방법 논문

갭 접합부 세포 간 통신 : 천연 제품의 독성 물질과 독소의 반작용을 평가하기위한 기능성 바이오 마커, 보건 혜택

DOI:

10.3791/54281

⸱

2016년 12월 25일

 ,  , 
1Department of Pediatrics & Human Development, Institute for Integrative Toxicology, Michigan State University, 2RECETOX — Research Centre for Toxic Compounds in the Environment, Faculty of Science, Masaryk University

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 간극 결합 채널을 통해 세포 간 통신을 측정하는 메스 로딩 형광 염료 전송 기술에 대해 설명합니다. 갭 접합부 간 통신은 조직의 항상성을 유지하고이 세포 신호의 중단은 건강에 악영향을 갖고있는 중요한 세포 과정이다.

초록

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이 프로토콜은 조직의 항상성을 유지하는 중요한 세포 간 과정 간극 결합 채널을 통해 세포 간 통신을 측정하는 메스 로딩 형광 염료 전송 (SL-DT) 기술에 대해 설명합니다. 등 독성 물질, 독소, 약물에 의한 갭 접합부 간 통신 (GJIC)의 중단은 많은 부작용 건강에 미치는 영향에 연결되어 있습니다. 많은 유전자 기반 인간 질병 갭 정션 유전자의 돌연변이에 관련되어있다. SL-DT 방식은 셀의 커다란 집단에서 GJIC의 동시 평가를위한 간단한 분석 기능이다. 분석 간략 세포 집단을 메스 블레이드 세포막을 교란하여 형광 염료와 프리로드 셀을 포함한다. 형광 염료는 그 후 지정된 시간에 대해 인접 셀에 간극 결합 채널을 통해 통과시킨다. 분석 후, 세포에 포르말린을 첨가하여 종료한다. FLUO의 확산세포의 인구를 통해 rescent 염료는 표면 형광 현미경으로 평가되고 이미지가 공개 도메인에서 발견 무료 소프트웨어 패키지를 포함하여 사용할 수있는 형태 계측 학적 소프트웨어 패키지의 수와 분석된다. 이 분석은 또한 처리 된 동물의 다양한 기관에서 조직 조각을 사용하여 생체 내 연구에 적용되고있다. 전반적으로, SL-DT 분석은 시험 관내 약리학 및 독성 요구의 넓은 범위를 제공 할 수 있으며, 잠재적으로 더 짧은 시간에 더 많은 샘플을 명료하게 자동 형광 현미경 영상 분석 높은 처리량 설정 시스템에 적용될 수있다.

서론

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이 방법의 전체 목표는 화합물의 잠재적 인 독성을 평가하기 위해, 간단하고 비교적 저렴 ​​광범위한 기술을 제공하는 것이다. 이것은 여러 세포주에서 사용할 수있는 시험 관내 접근법이다. 표면 형광 현미경을 갖춘 표준 세포 생물학 연구소는이 분석을 사용하여 연구를 수행 할 수 있습니다.

세포 기능의 우리의 기본 지식은 시험 관내 생물 검정에 크게 의존하고 있으며, 제약, 환경 오염 물질, 식품 태어난 오염 물질의 독성 평가에 필수적인 요소가되고있다. 불행히도, 모든 독성 종합적 평가에 대한 요구를 충족시킬 수있는 단일 관내 생물학적 검정 시스템이 없다. 시험 관내 분석의 많은 설계 및 평가뿐만 아니라 특정의 생화학 적 또는 분자 포인트를 평가하도록 최적화되어있다. 이들은 매우 자주의 섭동을 반영하도록 설정 높은 처리량 결합에스트로겐 수용체 1 신호와 같은 특정 신호 전달 경로. 이 전략은 매우 성공적 이었지만, 유전자의 발현에 관여하는 신호 전달 경로의 수는 광범위한 매우 복잡 평가하는 특정 신호 전달 경로를 선택하는 작업을한다. 높은 처리율 프로토콜은 현재 개발되고 동시에 단일 분석의 한계 중 일부를 극복하기위한 하나의 접근법을왔다 수많은 신호 전달 경로를....

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프로토콜

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이 연구의 프로토콜은 쥐가 인도적과 고통의 경감을위한 관련하여 처리 한 것을 보장하기 위해 동물 관리 및 생체은 실험이 수행 된 곳이다 일본의 건강 과학, 국립 연구소의 이용위원회에 의해 승인되었다.

1. SL-DT 생물 검정

  1. 이글스 함유 시드 3 × 105 WB-F344 쥐 간 상피 세포 (35) 상 mm 직경의 배양 플레이트를 37 ºC 100 % 상대 습도 (RH), 5 % 인큐베이터 배지 플러스 5 % 소 태아 혈청, 및 배양 세포를 변형 CO 2.
  2. 배양 세포들은 100 % 합류 (일반적으로 2 일)에 도달하고 후술하는 바와 같이 셀의 원하는 치료 실험을 수행 할 때까지.
    1. 복용량 응답 실험을 실시
      1. 10 ㎕의 100 % 아세토 니트릴 4 μL 6 μL에서 페난 트렌의 2 mM의 스톡 용액 20 μL 및 phenan의 20 mM 스톡 용액 8 μl를 추가원액을 각각 첨가 볼륨 성장 배지 2 ㎖를 함유하는 세포의 3 개의 판을 100 % 아세토 니트릴 트렌.
      2. 4 μL 6 μL 8 μL, 10 μL, 상기 차량 제어 역할을하는 아세토 니트릴 용액을 각각 첨가 볼륨 성장 배지 2 ㎖를 함유하는 세포의 3 개의 판을 아세토 니트릴 100 ....

