이미징 유동 세포 계측법에 의해 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 특성 : 두 단핵구 격리 프로토콜 사이의 비교

Summary

이 연구는 체외 수지상 세포(DC)를 얻기 위한 두 가지 다른 인간 단핵구 분리 방법을 비교합니다. 단핵구는 부착에 의해 선택되거나 자기 분리에 의해 음적으로 강화됩니다. MDDC 생존력, 증식 및 CD11c/CD14 표면 마커 발현과 함께 단핵구 수율 및 생존율을 두 방법 간에 비교합니다.

Abstract

수지상 세포(DC)는 림프구 반응, 숙주 방어 메커니즘 및 염증의 발병에 중요한 역할을 하는 면역 체계의 항원 제시 세포입니다. DC의 분리 및 연구는 독특한 특징 때문에 생물학 연구에서 중요했습니다. DC는 면역 체계의 필수 핵심 매개체이지만 혈액에서는 매우 드물며 전체 혈액 단핵 세포의 약 0.1 - 1%를 차지합니다. 따라서 분리 방법의 대안은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 분리된 단핵구와 DC의 분화에 의존합니다. 단순성, 경제성, 고순도 및 높은 세포 수율을 결합한 적절한 분리 기술의 활용을 반드시 고려해야 합니다. 현재 연구에서는 DC 생성을 위한 두 가지 고유한 방법을 비교합니다. 단핵구는 자기 분리 절차를 사용하여 부착 또는 음성 농축에 의해 선택된 후 IL-4 및 GM-CSF를 사용하여 DC로 분화되었습니다. 단핵구 및 MDDC 생존율, 증식 및 표현형은 이미징 유세포 분석을 통한 생존능 염료, MTT 분석 및 CD11c/CD14 표면 마커 분석을 사용하여 평가되었습니다. 자기 분리 방법은 접착 방법과 비교할 때 더 높은 증식 능력을 가진 단핵구의 비율이 훨씬 더 높았지만, 이번 연구 결과는 배양에서 7일 후에 생존 가능한 CD11c+ MDDC로 증식 및 분화할 수 있는 단핵구를 동시에 생성하는 두 기술의 능력을 입증했습니다. 두 방법 모두 70%> CD11c+ MDDC를 산출했습니다. 따라서 우리의 결과는 인간 DC의 격리 및 특성화를 위한 신뢰할 수 있는 방법을 개발하는 데 기여하는 통찰력을 제공합니다.

Introduction

수지상 세포 (DC가)는 타고난 및 적응 면역 시스템의 중요한 매개체이다. 이들은 차 면역 반응을 유도하는 면역 학적 기억의 개발을 용이하게하는 기능을한다. 이러한 세포는 항원을 포획, 마이그레이션 및 T 세포 자극을 주로 담당하므로 수지상 .Manipulation 다른 치료 연구의 다양한 분야에 걸쳐 상기 임상 환경에서 이용 될 수있는 ^한 같은 전문 항원 제시 세포 (APC를)라고 이러한 HIV ^6,7 암 ^(8)과 같은 염증성 질환,자가 면역 질환 ⁹ 및 알레르기 반응 ^(10). 수지상은 또한 알코올 의존 ^{11-14, 13, 15,} 약물 의존성, 및 HIV 감염 및 약물 남용 ^16-19의 조합과 관련된 것과 같은 미지의 메커니즘 경로를 해결하기 위해 약물 남용 연구에 이용되고있다. 이러한 지속적인 연구와 미래 연구 조사 전n은 면역학 분야의 연구에 매우 중요한 수지상 세포의 체외 세대합니다. 총 혈액 단핵 세포 ^(20)의 1 % - 그러나, 이들이 0.1를 구성하는 인간 혈액 수지상 세포 분리와 연관된 여러 가지 어려움이있다.

