방법 논문

핵산의 여과 분리 : 간단하고 신속한 DNA 추출 방법

DOI:

10.3791/54289

⸱

2016년 8월 6일

 ,  ,  , 
1Center for Innovation in Global Health Technologies (CIGHT), Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 2Pritzker School of Medicine, The University of Chicago

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 여기에서 정량적 PCR에 의해 검출 된 전혈로부터 HIV 프로 바이러스 DNA의 단순하고 신속한 종이 기반의 DNA 추출 방법을 설명한다. 이 프로토콜의 다른 유전자 마커의 검출 또는 다른 증폭 방법을 이용하여 사용하기 위해 확장 될 수있다.

초록

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FINA 핵산 여과 분리 미만에서 2 분에 전혈 세포에서 DNA를 추출 분리막 및 흡수 패드를 통해 여과에 수직을 이용하는 신규 추출법이다. 혈액 시료는 세제 혼합 간단히 처리 및 분리막을 피펫에 의해 적용된다. 해물이 분리막의 표면에, 게놈 DNA를 캡처, 모세관 현상에 의한 블롯 패드에 심지. 추출 된 DNA는 PCR 억제제 흡수 블롯 패드에 악 상기 간단한 세척 단계 동안 막에 유지된다. 혼입 된 DNA를 함유하는 멤브레인은 추가의 정제없이 PCR 반응에 첨가된다. 이러한 간단한 방법은 실험 장비를 필요로하지 않고 쉽게 저렴 실험실 용품으로 구현 될 수있다. 여기에서 우리는 초기의 모델로 100 μL 전체 혈액에서 HIV-1 프로 바이러스의 DNA의 고감도 검출 및 정량을위한 프로토콜을 설명쉽게 다른 유전 적 목표에 적용 할 수있는 HIV의 영아 진단.

서론

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여러 보고서를 모두 사용할 수있는 절묘한 감성과 분자 진단의 특이성을 목적으로 현장 진료 (POC) 장치 1-5 사용하기 위해 종이 - 또는 멤브레인 기반 추출 방법의 개발을 논의했다. 세계 보건기구 (WHO) 성병 진단 이니셔티브는 POC의 (경제적, 민감한, 특정, 사용자 친화적 인, 신속하고 강력한 장비가없는 그것을 필요로하는 사람들 배달)을 설명하는 이상적인 특성 안심 용어를 만들어 낸 시험 6. 이 가이드 라인 중 장비가없는 특징은 분자 진단 달성하기 위해 특히 도전이다. 그러나, 필드에있는 모든 혁신은 가장 필요로하는 사람들을 도달 목표를 진행하며, 희망은 기존의 기술 (7)을 적용하여 테스트 성능을 단기적 개선이 있습니다.

여기에서 우리는 전체 혈액에서 DNA를 추출하는 간단한 프로토콜을 설명그 복잡한 화학 또는 실험실 장비를 필요로하지 않습니다. FINA (핵산 여과 분리) 시료의 제조 방법은 원래 샘플에 응답 케어 포인트 (POC)의 일부 정량적 PCR 같이 HIV-1 프로 바이러스를 검출하기 위해 전혈로부터 백혈구 DNA를 추출하기 위해 개발 된 제한된 리소스 설정 8-11에 사용 (qPCR에) 초기 유아 진단 (EID) 플랫폼입니다. FINA 추출 가역적 카오 트로픽 제 (12)의 존재 하에서 DNA 결합 실리카 막, 실리카 코팅 된 상자성 입자를 사용하는 종래의 정제 방법과 다르다. 대신, FINA 직접 전체 혈액에서 세포의 DNA를 추출하기 위해 분리막을 통해 수직 여과를 사용합니다. 혼입 된 DNA를 함유하는 멤브레인은 PCR 튜브에 직접 배치 및 하나 이후 즉시 증폭 9 건조 PCR 반응 또는 공기를 사용할 수있다. 어떤 카오 트로픽 제, 페놀 또는 알코올이 샘플의 추출에 이용되지 않으며, elimina팅 추출 처리 (13, 14)로부터 유도 qPCR의 강력한 억제제를 제거하기 위해 필요한 광범위한 세척 단계.

