방법 논문

이미징 유동 세포 계측법에 의해 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 특성 : 두 단핵구 격리 프로토콜 사이의 비교

DOI:

10.3791/54296

⸱

2016년 10월 18일

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1Department of Immunology, Herbert Wertheim College of Medicine, Florida International University, 2Millipore Sigma

이 논문에서

요약

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이 연구는 체외 수지상 세포(DC)를 얻기 위한 두 가지 다른 인간 단핵구 분리 방법을 비교합니다. 단핵구는 부착에 의해 선택되거나 자기 분리에 의해 음적으로 강화됩니다. MDDC 생존력, 증식 및 CD11c/CD14 표면 마커 발현과 함께 단핵구 수율 및 생존율을 두 방법 간에 비교합니다.

초록

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수지상 세포(DC)는 림프구 반응, 숙주 방어 메커니즘 및 염증의 발병에 중요한 역할을 하는 면역 체계의 항원 제시 세포입니다. DC의 분리 및 연구는 독특한 특징 때문에 생물학 연구에서 중요했습니다. DC는 면역 체계의 필수 핵심 매개체이지만 혈액에서는 매우 드물며 전체 혈액 단핵 세포의 약 0.1 - 1%를 차지합니다. 따라서 분리 방법의 대안은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 분리된 단핵구와 DC의 분화에 의존합니다. 단순성, 경제성, 고순도 및 높은 세포 수율을 결합한 적절한 분리 기술의 활용을 반드시 고려해야 합니다. 현재 연구에서는 DC 생성을 위한 두 가지 고유한 방법을 비교합니다. 단핵구는 자기 분리 절차를 사용하여 부착 또는 음성 농축에 의해 선택된 후 IL-4 및 GM-CSF를 사용하여 DC로 분화되었습니다. 단핵구 및 MDDC 생존율, 증식 및 표현형은 이미징 유세포 분석을 통한 생존능 염료, MTT 분석 및 CD11c/CD14 표면 마커 분석을 사용하여 평가되었습니다. 자기 분리 방법은 접착 방법과 비교할 때 더 높은 증식 능력을 가진 단핵구의 비율이 훨씬 더 높았지만, 이번 연구 결과는 배양에서 7일 후에 생존 가능한 CD11c+ MDDC로 증식 및 분화할 수 있는 단핵구를 동시에 생성하는 두 기술의 능력을 입증했습니다. 두 방법 모두 70%> CD11c+ MDDC를 산출했습니다. 따라서 우리의 결과는 인간 DC의 격리 및 특성화를 위한 신뢰할 수 있는 방법을 개발하는 데 기여하는 통찰력을 제공합니다.

서론

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수지상 세포 (DC가)는 타고난 및 적응 면역 시스템의 중요한 매개체이다. 이들은 차 면역 반응을 유도하는 면역 학적 기억의 개발을 용이하게하는 기능을한다. 이러한 세포는 항원을 포획, 마이그레이션 및 T 세포 자극을 주로 담당하므로 수지상 .Manipulation 다른 치료 연구의 다양한 분야에 걸쳐 상기 임상 환경에서 이용 될 수있는 한 같은 전문 항원 제시 세포 (APC를)라고 이러한 HIV 6,7 암 (8)과 같은 염증성 질환,자가 면역 질환 9 및 알레르기 반응 (10). 수지상은 또한 알코올 의존 11-14, 13, 15, 약물 의존성, 및 HIV 감염 및 약물 남용 16-19의 조합과 관련된 것과 같은 미지의 메커니즘 경로를 해결하기 위해 약물 남용 연구에 이용되고있다. 이러한 지속적인 연구와 미래 연구 조사 전n은 면역학 분야의 연구에 매우 중요한 수지상 세포의 체외 세대합니다. 총 혈액 단핵 세포 (20)의 1 % - 그러나, 이들이 0.1를 구성하는 인간 혈액 수지상 세포 분리와 연관된 여러 가지 어려움이있다.

지금까지 DC가

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프로토콜

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전체 인간의 혈액 연구를 검토하고, IRB 프로토콜 승인 번호의 IRB-13-0440 FIU의 임상 시험 심사위원회 (IRB)에 의해 승인되었습니다. 인간 leukopaks 마이애미, 플로리다의 지역 사회 혈액 은행에서 구입 하였다.

표준 밀도 그라데이션 기법에 의해 PBMC를 1. 분리

  1. T75 플라스크에 1 배 - 인산 완충 생리 식염수와 혈액의 1 희석 : 1을 수행합니다.
  2. 피펫 (15) 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 밀도 구배 용액의 ml를 조심스럽게 층 -이 그라데이션을 통해 희석 된 혈액 (25 ~ 30 ㎖ / 튜브).
  3. 1의 가속과 0의 감속 1,200 XG에서 20 분 동안 원심 분리기.
  4. 원심 분리 후, 새로운 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 계면 층 (백혈구)를 수집하여 PBS로 두 번 (1080 XG에서 3 분) 세포를 세척 하였다. 때마다 뜨는 폐기하십시오.
  5. 암모늄, 염화 칼륨, 용균 (ACK) 완충액으로 세포를 치료 (적혈구를 용해시키기 위해). 버퍼와 10 ML을 추가4 ℃에서 15 분 동안 cubate.
  6. 1,080 XG에서 3 분 동안, PBS로 두 번 원심 분리기 세포를 씻고마다 상층 액을 버린다.
  7. ....