지금까지 DC가 체외의 생성에 대한 확립 된 방법 중 일부는 ⁽²²⁾ 자기 활성 셀 정렬, 형광 활성화 된 셀 정렬로 단핵 세포 ^{(21, 22)의} 플라스틱이나 유리 준수, 밀도 기울기 원심 분리 ^(23), 특정 마커 기반의 분리 구성 ^24, 덱스 트란 코팅 자성 나노 입자 ^(25), 및 완전 자동화 된 음의 셀 선택 ^(26)를 사용하여 고순도 단핵 세포의 신속한 분리를 사용하여 CD14 +의 단핵 세포의 긍정적 인 선택. 그러나 선택의 가장 좋은 방법은 논란이 남아있다. 따라서, DC 생성 기술을 개선하기 위해 다양한 방법이있는 개발되어왔다이러한 세포의 순도가 크게 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 단리 정제하여 ²⁷ CD34 + 조상 세포 및 단핵 세포의 분화에 의해 증가 될 수있다. 앞서 언급 한 바와 같이, 단핵구 유래 수지상 세포 (MDDCs)을 생성하는 광범위하게 사용되는 대중적인 방법은 유리 또는 플라스틱 (접착 방법) ^21,22,27에 부착 단구의 능력을 조사하는 것이다. 접착력 방법은 복잡한 장비의 사용을 요구하지 않고 신속하고 간단한 방법이다. 그러나,이 방법의 단점은 림프구 오염, 낮은 유연성, 단핵구 과도 조작 ^{(28)를 포함한다.} 접착력 방법의 대체 방법은 특별히 음성 선별 ^(26)에 의해 한 PBMC로부터 단핵구를 분리하기 위해 디자인 된 인간 단핵구 보충 키트를 사용하여, 총 한 PBMC로부터 단핵구를 자기 분리한다. 이 절차를 수행하는 동안, 원치 않는 세포는 테트라와 제거를 대상으로항체 복합체 및 덱스 트란 코팅 된 자성 입자. 이 분리 방법의 장점은 원치 않는 표지화 된 세포가 표적 세포를 자유롭게 열 필요없이 새로운 튜브 속으로 주입 될 수 있지만 자석을 이용하여 분리되어 있다는 것이다. 지금까지 고유 한 세포 인구 레이블을 수있는 특정 단일 클론 항체의 가용성, 자기 분리 기술은 추가 방법,하지만 면역학 분야의 희귀 세포의 분리에 대한 필요성 단순히되고있다. 예를 들면, 자기 셀과 같은 기술 연구 및 임상 응용 ^22,29 새로운 방법의 개발을 용이 한 시판 상자성 나노 입자-MACS 선별. 또한, 단핵구의 부착 및 MACS 기술 방법에서 DC 생성을 비교하는 최근의 연구 조사는 단핵 세포 ^22,30 분리 MACS를 사용하여 더 높은 DC 순도 및 생존 능력을 증명하고있다.

본 연구의 선물상업용 인간 단핵구 보충 키트를 사용하여 접착 한) 단핵 세포 분리 및 2) 단핵 세포 분리 음성 선별 기준 : PBMC를 분리 인간 단핵구로부터 수지상 세포의 생성에 대한 두 가지 방법의 비교. 이 연구는 부착 방법에 의해 고립 된 단핵구와 비교했을 때 단핵구를 분리 할 수있는 음의 선택 자기 분리 절차는 단핵 세포 생존 능력에 유의 한 차이 단핵 세포의 가장 높은 수율을 생성하는 보여주는 증거를 제공합니다. 차례로, 7 일 후에, 자기 분리에 의해 고립 된 단핵구는 MDDC 생존에 영향을주지 않고 상당히 높은 증식 능력과 더블 플러스 (중 CD11c + / CD14 +) 표현형을 발현하는 세포의 높은 양의 MDDCs로 분화. 그것은 동시에 증식과의 CD11c로 분화 할 수있는 단핵 세포를 생성하는 두 가지 기술의 능력을 입증 때문에 전체적으로 현재 연구 + 위에서 언급 한 선행 연구와 다르다자신의 가능성을 손상시키지 않고 문화 7 일 후에 MDDCs (> 70 %). 또한, 현재의 방법은 유동 세포 계측법 촬상 다를은 CD11c / CD14 MDDCs는 인구의 처음 특성을 제공한다.