FINA 막을 시험편 멤브레인에 추가되기 전에 세포 용해 (11)에 의해 해방 된 세포 중 9 또는 게놈 DNA를 포착 할 수있다. 셀 캡처, 전체 피가 막에 직접 추가됩니다. 세포를이어서 10 mM의 수산화 나트륨을 첨가함으로써 막에 용해된다. 이 방법의 장점은 단지 3 단계를 포함하는 것이있다 : 1) 샘플을 첨가하는 단계; qPCR에 관 2) 세포 용해 / 세척 및 3) 필터 디스크 위치. 이 방법의 단점은 막 만의 막 디스크의 직경에 비례 셀들의 정의 된 번호를 저장할 수 있다는 것이다. EID 필요한 검출 한계에 도달하기 전혈 100 μL은 qPCR에 튜브를 배치하기에 너무 큰 필터를 수반 샘플 입력을 요구한다. 컬렉션에 추가하기 전에 샘플을 세제로 혈액 세포를 용균막을 처리하는 단계를 추가하지만 동일한 샘플 크기보다 작은 필터를 사용할 수있다. 우리는 높은 재현성, 단일 복사본 검출하고,이 테스트 구성 (11)를 사용하여 혈액 100 ㎕에서 HIV-1 프로 바이러스의 DNA의 한 작은 10 복사본의 정량을 입증 할 수 있었다.

이 보고서에서 우리는 원래 실험실 사용하기 위해 개발로 FINA 프로토콜을 설명합니다. FINA 시료 전처리 모듈로 알려진 막 / 필터 샌드위치 큰 일괄 적으로 준비하고 나중에 사용하기 위해 비축 할 수있다. 표본 경우이 과정이 2 분 소요 크기의 배치를 변화에서 수행 할 수 있습니다 추​​출 할 수 있습니다. qPCR에 바로 실행될 수 있거나 qPCR을 수행하는 것이 편리 할 때까지 삽입 된 DNA를 함유하는 필터를 저장할 수있다. 이 방법은 낮은과 높은 리소스 설정 모두에서 시료의 일상적인 분석을위한 매우 편리합니다.

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프로토콜

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윤리 문 : 본 연구에 사용 된 전체 혈액 표본은 인체를 이용한 연구로 간주되지 않습니다. 시편은 만족 임상 진단 목적을 위해 수득하고,이 시험편의 나머지 부분은 FINA 연구 시험에 제공 하였다. 시편은 연구자 용이 개인의 신원을 확인할 수 없었다되도록 부호화 하였다.

FINA 샘플 준비 모듈 1. 준비

  1. A A 2.6 mm의 35 X 35 mm 2 두께의 100 % 코튼 패드를 절단하여 패드를 모래 바닥 준비합니다. 표본 당 하나의 패드를 잘라.
  2. 다음 망치 중심 펀치 구멍을 사용하여 테이프의 중앙에 7.14 mm 직경의 구멍을 펀치 (50 () w mm 25 mm (H)) 파라핀 필름의 절단 조각이 용지 양면 테이프 플라스틱 파라핀 필름을 준비한다. 표본 당 하나의 테이프를 준비합니다.
  3. 8.35 mm 직경의 원형 펀칭에 의해 결합 된 유리 혈액 분리막 (캡처 막) 디스크를 준비망치 중심 구멍 펀치를 사용하여. 표본 당 하나의 디스크를 펀치. 디스크는 2.3 ㎛의 입자 보유 능력을 갖는다.
  4. 겸자를 이용하여 블롯 패드의 중앙에 포착 디스크를 배치하여 FINA 샘플 준비 모듈을 조립한다. 파라핀 테이프의 구멍이 노출 된 캡처 디스크의 중심 잎되도록 캡처 디스크 위에 파라핀 필름 테이프를 배치했다.
  5. 블로 팅 패드를 충당하기 위해 약간 파라핀 테이프를 스트레칭하고 디스크의 모든 가장자리 주위에 블로 팅 패드에 붙어 단단히 파라핀 테이프를 눌러 디스크와 블로 팅 패드 사이의 최대 접촉을 확인합니다.
  6. 나중에 사용하기 위해 실험 또는 비축에 필요한만큼 모듈을 확인합니다.

qPCR의 튜브 (2)의 제조

  1. 양면 polye의 원형 펀칭하여 형광 검출을 차단하는 멤브레인을 방지 qPCR에 튜브 측으로 세포 포획 막을 고정하는 5.1 mm 테이프 디스크를 준비테이프의 시트에서 망치 구동 펀치 진단 테이프를 오스터. 표본 당 하나의 테이프 디스크를 준비합니다.
  2. 테이프의 스티커 라이너의 한면을 제거합니다. 한쪽에 튜브의 바닥쪽으로 튀어 나와, 200 μl의 PCR 튜브에 테이프를 넣습니다. 두 번째 스티커 라이너를 제거합니다. 튜브는 이제 디스크 제조를 수신 할 준비가되어있다.
  3. 나중에 사용하기 위해 실험 또는 비축에 필요한만큼의 튜브를 생성합니다.

3. 고안 혈액 표본

참고 : 정품 시험편을 준비하는 경우, 4 단계로 진행합니다.

