Method Article

높은 처리량 원형질체 분리 및 변환을위한 로봇 플랫폼

DOI:

10.3791/54300

⸱

September 27th, 2016

 ,  , 
1Department of Plant Sciences, University of Tennessee, Knoxville, 2Center for Renewable Carbon, University of Tennessee, Knoxville, 3Department of Mechanical, Aerospace, and Biomedical Engineering, University of Tennessee, Knoxville

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

높은 처리량, 자동화, 담배 원형질체 생산 및 변환 방법이 설명되어 있습니다. 로봇 시스템이 아닌 모델 작물로 번역해야한다 모델 BY-2 시스템에 대규모 병렬 유전자 발현 및 검색 할 수 있습니다.

Abstract

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지난 10 년간의 신호 전달 경로, 전사 조절 네트워크, 유전자 발현, 유전자 편집 및 유전자 침묵의 분석 종을 잘라내 모델 종에서부터 식물 원형질체의 사용 부활되고있다. 또한, 상당한 진전 식물 게놈 이러한 시스템의 사용에 더 많은 이익을 생성 한 원형질체로부터 식물의 재생에 만들어졌다. 이 작품에서, 프로토콜은 로봇 플랫폼을 사용하여 '밝은 노란색'2 (BY-2) 담배 현탁 배양에서 원형질체 분리 및 변환의 자동화를 위해 개발되었다. 변환 절차는 콜리 플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터 (35S)의 제어하에 오렌지색 형광 단백질 (OFP) 리포터 유전자 (pporRFP)을 사용하여 검증 하였다. 원형질체의 OFP 발현 표면 형광 현미경으로 확인 하였다. 분석은 propidiu을 사용하여 원형질체 생산 효율 방법을 포함m 요오드화. 마지막으로, 저가 식용 효소는 엄청난 비용 원형질체의 분리 및 분석을 자동화 높은 처리량에 실험실 등급 효소의 필요성을 우회 원형질체 분리 절차를 사용 하였다. 본 연구에서 개발 된 프로토콜에 기초하여, 변형에 원형질 분리의 전체 과정은 운영자의 입력없이, 4 시간 이내에 수행 될 수있다. 이 연구에서 개발 된 프로토콜은 BY-2 세포 배양과 검증 동안, 절차 및 방법은 작물의 게놈 연구의 가속을 활성화해야합니다 모든 식물 현탁 배양 / 원형질체 시스템에 번역해야합니다.

Introduction

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최근, 초식 동물 6 방지 매스 수율 7 증가하고 세포벽 들음 감소 가뭄 3,4- 내염성 5 부여 제초제 저항성 2 부여 각종 질병 한 극복 유전자 변형 작물의 설계에 배치 상당한 자극이 있었다 8. 이러한 경향은 dsRNA를 10, 11의 miRNA와 siRNA를 12까지 침묵 CRISPR TALENs과 9를 사용하여 게놈 편집 및 유전자를 포함한 형질 전환 식물을 생성하는 새로운 분자 도구의 개발에 힘 입어되었다. 이들 기술은 형질 전환 체의 생성을 단순화되었지만, 또한 트랜스 제닉 식물의 투명 수 식물 재생에 의존하는 기존의 시스템을 이용하여 스크리닝 될 수 생성 병목을 만들었다. 상기의 많은 침묵과 게놈 구조 편집 빠르게 식물에 삽입 될 수 있지만, 이러한 병목 관련타겟 특성 식물을 온실에서 분석 할 때까지 종종 발견되지 않는 목적하는 효과를 생산하지 못한다. 본 논문에서는 특히 표적 유전자 사일런 편집 및 유전자의 다수의 초기 스크리닝에서의 전류 병목 현상을 해결하기 위해, 식물 원형질체의 신속한 자동화 고 처리량 스크리닝하기위한 방법을 개발 하였다.