수지상은 면역학 분야의 연구에 관한 초점 역할 때문에 이들이 유도 된 어떤 방법은 시험관 내에서 이들을 분리하고 배양하기 위해 사용되는 방법을 고려하면 요약하면, 다른 파라미터가 고려되어야한다. 따라서 본 연구는 두 가지 단핵구 분리 방법 및 방법이 방법은 차등 결국 수지상 세포 생존, 증식 및 단핵구의 표현형에 영향을 생존 및 수율에 영향을 통찰력을 제공하는 것을 목적으로한다. 이러한 발견은 면역학 분야에 크게 기여하고 DC 분리, 정제 및 특성에 대한 상세한 프로토콜을 제공한다.

Protocol

전체 인간의 혈액 연구를 검토하고, IRB 프로토콜 승인 번호의 IRB-13-0440 FIU의 임상 시험 심사위원회 (IRB)에 의해 승인되었습니다. 인간 leukopaks 마이애미, 플로리다의 지역 사회 혈액 은행에서 구입 하였다.

표준 밀도 그라데이션 기법에 의해 PBMC를 1. 분리

1. T75 플라스크에 1 배 - 인산 완충 생리 식염수와 혈액의 1 희석 : 1을 수행합니다.
2. 피펫 (15) 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 밀도 구배 용액의 ml를 조심스럽게 층 -이 그라데이션을 통해 희석 된 혈액 (25 ~ 30 ㎖ / 튜브).
3. 1의 가속과 0의 감속 1,200 XG에서 20 분 동안 원심 분리기.
4. 원심 분리 후, 새로운 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 계면 층 (백혈구)를 수집하여 PBS로 두 번 (1080 XG에서 3 분) 세포를 세척 하였다. 때마다 뜨는 폐기하십시오.
5. 암모늄, 염화 칼륨, 용균 (ACK) 완충액으로 세포를 치료 (적혈구를 용해시키기 위해). 버퍼와 10 ML을 추가4 ℃에서 15 분 동안 cubate.
6. 1,080 XG에서 3 분 동안, PBS로 두 번 원심 분리기 세포를 씻고마다 상층 액을 버린다.
7. PBMC를을 포함하는 펠렛을 저장합니다.
8. 선택의 단핵 세포 정제 방법으로 진행합니다.

준수 방법 2. 단핵구 정화

1. L 글루타민 하였다 (300 mg / ㎖)을 포함한 전체 세포 배양 배지를 준비 페니실린 (50 U / ㎖) -streptomycin (50 μg의 / ml) 및 10 % 소 태아 혈청.
2. 이 PBMC를 가습 인큐베이터에서 37 ° C, 5 % CO _2에서 완전 배지 10 ㎖ 당 5 × ¹⁰⁷ 세포의 농도에서 T75 플라스크에 이들을 배양하여 약 2 시간 동안 부착 할 수있다.
3. 배양 후, 배양 플라스크에서 비 부착 떠있는 세포를 제거하고 부드럽게 PBS로 두 번 부착 세포를 씻는다.
4. 인간 과립구 macr 2 μL / mL로 보충 된 완전 세포 배양 배지에서 부착 세포를 부화ophage 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 및 인터루킨 4 (IL-4)를 10 μg의 / ㎖ 스톡 농도로 저장된다.
5. 매체의 절반을 변경하고 사이토 카인마다 48 시간을 보충.
6. MDDCs에 단핵 세포의 분화 7 일 - 5 허용합니다.

자기 분리 방법 3. 단핵구 정화

1. 5 ml의 폴리스티렌 튜브에 붓고 세포 / ml의 농도로 PBS 버퍼에 일시 중지 다시 표준 밀도 구배 기법으로부터 PBMC를 수집.
2. 50 μL / ㎖의 세포를 사용하여 인간 단핵 세포 농축 칵테일을 추가 잘 혼합하고 10 분 동안 4 ° C에서 품어.
3. 배양 후, 50 μL / ml의 세포를 사용하여 자성 입자를 추가 잘 혼합하여 4 ℃에서 5 분간 배양한다.
4. , PBS 완충액을 첨가하여 2.5 ml의 총 부피까지 세포 현탁액을 가지고 다운이 닫 피펫 팅하여 잘 혼합하고 - 3 회.
5. 자기 장치에 캡없이 폴리스티렌 튜브를 삽입하고이 동안 실온에서 방치0.5 분.
6. 배양 후와 하나의 연속 동작으로, 자석을 선택하고 깨끗한 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 원하는 정제 단핵 세포 분획을 붓는다.
7. 전체 세포 배양 인간 과립구 - 대 식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)을 2 μL / mL로 보충 된 배지 4 인터루킨에 부착 세포를 부화 (IL-4)를 10 μg의 / ㎖ 스톡 농도로 저장된다.
8. 모든 48 시간은 매체의 절반을 변경 5 분 동안 1,080 XG에 스핀 다운 및 새로운 미디어 (CRPMI) 및 사이토 카인과 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
9. MDDCs에 단핵 세포의 분화 7 일 - 5 허용합니다.

