Method Article

세포 외 매트릭스 내에서 임베디드 공학 3 차원 상피 조직

DOI:

10.3791/54283

⸱

July 10th, 2016

 , 
1Chemical and Biological Engineering, Princeton University, 2Molecular Biology, Princeton University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 원고는 3 차원 (3D)의 균일 한 배열 세포 외 기질에 둘러싸여 정의 형상의 상피 조직을 설계 할 수있는 소프트 리소그래피 기반 기술을 설명합니다. 이 방법은 세포 형태 및 실험 문맥 다양한 의무가 있고 동일한 복제의 높은 처리량의 선별을 허용한다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

폐, 신장, 유선과 같은 분지 기관의 구조는 미세 환경에서 다양한 용해성 및 물리적 신호에 의해 조절되는 분지 형태 형성의 발달 과정을 통해 발생합니다. 여기에서는 세포외 기질(ECM) 내에 완전히 내장된 정의된 모양과 크기의 엔지니어링된 3차원(3D) 상피 조직을 형성하여 형태 형성 과정을 분기하는 과정을 연구하기 위해 만들어진 방법을 설명합니다. 이 방법을 사용하면 동일한 조직의 배열을 형성할 수 있으며 조직 기하학, 간격 및 ECM 구성을 포함한 다양한 환경 요인을 제어할 수 있습니다. 이 방법은 또한 견인력 현미경(TFM)과 같이 널리 사용되는 기술과 결합하여 세포와 주변 ECM 간의 상호 작용에 대한 더 많은 정보를 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜은 암 침습을 포함하여 형태형성 분지를 넘어 다양한 세포 및 조직 과정을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

분지 형태 형성으로 알려진 분 지형 상피 조직의 발달이 세포 유래 물리적 및 환경 인자에 의해 조절된다. 유선에서, 형태 형성을 분기하는 집단 세포 이동이 나무와 같은 구조를 작성하는 가이드를 통해 반복적 인 과정이다. 첫 번째 단계는 분기 개시 신도 1,2- 다음 유관에서 기본 봉오리 형성된다. 주변의 기질에 분기의 침략은 사춘기에서 스테로이드 호르몬의 전신 릴리스에 의해 유도된다. 새 차 싹은 기존 지점의 끝에서 시작하고,이 프로세스는 상피 나무 (3)를 작성하고 있습니다. 많은 중요한 생화학 적 신호가 확인되었지만, 이러한 복잡한 발육 과정은 부족 안내 세포 생물학적 메커니즘의 포괄적 이해. 또한, 특정 단서의 영향에 대한 역학적 연구 체험관에서 해체하기가 어렵습니다생체 내에서 사항은, 같은 정확한 시공간 섭동과 측정은 자주 할 수 없습니다.

이러한 전체 기관 배양 차 organoids 및 세포 배양 모델로서 3 차원 배양 기술은, 체계적 조직 형태 형성 4-6 기본 메커니즘을 연구에 유용한 도구이다. 이러한 이동, 증식 및 분화를 비롯한 세포 다양한 행동에 기계적 힘 생화학 적 신호로서, 각각의 특정 요인의 영향을 결정하는데 특히 유용 할 수있다. ....

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Protocol

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솔루션 1. 준비

  1. 인슐린의 5 ㎎ / ㎖ 용액을 제조 하였다 (용매 100 ㎖에 500 mg의 인슐린) O DH이 5mm의 염산 (HCL)과 분말 인슐린 스톡을 희석. 증류수 100 ㎖로 농축 염산 50 μl를 첨가하여 용매 100 ㎖ (DH 2 O)를 준비한다.
  2. PBS의 1X 용액을 제조하기 위해, 멸균 조건 하에서 DH 2 O로 배일 10 배 인산 완충 용액 (PBS) 원액을 희석.
  3. 다음으로, 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 탄성 중합체 용액을 제조 하였다 : 1 (w : w)의 비율로 10의 경화제와 함께 PDMS의 예비 중합체를 혼합한다.
  4. 다음과 같이 세포 배양 배지를 준비 : 재고 둘 베코의 변형 이글 중간의 500 ml의 : 식품 혼합물이 F-12 (DMEM는 / F-12), (10) 살균 소 태아 혈청의 ㎖ (FBS), 겐타 마이신 시약 500 μL 및 추가 5 ㎎ / ㎖의 인슐린 500 μL.
  5. W (1 % 추가 1X PBS 용액에서 1 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 제조: BSA 분말 V) 솔루션은 PBS를 1 배에서 철저하게 혼합합니다.
  6. 추가 I 콜라겐 중화 소 타입의 4 ㎎ / ㎖ 용액을 제조 50 μL ....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

