / β- 카테닌 및 변형 성장 인자 β (TGF-β) 경로 (IWP2 16 SB431542 (17), 각각)와 소닉 고슴도치 (SHH) 통로 (purmorphamine)의 마지막 활성제 (17) (그림 1A). 우리 분화 전략에서, 구 상체의 약 50 % (175 ±은 구형 직경 크기가 25 μm의) 후,이 프로토콜을 이용하여 흥미로운 일 10 100 %로 증가 분화의 개시 후 7 일 치기 시작 분화 타원체가 관찰되었다 차별화 개시 18 후 60 일까지 치고 계속합니다. 해리 타원체에 인구 연구유동 세포 계측법에 의해 시험 셀보다 .......
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토론
hPSCs로부터 유도 된 심근은 아마도 미래에 회생 인간 질병 치료 모델링, 약물 스크리닝 / 독성 시험에 사용하기에 매우 매력적이며 소스. 그러나, 이들 세포를 사용하는 주요 장애물 중 하나는, 그 유효 이용을 위해 충분히 높은 품질의 재료를 제공 할 수있는 능력이다. 우리의 설명 프로토콜을 사용하여, 우리는이 한계를 극복하는 방법을 제공합니다.
최근 cardiogenesis 관련된 특정 신호 전달 경로를 표적 합성 소분자는 심장 분화 16,17,22,23을 향상시키기 위해 설명되었다. 이들은 이제 재조합 사이토 카인 혈청 많은 정의 요소를 포함하고 배치 변화를 나타내는 대안으로 사용되고있다. 특이성 이외 소분자 프로토콜의 주요 장점은 저렴하고 구성 요소는 일반적으로 사이토 카인 또는 성장 인자를 함유하는 매체와 비교하여 연장 된 저장 수명을 가지고 있다는. 우리보고 프로토콜에서 사용되는 작은 분자는 저 분자량 화제는, 그들은 구조적 및 기능적으로 정의되.......
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공개 사항
빅터 창 심장 연구소에 관여하지 않으며, 연구를위한 인간 배아의 파괴를 묵과 않습니다. 이 연구에 기여 인간 유도 만능 줄기 세포에서 작동하도록 제한되었다.
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없습니다 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 Royan Institute, Iranian Council of Stem Cell Research and Technology, Iran National Science Foundation(INSF), National Health and Medical Research Council of Australia(NHMRC; 354400), National Heart Foundation of Australia/Heart Kids Australia(G11S5629) 및 New South Wales Cardiovascular Research Network의 보조금으로 지원되었습니다. HF는 호주 뉴사우스웨일스 대학교(University of New South Wales)의 국제 대학원 장학금(University International Postgraduate Scholarship)의 지원을 받았습니다. RPH는 NHMRC Australia Fellowship의 지원을 받았습니다. 저자는 이 연구에 참여한 인간 피험자에게 감사를 표합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829018 | |
| 녹아웃 혈청 대체품(KO-SR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| MEM 비필수 아미노산 | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF) | Miltenyi Biotec | 130-093-843 | |
| RPMI1640 | Life Technologies | 11875093 | |
| DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 | 없음 Life Technologies | 14190144 | |
| DPBS | Life Technologies | 14287072 | |
| 부착 인자(AF) | Life Technologies | S006100 | |
| ECM 젤 | Sigma-Aldrich | E1270 | |
| 라미닌 | 인비트로겐 | 23017-015 | |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| 치명적인 소 혈청 (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| B27 마이너스 인슐린 | Gibco | A18956-01 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Life Technologies | 15070063 | |
| 0.05% 트립신/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| 콜라겐분해효소 IV형 | Life Technologies | 17140-019 | |
| 염화칼슘 (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Mitomycin C | Bioaustralis | BIA-M1183 | |
| CHIR99021 | Miltenyi Biotec | 130-104-172 | |
| IWP2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
| SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-095-561 | |
| Purmorphamine | Miltenyi Biotec | 130-104-465 | |
| ROCK 억제제 Y-27632 | Miltenyi Biotec | 130-104-169 | |
| 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) | 시그마-알드리치 | E6758 | |
| 폴리 비닐 알코올(PVA) | 시그마-알드리치 | 363073 | |
| 젤라틴 | 시그마-알드리치 | G1890 | |
| 트리판 블루 | 바이오-라드 | 145-0013 | |
| 아큐맥스 | 혁신적인 세포 기술 Inc. | AM105 | |
| 시그마코트 | 시그마-알드리치 | SL2 | |
| CELLSPIN | Integra Biosciences | 183 001 | |
| 스피너 플라스크, 1개의 펜듈럼, 100 ml | Integra Biosciences | 182 023 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | 사내(또는 상업적으로 이용 가능) | ||
| 인간 만능 줄기 세포(hPSC) 라인 | 자체 준비(또는 상업적으로 이용 가능) |
참고문헌
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (200....
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재인쇄 및 허가