4. 트리 판 블루 제외 생존 분석

참고 : PBMC를, 단핵구 및 MDDCs의 세포 수율과 생존을 얻기 위해이 기술을 사용합니다.

1. 표준 트립신 EDTA를 사용하여 플라스크하고 PBS를 이용하여 세포 펠렛의 세척을 수행 수확 세포. 펠렛의 크기에 따라 재펠렛을 용해 PBS 5 내지 10 ml의 정지.
2. 희석 된 세포 펠렛과 트리 판 블루 시약 1 희석 마이크로 원심 분리 튜브에 1을 수행한다.
3. 이 믹스에서 셀에 나누어지는 10 μl의 슬라이드를 계산하고 제조 업체의 프로토콜에 따라 자동 세포 계수기를 사용하여 결과를 참조하십시오. 자동 세포 계수기를 사용할 수없는 경우 유사한 세포 수는 혈구 또는 수동 계수기를 사용하여 가능하다.

5. MTT 분석

1. 웰 96 웰 플레이트의 각으로 완전한 미디어 4 × 10 ^{100분의 4} μL의 농도로 플레이트 세포. 세포는 문화에 적응하기위한 24 시간을 허용합니다.
2. 품어 각각 0 (0 일), 36 (3 일), 84 (7 일) 시간에 측정을 수행합니다.
3. 원하는 배양 완료시, 미디어를 제거하고 혼자 PBS 100 ㎕로 교체합니다.
4. 준비 3- (4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일) - 다이 메틸 10 ㎖를 첨가하여 -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 용액 (MTT) (5 ㎎ / ㎖)도데 실 황산나트륨 1g을 (SDS)에 일 설폭 사이드 (DMSO).
5. 각 웰에 MTT 용액 10 μL (5 ㎎ / ㎖)를 첨가하고, 추가 2 시간 동안 37 ℃에서 배양한다.
6. 부화 후, PBS와 회심 MTT 혼합물 (노란색 컬러 솔루션)를 포함 상층 액을 제거합니다.
7. 각 웰에 SDS-DMSO 용액 100 μl를 추가하고 하나의 추가 시간 동안 배양한다.
8. 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 참조하십시오.

6. 세포 표면 이미징 유동 세포 계측법에 의해 염색 분석

1. 정제 단핵 세포에서 분화 7 일 후, 1.5 ml의 튜브의 해당 번호로 단핵구 유래 수지상 세포의 1 × ⁶ 전지 씩 분배.
2. 불 활성화 열 50 μL (HI) 인간 혈청을 사용하여 차단하는 세포에 의해 세포 표면의 얼룩을 시작, 10 분 동안 4 ° C에서 품어.
3. 배양 후, 원심 분리기 세포 5 분 720 XG에는, 상층 액을 버린다.
4. PELLE 셀t는 각각의 형광 색소 - 컨쥬 게이트 된 항체 (예, 항 중 CD11c 또는 항 CD14)를 첨가하고, 빛으로부터 보호 된 20 분 동안 4 ℃에서 배양한다. 그들은 보상을 위해 필요하기 때문에 별도의 튜브에서) 하나의 형광 색소 묻은 샘플 / ㎖를 준비합니다.
5. 배양 후, 5 분 동안 720 XG에서 PBS 버퍼와 원심 분리기 1 ㎖ 때마다 두 번 세포를 씻으십시오.
6. 빛으로부터 보호 셀을 유지하는 유동 세포 계측법 분석을위한 세포 / 100 ㎕의 농도로 PBS 완충액에 재현 정지.
7. 생존 세포의 게이트하기 위해, 종래 제조업체의 지시에 따라 악기 계측법 단세포 촬상 흐름 세포를 취득하여 각 튜브에 DAPI 1 μL를 추가한다.