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결과

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GJIC의 중단 광범위하게 불리한 건강에 미치는 영향 (14)을 유도하는 유전자 조절의 nongenotoxic, 후생 유전 학적 수준에서 독성 화합물을 식별하기위한 바이오 마커로 사용되어왔다. 예를 들어, 다환 방향족 탄화수소 (PAHs의)는 환경의 유비쿼터스 오염 물질은하지만 그들의 분자 구조 (15)의 함수로서 자신의 후생 유전 학적 독성에 따라 다릅니다. 저 분자량의 PAHs는 일반적으로 담배 연기 15,16의 오염 된 하천 퇴적물 많은 다양한 환경에서 고 분자량 PAHs에 비해 상대적으로 높은 농도로 발견된다. 페난 트렌은 베이 지역이라는 각 포켓 세 개의 벤젠 고리를 갖는다 저분자 PAH의 일례이다. 도 2는 페난 트렌의 용량 증가 처리 WB-F344 쥐 간 상피 세포 SL-DT의 일련의 이미지이다. 이주 오의 감소를 참고증가 용량과 형광 염료, 루시퍼 노란색, F. 스캔.......

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토론

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SL-DT 분석은 GJIC을 측정하는 간단하고 다양한 기술이지만, 적절한 실험 프로토콜을 설계 할 때 고려되어야한다 몇 가지 중요한 문제들이있다. SL-DT 분석을 사용하여 GJIC의 강력한 측정을 위해 셀 갭 접합을 통해 LY의 좋은 염료 확산이 있어야합니다. 최소한, 적절한 시간 염료 양방향 메스로드 셀에서 셀의 8 개 이상의 행을 퍼지는 것을 보장하도록 선택되어야한다. 또한, 염료 메스로드 셀에서 이전의 거리 측정의 용이성, 제어 플레이트의 염료 확산 시야의 70 내지 90 %를 채우고 보장 배율 인자를 선택한다. WB-F344 쥐 간 상피 세포, 색소 앞에 네 개의 셀 열 넘어갈 대한 LY 용액 세 분 인큐베이션 충분하며, 200 배의 배율이 최적이다. 세포 loadi 아주 수정할 수있는 인 35mm 직경 플레이트상에서 성장메스와 세포에 염료를 ng를. 그러나, 셀은 작은 웰에서 배양 될 수 있지만, 메스의 사용은 특히 96 웰 배양 플레이트에서 불가능하다. 작은 우물의 경우, 우물에 맞게 다시, 롤링 액션을 사용할 수.......

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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NIEHS 보조금 #R01 ES013268-01A2에 의해 지원되며, 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIEHS의 공식 견해를 나타내는 것은 아니며 CETOCOEN UPgrade 프로젝트 No. CZ.1.05/2.1.00/19.0382입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
WB-F344 쥐 간 상피 세포노스 캐롤라이나 대학교 (노스 캐롤라이나 대학교 (채플 힐, 노스캐롤라이나)의 J. W. Grisham박사와 MS Tsao 박사가 제공 노스 캐롤라이나 대학교 - 채플 힐 - 노스 캐롤라이나
35 mm 배양 플레이트코닝430165
25 cm2< / sup> 배양 플라스크코닝430639
75 cm2 배양 플라스크Corning430641
D-medium, Eagles 변형 매체 써모피셔/GIBCO 공식 번호 78-5470EF
소 태아 세럼ThermoFisher/GIBCO 10437
0.25% 트립신-EDTA 써모피셔/GIBCO 
성분 cat#의137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4
KClJT Baker - Mallinckrodt 3040-01
NaClJT 베이커 - Mallinckrodt 3624-05
Na2HPO4JT 베이커 - Mallinckrodt 3819--01
KH2PO4JT 베이커 - Mallinckrodt 3246-01
루시퍼 옐로우 CH, 리튬 염시그마-알드리치 화학L0259
로다민-덱스트란시그마-알드리치 화학R9379
1-메틸안트라센시그마-알드리치 화학 페
난트렌시그마-알드리치 화학P11409
레스베라트롤시그마-알드리치 화학R5010
D609토크리스 바이오사이언스 1437
아세토니트릴EMDAX0145-1
37% 용액 포름알데히드JT 베이커 - Mallinckrodt 2106-01
#20 수술용 칼날Fine Science Tools Inc. 10317-14
50ml 원추형 멸균 튜브Thermo scientific 
Nikon 형광 현미경 니콘 -Mager 사이언티픽이클립스 TE300
니콘 FITC 이색성 큐브니콘 -Mager 사이언티픽96107
CCD 카메라니콘 -Mager 사이언티픽니콘 쿨 스냅 EZ CCD
이미징 시스템니콘 -Mager Scientific니콘 NIS-Elements F2.2 이미징 시스템.
ImageJ국립 보건 연구소http://imagej.nih.gov/ij/
339652

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rotroff, D. M., et al. Predictive endocrine testing in the 21st century using in vitro assays of estrogen receptor signaling responses. Environ.Sci.Technol. 48 (15), 8706-8716 (2014).
  2. Axelsen, L. N., Calloe, K., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S.

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재인쇄 및 허가

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