방법 논문

각막 상피 ​​창상 치유 기간 동안 열 충격 단백질 27의 기능의 RNA 간섭 기반 조사

DOI:

10.3791/54280

⸱

2016년 9월 27일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Saevit Eye Hospital, 2Department of Ophthalmology, University of Ulsan College of Medicine, Asan Medical Center

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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본 연구에서는 각막 상피 상처 치유 중 HSP27의 기능을 평가하기 위해 열 충격 단백질 27(HSP27) 특이적 소형 간섭 RNA를 사용하는 프로토콜을 제시합니다. RNA 간섭은 다양한 세포 유형에서 단백질 기능을 조사하기 위해 유전자 발현을 효과적으로 knockdown하는 가장 좋은 방법입니다.

초록

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Small interfering RNA (siRNA)는 단백질 코딩 유전자의 단기 침묵을 위해 가장 널리 사용되는 RNA 간섭 방법 중 하나입니다.siRNA는 mRNA 전사체를 특이적으로 표적으로 하여 분해를 유도하기 위해 만들어진 합성 RNA 듀플렉스이며 다양한 세포 과정에서 새로운 경로를 식별하는 데 사용되었습니다. 각막 상피 상처 치유에서 인산화열충격단백질27(HSP27)의 역할에 관한 보고는 거의 없다. 본 명세서에서, 배양된 인간 각막 상피 세포는 스크램블된 control-siRNA 형질주입된 그룹과 HSP27-특이적인 siRNA-형질주입된 그룹으로 분할되었다. 그런 다음 스크래치 유도 방향성 상처 분석, 웨스턴 블로팅 및 유세포 분석을 수행했습니다. 우리는 HSP27이 상피 세포 사멸 및 이동을 포함할 수 있는 각막 상피 상처 치유에 역할을 한다는 결론을 내렸습니다. 여기에서는 시료 준비 및 연구 프로토콜에 대한 단계별 설명이 제공됩니다.

서론

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그들은 동시에 윤부 각막 상피 기저 층에서 세포로 대체하는 동안 각막 상피 세포 (CECs)이 지속적으로, 눈물 막으로 흘려된다. (1) 다양한 외부 스트레스가 CECs의 세포 사멸 및 박리를 유도 할 수 있습니다. 2 열 충격 단백질들 (HSPs) 고도로 보존되어 있으며, 분자의 크기에 따라 두 개 패밀리로 분할 될 수있다. (3) 최대 HSP 계열은 HSP90, HSP70, 및 HSP60 및 작은 가족 HSP27 포함을 포함한다. 4 HSP27의 인산화는 세포 생존에 중요한 역할을하는 것으로 알려져 때문에 굴지의 리모델링이 단백질의 역할의 세포 이동이 필요합니다. 5-7 따라서, 우리는 상피 상처 치유의 체외 모델에서 CEC 마이그레이션 및 세포 자멸사에서 HSP27 인산화의 잠재적 인 역할을 테스트하려고했습니다.

RNA 간섭 (RNAi의) 작거나 짧은 간섭 RNA를 하나를 사용하여 (siRNA의)은 GE있다잠재적으로 허용하는 두 기초 및 응용 생물학 nerated 관심이 관심의 유전자의 발현이 노크 다운 될 수 있습니다. (8) 여기서, 우리는 CEC 상처 치유와 세포 자멸사에 대한 HSP27의 기여를....

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프로토콜

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1. 세포주

  1. 6 웰 플레이트에 문화 10 6 텔로 머라 제 - 불후의 인간의 각막 상피 세포 (인체 각막 상피 세포) : 기관지 상피 성장 매체 (BEGM)를 사용하여 5 % CO 2 분위기로 37 ° C 배양기에서 (밀도 1039.9 셀 / mm 2)까지 그들은 95 %의 합류에 도달합니다.

2. 웨스턴 블롯 분석 상피 스크래치 상처를 작성 후

  1. 킬 멸균 200 μL 피펫 합류 배양 된 인체 각막 상피 세포의 잘의 표면을 가로 질러 팁 생물 안전 캐비닛 접시 당 네 번 (클래스 II, 유형 A2)와 5 % CO 2 분위기로 37 ° C 배양기에서 별도로 인체 각막 상피 세포를 배양 1, 5, 10, 30, 60 및 120 분.
  2. 각막 상피 ​​상처 후 배양 시간에 따라 여섯 가지 샘플에 대해 하나의 6 웰 플레이트를 사용합니다.
  3. 1X PBS로 부상 HCEC의 단일 층을 세 번 세척 한 후 각 웰에 2.0 ml의 BEGM를 추가합니다.
  4. (2)를 사용하여 인체 각막 상피 ​​세포를 분리ml의 0.25 % 트립신 - 에틸렌 디아민 5 분 동안 잘 당 아세트산 (EDT....

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결과

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인산화 HSP27의 발현은 크게 5, 10로 증가하고, 처음 30 분 후에는 13 unwounded 인체 각막 상피 세포에 비하여 부상. 웨스턴 블롯 분석 Bax의 발현이 크게 HSP27 특정 siRNA를 형질 인체 각막 상피 세포 (그림 1A-E)에서 증가하는 반면 인산화 HSP27과 인산화 된 Akt의 발현이 모두 유의하게 감소 된 것으로 나타났습니다. 인산화 HSP27의 발현을 30 % 40 10 뉴 멕시코 % 및 HSP27 고유의 50 nm의 siRNA를 형질 감염된 세포를 각각 제어 siRNA를 형질 세포 있지만 인산화 HSP27의 발현에 비해 감소되지 않았다 (도 1A-B로 감소시켰다 ). 또한, 비 인산화 HSP27의 발현은 10 nM 내지 20 % 및 30 % 감소 하였다 siRNA를 형질 감염된 세포에 각각하지만 비 인산화 HSP27의 발현이 감소되지 않았다 .......