7. 통계 분석

1. 입력 스프레드 시트에있는 모든 데이터.
2. 학생의 t-시험 및 / 또는 편도 적절한 ANOVA를 사용하여 결과를 비교한다.

Results

자기 분리에 의해 단핵구의 수율은 준수 방법에 의해 단핵구 수익률에 높은를 비교한다

PBMC를하고 단핵 세포의 분리 분리의 날에 트리 판 블루 배제 법에 의해 그림 1 표시 PBMC와 단핵구 세포 수에 제시된 데이터. 자기 분리에 의해 격리 된 단핵 세포는 PBMC를의 최대 25 %를 차지하면서 평균적으로 부착 방법에 의해 고립 된 단핵구는 총 PBMC를 약 6.2 %를 차지했다. 통계 분석은 자기 분리에 의해 산출 단핵 세포의 비율이 상당히 높은 (≥ 4 배)이었다 것으로 나타났습니다. 데이터는 적어도 3 개의 독립적 인 실험의 평균 ± SD로 나타낸다. 두 가지 방법 (0.0005 ≤ p)를 비교했을 때 단핵구 수율의 유의 한 차이를 보였다 -test 학생의 t을 사용하여 통계 분...

Discussion

단리 인간 혈액으로부터 MDDCs를 생성하는 알려진 문제에 기초하여, 본 연구는 MDDCs의 생성이 잘 확립 된 방법의 포괄적 인 비교를 제공하는 것을 목표로. 비교 첫 번째 방법은 유리 또는 플라스틱 (접착 방법) ^21,22,27에 부착 단구의 능력을 이용하여 MDDCs을 생성하는 잘 정립 된 전통적인 방법이다. 접착력 방법은 빠르고 효과적인 비용 및 복잡한 장비의 사용을 요구하지 않는다. 그러나,이 방법의 단점은 림프구 오염, 낮은 유연성, 단핵구 과도 조작 ^{22,30,31를 포함한다.} 비교 2 대안 방법에 의해 음성 선별 된 PBMC로부터 단핵구를 분리하기 위해 디자인 된 인간 단핵구 농축 키트 ^(26)를 사용하여 전체 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 단핵구를 자기 분리한다. 이 분리 방법의 장점은, 원하지 않는 셀이며표지와 표적 세포를 자유롭게 열 직접 항체로 세포를 표적으로하지 않고도 새로운 튜브 속으로 주입하면서 자석을 이용하여 분리된다. 상관없이 단...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-5442-03	반드시 RT
인산염 완충 식염수(PBS)	Life Technologies	10010-023
ACK 용해 완충액	Quality Biological	118-156-101
RPMI 1640 매체	Life Technologies	22400-089
항생제-항진균제(100x)	Life Technologies	15240-062
소 태아 혈청(FBS)	Life Technologies	16000-044
RoboSep 완충액	StemCell	20104
EasySep 인간 단핵구 농축 키트	StemCell	19059
TC20 자동 세포 계수기	Bio-Rad	145-0101
FITC-덱스트란	시그마 Aldrich	FD4-100MG
트리판 블루 스테인(0.4%)	Life Technologies	15250-061
Synergy 2 다중 모드 리더	Biotek	7131000
XTT 나트륨 염 생물 시약(XTT)	Sigma Aldrich	X4626-100MG
디메틸 설폭사이드 생물 시약(DMS)	Sigma Aldrich	D8418-500ML
티아졸릴 블루 테트라졸륨 브로마이드(MTT)	Sigma Aldrich	m5655-500MG
나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)	Bio-Rad	161-0302
페나 진 메토 설페이트 (DMSO)	시그마 Aldrich	P9626-1G
비활성화 (HI) 인간 혈청	Chemicon	S1-100ML
Accuri C6 유세포 분석기	BD Accuri	653119
FlowSight Amnis 유세포 분석기	EMD Millipore	100300