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결과

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자기 분리에 의해 단핵구의 수율은 준수 방법에 의해 단핵구 수익률에 높은를 비교한다

PBMC를하고 단핵 세포의 분리 분리의 날에 트리 판 블루 배제 법에 의해 그림 1 표시 PBMC와 단핵구 세포 수에 제시된 데이터. 자기 분리에 의해 격리 된 단핵 세포는 PBMC를의 최대 25 %를 차지하면서 평균적으로 부착 방법에 의해 고립 된 단핵구는 총 PBMC를 약 6.2 %를 차지했다. 통계 분석은 자기 분리에 의해 산출 단핵 세포의 비율이 상당히 높은 (≥ 4 배)이었다 것으로 나타났습니다. 데이터는 적어도 3 개의 독립적 인 실험의 평균 ± SD로 나타낸다. 두 가지 방법 (0.0005 ≤ p)를 비교했을 때 단핵구 수율의 유의 한 차이를 보였다 -test 학생의 t을 사용하여 통계 분.......

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토론

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단리 인간 혈액으로부터 MDDCs를 생성하는 알려진 문제에 기초하여, 본 연구는 MDDCs의 생성이 잘 확립 된 방법의 포괄적 인 비교를 제공하는 것을 목표로. 비교 첫 번째 방법은 유리 또는 플라스틱 (접착 방법) 21,22,27에 부착 단구의 능력을 이용하여 MDDCs을 생성하는 잘 정립 된 전통적인 방법이다. 접착력 방법은 빠르고 효과적인 비용 및 복잡한 장비의 사용을 요구하지 않는다. 그러나,이 방법의 단점은 림프구 오염, 낮은 유연성, 단핵구 과도 조작 22,30,31를 포함한다. 비교 2 대안 방법에 의해 음성 선별 된 PBMC로부터 단핵구를 분리하기 위해 디자인 된 인간 단핵구 농축 키트 (26)를 사용하여 전체 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 단핵구를 자기 분리한다. 이 분리 방법의 장점은, 원하지 않는 셀이며표지와 표적 세포를 자유롭게 열 직접 항체로 세포를 표적으로하지 않고도 새로운 튜브 속으로 주입하면서 자석을 이용하여 분리된다. 상관없이 단.......

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공개 사항

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모든 저자는 경쟁하는 금전적 이해관계를 공개하지 않습니다.

감사의 글

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이 연구는 국립 알코올 남용 및 알코올 중독 연구소(National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism)의 지원을 받아 K99/R00 AA021264상을 수상했습니다. 스타트업 패키지의 일환으로 면역학과, 신경면역 약리학 연구소, Herbert Wertheim 의과대학 및 FIU(연구 및 경제 개발국)로부터 추가 실험실 지원을 받았습니다. Gianna Casteleiro는 NIH/NIGMS R25 GM061347의 지원을 받았습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Ficoll-PaqueGE Healthcare17-5442-03반드시 RT
인산염 완충 식염수(PBS)Life Technologies10010-023
ACK 용해 완충액Quality Biological118-156-101
RPMI 1640 매체Life Technologies22400-089
항생제-항진균제(100x)Life Technologies15240-062
소 태아 혈청(FBS)Life Technologies16000-044
RoboSep 완충액StemCell20104
EasySep 인간 단핵구 농축 키트StemCell19059
TC20 자동 세포 계수기Bio-Rad145-0101
FITC-덱스트란시그마 AldrichFD4-100MG
트리판 블루 스테인(0.4%)Life Technologies15250-061
Synergy 2 다중 모드 리더Biotek7131000
XTT 나트륨 염 생물 시약(XTT)Sigma AldrichX4626-100MG
디메틸 설폭사이드 생물 시약(DMS)Sigma AldrichD8418-500ML
티아졸릴 블루 테트라졸륨 브로마이드(MTT)Sigma Aldrichm5655-500MG
나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)Bio-Rad161-0302
페나 진 메토 설페이트 (DMSO)시그마 AldrichP9626-1G
비활성화 (HI) 인간 혈청ChemiconS1-100ML
Accuri C6 유세포 분석기BD Accuri653119
FlowSight Amnis 유세포 분석기EMD Millipore100300

참고문헌

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  1. Cella, M., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Origin maturation and antigen presenting function of dendritic cells. Curr Opin Imunol. 9, 10-16 (1997).
  2. Banchereau, J., et al. Immunobiology of Dendritic Cells. Ann Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
  3. Banchereau, J., Stein....

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재인쇄 및 허가

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Monocyte IsolationDendritic Cell GenerationImaging Flow CytometryMagnetic SeparationAdherence MethodCD11c CD14 AnalysisPeripheral Blood Mononuclear CellsHuman Monocyte DifferentiationViability Proliferation AssessmentSingle Cell Analysis

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