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토론

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본 연구에서는 시험관 내 접근법을 사용하여 각막 상피 상처에서 HSP27의 잠재적 역할을 평가했습니다. 중요한 단계에는 스트레스를 받는 세포에서 HSP27의 기능을 관찰하기 위해 HSP27 녹다운을 위한 siRNA 형질감염이 포함되었습니다. 특히, HSP27의 역할은 각막 상피 상처 치유 중 상피 세포 이동 및 세포사멸에서 이러한 실험에 의해 밝혀졌습니다. 쥐 HSP27 특이적 siRNA를 사용하여 혈관 평활근 세포를 형질감염시킨 이전 연구10 과 달리, 우리는 siRNA 형질감염 기술을 사용하여 인간 CEC에서 유전자 발현을 변형하여 HSP27 특이적 유전자 발현을 효과적으로 녹다운하고 HSP27 기능을 연구했습니다. 우리가 사용한 표적 서열과 세포 밀도, 최종 siRNA 농도 및 배양 시간에 차이가 있었지만 제조업체에서 권장하는 프로토콜을 명시적으로 따랐습니다. 대체 방법 측면에서, HSP27 녹아웃 마우스는 HSP27 인산화가 상피 이동 및 세포 사멸을 포함하는지 여부를 보여주는 데 사용.......

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공개 사항

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저자는이 연구에서 언급 된 모든 자료 나 방법에는 금융 또는 소유권 관심이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 의학, 서울, 울산 대학교 의과 대학 학생 연구 그랜트 (13 ~ 14)과 아산 생명 과학 연구소, 서울, 한국에서 보조금 (2014-464)에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
생물 안전 캐비닛CHC LAB Co.Ltd,  대한민국 대전 CHC-777A2-06클래스 II, 타입 A2 
Stealth RNAi™ siRNAThermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MARNAi siRNA; 스크램블 컨트롤-siRNA 및 HSP27 특정 siRNA
BEGMTMLonza, Inc., Walkersville, MDCC-3171, CC4175기관지 상피 성장 매체 
프로테아제 억제제 Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MOP8340 ,P76261 μ M 펩스타틴 A, 1 μ M 루펩틴, 0.1 μ M 아프로티닌
브래드포드 단백질 분석 Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA#500-0001Bradford 단백질 분석 
니트로셀룰로오스 필터 Amersham, Little Chalfont, UKRPN3032D웨스턴 블로팅 멤브레인
비인산화 HSP27 Abcam Inc., Cambridge, MAab123511:1,000 희석 (총 HSP27)
인산화 HSP27 (Ser85)Abcam Inc., Cambridge, MAab55941:1,000 희석 HSP27은 Ser85
Lipofectamine® RNAiMAX 시약에서Invitrogen, Carlsbad, CA13-778-075형질주입 시약
인산화 Akt (Ser473)세포 신호 기술, Danvers, MANo. 40601:1,000 희석 Akt는 Ser473 (세포 생존 마커)
비인산화 Akt에서Cell Signaling Technology, Danvers, MANo. 40611:1,000 dilution (Total Akt)
Bcl-2-associated X protein Cell Signaling Technology, Danvers, MANo. 40621:1,000 (anti-apoptotic protein marker)
GAPDHSanta Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CANo. 40631:1,000 loading control marker (house keeping gene)
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit anti-rabbit ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MANCI1460KR1:10,000 dilution
OPTI-MEMInvitrogen, Carlsbad, CA31985형질주입을 위한 저감 혈청 매체
이미지 분석 소프트웨어Olympus, Inc., Tokyo, JapanImage-Pro Plus 5.0
스킴 분유 Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, GermanyT145.2
Tris Amresco LCC, Inc. Solon, OHNo-0497
염화나트륨 Amresco LCC, Inc. Solon, OHNo-0241
6웰 배양 플레이트Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA14067535.00mm 직경 / 웰
24웰 배양 접시Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA142475
Orbital shakerN-Bioteck, Inc., Seoul, South KoreaNB1015
소 혈청 알부민산타크루즈 생명공학, 산타크루즈, 캘리포니아sc-2323 
BDFACSCantoTM IIBD Biosciences, Franklin Lakes, NJ플로우 사이토메트리
X-선 필름Kodak, Rochester, NY의료용 X-선 카세트, 녹색 400 화면 
웨스턴 블로팅 루미놀 시약Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CAsc-2048 
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit IBD Biosciences, 프랭클린 레이크스, 뉴저지556547
인산화되었습니다. 인산화되었습니다.

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dua, H. S., Gomes, J. A., Singh, A. Corneal epithelial wound healing. Br. J. Ophthalmol. 78 (5), 401-408 (1994).
  2. Estil, S., Primo, E. J., Wilson, G. Apoptosis in shed human corneal cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 (11), 3360-3364 (2000).
  3. Guay, J., et al.

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