유방 상피 조직의 미세 일반 회로도

실험적인 작업 흐름을 요약 한 미세 가공 절차의 일반 개략도가도 1에 도시되어있다. 결과적으로 완전히 ECM 겔에 포함되는 동일 형상 및 간격의 상피 조직의 배열이다. 대표적인 실험 I가 4 ㎎ / ㎖의 농도로 소 콜라겐 겔 타입의 배양 EpH4 마우스 유방 상피 세포를 사용한다. 설계 조직의 최고 품질을 보장하기 위해, 프로토콜에 설명 된 기술은 밀접하게 따라야한다. 유형으로 성형 된 사각형 우물의 배열도 2A와 2B 쇼 낮은 높은 배율의 뷰 내가 세포 파종하기 전에 젤 콜라겐. 웰의 형상은 실리콘 마스터 기능의 형상에 의해 결정된다. 이 일을 들어하는 것이 중요하다똑바로 콜라겐의 전자 PDMS 몰드 캐비티의 형상이 왜곡되지 않도록.도 2c는

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

위에서 설명한 프로토콜은 미리 정의된 모양의 동일한 상피 조직을 생성하는 방법을 간략하게 설명하여 조직의 세포가 경험하는 기계적 응력의 공간적 제어를 가능하게 합니다. 엘라스토머 몰드는 I형 콜라겐에 공동을 만든 다음 상피 세포로 채우고 추가 콜라겐 층으로 덮어 세포가 3D 콜라겐 매트릭스 환경에 완전히 캡슐화되는 데 사용됩니다. 이러한 조직의 추가 배양과 초기 구조에서 분지를 유도하기 위한 성장 인자로 처리하면 이 시스템은 상피 세포의 분지 형태 형성 연구에 적합하게 됩니다. 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 세포 파종 전에 PDMS 몰드를 겔화된 콜라겐에서 똑바로 위쪽으로 들어 올리는 것입니다. 이 단계에서 수평으로 이동하면 캐비티가 왜곡되고 더 이상 원하는 형상을 유지하지 않습니다. 그런 다음 구멍에 세포를 파종한 후 표면에 남아 있는 과도한 세포는 특히 조직에 매우 가까운 경우 패턴 조직의 거동을 방해할 수 있으므로 조심스럽게 씻어내는 것이 중요합니다. 그러나 너무 엄격하게 세척하면 세포가 충치에서.......

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Disclosures

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 NIH (HL118532, HL120142, CA187692), 데이비드 & 루실 패커드 재단, 카밀 & 헨리 드레퓌스 재단과 버로우즈에서 교부금에 의해 부분적으로 지원되었다 기금에 오신 것을 환영합니다. ASP는 샬롯 엘리자베스 프록터 경어 원정대에 의해 부분적으로 지원되었다.

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Materials

2

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
폴리디메틸실록산(PDMS)Ellsworth 접착제Sylgard 184
PDMS 경화제Ellsworth 접착제Sylgard 184
리소그래피 패턴 실리콘 마스터자체 제작N/A
플라스틱 계량 보트Fisher Scientific08-732-115
100mm 직경 페트리 접시BioExpressD-2550-2
에틸 알코올 200 프루프Pharmco-Aaper111000200
1:1 Dulbecco'와 혼합하여 70% EtOH(v:v) 용액을 만듭니다. 의 변형된 독수리' s 미디엄 : 햄' s F12 영양 혼합물 (DMEM/F12) (1:1)HycloneSH30023FS
Fetal Bovine Serum (FBS)Atlanta BiologicalsS11150H
10x Hank' s 평형 염 용액 (HBSS)Life Technologies14185-052
인슐린시그마 AldrichI6634-500MG
GentamicinLife Technologies15750-060
10x 인산염 완충 식염수 (PBS)Fisher ScientificBP399-500
수산화나트륨 (NaOH)Sigma Aldrich221465-500G
소 유형 I 콜라겐 (펩신화되지 않음)소IAC-50
알부민SigmaAldrichA-7906
곡선 스테인리스 스틸 핀셋Dumont7
직경 35mm 조직 배양 접시BioExpressT-2881-6
15 ml 원뿔형 튜브BioExpressC-3394-2
1.5 ml Eppendorf Safe-Lock TubeUSA Scientific1615-5500
원형 #1 유리 커버슬립, 직경 15mmBellco Glass Inc.특별 주문
0.05% 1x Trypsin-EDTALife Technologies25300-054
파라포름알데히드VWR100503-916
Triton X-100Perkin ElmerN9300260세제
HGFSigma AldrichH 966150 mg/ml에서 dH2O에 재현탁
토끼 안티 마우스 FAK 항체생명 기술AMO0672
염소 안티 토끼 Alexa 488 항체Life TechnologiesA-11034
Adobe PhotoshopAdobeN/A픽셀 주파수 맵의 색상 코딩에 사용됩니다.
FIJI (ImageJ)NIHN/A픽셀 주파수 맵을 생성하기 위해 이미지를 임계값, 등록 및 오버레이하는 데 사용되는 무료 이미지 분석 소프트웨어입니다. StackReg 플러그인은 바이너리 이미지를 등록하는 데 사용되었습니다.
dHO 면도날 American Safety Razor 620179 혈청 (BSA)에서 추출한 Koken

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Affolter, M., et al. Tube or not tube: remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis. Dev Cell. 4 (1), 11-18 (2003).
  2. Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K signaling in the regulation of branching morphogenesis. Biosystems. 109 (3), 403-411 (2012).<....

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