  1. 바이러스학 품질 보증 실험실에서 얻은 HIV-1 프로 바이러스의 단일 복사본을 품고 해동 8e5 - LAV 셀 (15) (VQA, 러쉬 장로교 / 세인트 루크 메디컬 센터, 시카고, IL.).
    참고 : 그들은 / μL 4,000 세포의 농도로 동결 세포 펠릿으로 저장됩니다. 이전 9 바와 같이 세포 수를 확인 하였다.
  2. 산이 준비/ μL 일 400 세포의 농도 범위로 배지 (90 % 소 태아 혈청, 10 % 디메틸 술폭 시드)를 동결 IAL 희석.
  3. 미세 원심 튜브에 희석액에서 각각 10 μL 피펫 셀. 8e5 - LAV 복사 번호 10-4,000의 표준 곡선을 만들기 위해 각각의 튜브에 신선한 HIV-1 네거티브 EDTA 처리 된 전체 혈액 샘플 100 μl를 추가합니다. 부드럽게 튜브의 5 배를 바닥을 쓸어 넘겨 섞는다.

4. FINA 추출을 수행

  1. 110 μL 전혈 단계 3.3에서 세포)에 1 % (11 ㎕의 10 % 트리톤 X100 최종 농도 트리톤 X100)을 첨가하여 다운 Lyse 혈구.
  2. 부드럽게 튜브의 5 배를 바닥을 쓸어 넘겨 섞는다. 혈액은 반투명 빨간색을 설정해야합니다.
  3. 피펫 캡처 디스크에 혈액 표본의 모든.
    참고 : 파라핀 테이프 캡처 막 사이의 물이 꽉 밀봉 피가 막 흐르는 것을 보장하고, 캡처 m 사이 좋은 접촉embrane 및 블로 팅 패드 어셈블리는 빠른 샘플 위킹을 보장합니다.
  4. 샘플 필터를 통해 흡수 할 수 있습니다.
    주 : 모세관 현상에 블롯 패드에 피 파쇄 심지를 캡처 디스크 표면의 게놈 DNA를 캡쳐. 이 매트를 표시 할 때 해물 디스크에 배어있다.
  5. 캡처 디스크에 600~1,000 ㎕의 10 mM의 NaOH를 드롭 현명한을 추가합니다.
    주 : 세척 완충액은 600 μL의 대량 첨가로 첨가 할 수있다. 버퍼는 소수성 파라핀 테이프에 액 적을 형성하고, 약 20 초간의 디스크로 구멍을 통해 심지 할 것이다. 이 필터는 헤모글로빈의 흰색을 나타내는 통관에 빨간색으로 변경됩니다.
  6. 집게와 블로 팅 패드에서 디스크를 분리하고 준비된 PCR 튜브에 테이프에 디스크를 적용합니다. 필터에 남아있는 붉은 색이있는 경우 튜브에 배치하기 전에 필터를 취소 세척 버퍼의 50 ~ 100 μl를 추가합니다.
    참고 : 가끔, 초과 압력이 준비 중에 적용블로 팅 패드에서 분리 동안 멤브레인 층의 파티션에서 FINA는 모듈의 결과. 이러한 디스크를 폐기하고 새로운 샘플을 준비합니다.
  7. 필터는 PCR 튜브에 배치 한 후, 바로 샘플을 분석 할 수 있습니다. 또한, 상자 포함 된 황산 칼슘 건조 건조 하룻밤은 다음 분석을위한 준비가 될 때까지 실리카 건조 및 저장과 호일 주머니에 모자 장소.

5. qPCR에 반응

  1. 이전에 9,11 바와 같이 HIV는 특정 프라이머 및 프로브를 사용하여 반응 당 100 μL qPCR에 마스터 믹스를 준비합니다. 내부 증폭 제어 증폭 억제제의 존재를 모니터링하고 음의 샘플이 진정한 부정적 있는지 확인을 포함합니다. 필터가 완전히 마스터 믹스 필터 반응을 통해 튜브의 측면에 고정 된 상태를 유지하는 것이 포함되어 있는지 확인합니다.
  2. 이전 9 바와 같이 실시간 PCR 기기를 사용하여 증폭을 수행한다.

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결과

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8e5 - LAV 세포 아군 전체 혈액에서 프로 바이러스 DNA를 추출하기위한 워크 플로는 그림 1과 같다. 2는 FINA 샘플 모듈을 보여주고 qPCR에 튜브를 준비 그림. 인위적인 시험편 (도 3)의 표준 곡선에 도시 된 바와 같이,이 방법은 다른 사본 번호에 8e5-LAV 세포에서 HIV-1 프로 바이러스의 효율적인 증폭을 허용한다. PCR 효율 = -1 + 10 (-1 / 경사)으로부터 계산 한 103 %의 효율을 얻었다. 라인의 방정식은 R² = 0.996의 상관 관계 = -3.25x + 27.95 Y이었다. 에이즈 프로 바이러스 DNA의 표준 곡선은 표 1에서 알 수 있듯이 또한 높은 재현성 증폭을 복제. 또한 Hydroxypyruvate 환원 효소가 다수의 독립 FINA으로 혈액을 추출 ...

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토론

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빠른 치료 액세스 링크 EID 의한 HIV 감염 16 유아 사망률 감소하는 것으로 입증되었다. 때문에 유아의 혈액 모체 항체의 지속성 신속 HIV 항체 테스트는 HIV에 노출 된 유아의 상태를 결정하는 유틸리티를 제한하고있다. 보건기구 (WHO)는 HIV-1 양성 산모에게서 태어난 모든 유아는 바이러스 학적 검사 (17)를 사용하여, 연령 4 ~ 6 주에 테스트해야하는 것이 좋습니다. 우리는 (61) 남아프리카 유아 (11)의 작은 분야 평가에서 보여 100 %의 민감도와 특이 단일 복사본 검출 할 수있는 전체 혈액 표본에서 HIV-1 프로 바이러스의 DNA의 검출과 정량을위한 분석의 발전을보고했다. 백 마이크로 리터 또는 전혈 이상의 손가락 스틱 뒤꿈치를 통해 수집하고 FINA 모듈 (18, 19)를 통해 처리 될 수있다. 이러한 혈액 시료는 증폭이 방법 IDE하기 전에 적어도 한 달 동안 저장 될 수있다알 실험실에서 멀리있는 유아를 테스트합니다....

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 프로토콜 개발은 Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health 보조금 37774의 지원을 받았습니다. Real-Time PCR 시약 및 조언은 Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL에서 제공했습니다. 8E5-LAV 세포는 Rush Presbyterian의 Virology Quality Assurance Laboratory에서 제공했습니다. 세인트 루크 메디컬 센터. HIV-1 음성 혈액은 일리노이주 에반스턴에 있는 NorthShore University HealthSystems의 Core Lab에서 제공했습니다. 사진 촬영에 도움을 준 Mark Fisher에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Fusion 5GE Healthcare Life Sciences8151-9915
707 블로팅 패드VWR International28298-014
PARAFILM MVWR International52858-000
3M 양면 폴리에스테르 진단 테이프 3M 의료 전문9965
200 &마이크로; l qPCR 스트립 튜브애질런트401428
광학 스트립 캡애질런트401425
Mx3005p qPCR 시스템애질런트401456
수산화나트륨시그마-알드리치221465A.C.S. 시약
트리톤 X-100시그마-알드리치T9284BioXtra
디메틸 설폭사이드시그마-알드리치D8418분자
태아 소 혈청, 인증, 미국 원산지Thermo Fisher Scientific16000-044
해머 구동 작은 구멍 펀치 3/16" 구멍 직경 (5.1 mm)McMaster Carr3424A16
해머 구동 작은 구멍 펀치 1/4" 구멍 직경 (7.14 mm)McMaster Carr3424A19
해머 구동 작은 구멍 펀치 5/16" 구멍 직경 (8.35 mm)맥마스터 카3424A23
생물학

참고문헌

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  3. Govindarajan, A. V., Ramachandran, S., Vigil, G. D., Yager, P., Bohringer, K. F. A low cost point-of-care viscous sample preparation device for molecular diagnosis in the developing world; an example of microfluidic origami. Lab Chip. 12 (1), 174-181 (2012).
  4. Linnes, J. C., et al. Paper-based molecular diagnostic for. RSC Adv. 4 (80), 42245-42251 (2014).
  5. Rodriguez, N. M., et al. Paper-Based RNA Extraction, in Situ Isothermal Amplification, and Lateral Flow Detection for Low-Cost, Rapid Diagnosis of Influenza A (H1N1) from Clinical Specimens. Anal Chem. 87 (15), 7872-7879 (2015).
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  10. Kelso, D. M., Jangam, S., Yamada, D., McFall, S. Google Patents. , (2012).
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  12. Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).
  13. Radstrom, P., Knutsson, R., Wolffs, P., Lovenklev, M., Lofstrom, C. Pre-PCR processing: strategies to generate PCR-compatible samples. Mol Biotechnol. 26 (2), 133-146 (2004).
  14. Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).
  15. Folks, T. M., Powell, D. M., Martin, M. A. Google Patents. , (1991).
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  18. Gruner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. Dried blood spots--preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques. J Vis Exp. (97), (2015).
  19. Maiers, T. J., et al. An investigation of fingerstick blood collection for point-of-care HIV-1 viral load monitoring in South Africa. S Afr Med J. 105 (3), 228-231 (2015).

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PCRPCRHIV 1

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