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Protocol

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서스펜션 세포 배양 1. 구축

  1. BY-2 미디어 PO 4 4.43 g Linsmaier & 스쿡 기저 배지, 수크로오스 30 g, 200 mg의 KH 2를 첨가하여 액을 제조하고, 증류하여 200 내지 900 μg의 2,4- 디클로로 페녹시 아세트산 (2,4-D)의 용액 물과 0.1 M KOH와 5.8의 pH. pH를 조정 한 후, 증류수 및 오토 클레이브 1,000 ml의에 최종 볼륨을 조정합니다. 미디어는 4 ° C에서 2 주까지 저장할 수 있습니다.
  2. 1 %의 추가 BY-2 미디어 250 ㎖의 삼각 고체 BY-2 미디어에 성장 100 BY-2 미디어 액체 ml의 BY-2 캘러스의 한 조각 (> 직경 1cm)와 플라스크 (액체 접종 한천) 및 알루미늄 호일로 밀봉. 5 일간 진탕 28-30 ° C에서 문화를 품어.
    참고 : 액체 문화가 빠르게 자라다 바와 같이 BY-2 캘러스는 장기 저장을위한 고체 배지에 유지된다. 배양 부피는 통상적으로 100 ml의 배양은 세 서른 6 w 로딩 가능한 것, 필요에 따라 조정할 수있다엘 플레이트.
  3. 전송이 BY-2 배양 신선한 BY-2 미디어의 98 ml의에 로그 상 ㎖의 진탕 28 ~ 30 ℃에서 5~7일 동안 품어.
    참고 캘러스 100....

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Results

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현재 연구에서, BY-2 배 속도는 15 hr의 평균 세포주기 길이 이전보고와 일치 배양은 배양되는 온도에 따라 14 ~ 18 시간에서 변화. 이 두배 속도로, 1 : 100부터 접종 5-7 일 동안 50 %의 적혈구 용적 (PCV)를 배양 선도 배양을 개시 하였다. 배양 매체 200㎖에 성장 된 상기 현재 프로토콜에서, 100 ㎖의 PCV 33 6- 웰 플레이트를 채우기에 충분한 세포를 제공 칠일, 생성 하였다. 원형질체 수율의 관점에서, 프로토콜에 규정 된 조건에서 분해 6 웰 플레이트 (도 2a) 당 2.82 × 106 원형질체 결과 웰 당 4.70 × 105 ± 5.77 × 103 원형질체 생성. 이들 데이터에 기초하여, (214)를 96- 웰 플레이트 (웰 당 70 μL의 원형질체)의 전위와 FO 단일 6 웰 플레이트 소화로부터로드 될 수있는R 개의 6- 웰 플레이트는 두.......

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Discussion

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위에서 설명한 프로토콜은 성공적으로 원형질체 분리, 열거, 및 변환에 의해-2 담배 현탁 세포 배양을 사용하기위한 검증되었습니다; 그러나, 프로토콜은 쉽게 식물 현탁 배양으로 확장 될 수있다. 현재, 원형질체 분리 및 변형 옥수수 (ZEA 메이스) (10), 당근 (Daucus의 carota) (32), 포플러 (사시 나무속 euphratica) (33), 포도 (유럽 종 포도) (34), 기름 야자 (Elaeis의 guineensis) (35) 등 다양한 식물에서 달성되었다 양상추 (왕 고들빼기 속 sativa로구나) (36), 겨자 (브라 시카 사건) (37), 쌀 (벼) (38), 및 스위치 그래스 (Panicum의 virgatum).......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 더 경쟁 재정적 관심이 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 ARPA-E(Advanced Research Projects Agency - Energy) Award No.의 지원을 받았습니다. AR0000313.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Orbitor RS Microplate moverThermo Scientific
Bravo Liquid HandlerAgilent
Synergy H1 다중 모드 리더BioTek
MultiFlo FX 다중 모드 디스펜서BioTek
TeleshakeInheco3800048
CPAC Ultraflat 히터/쿨러Inheco
Vworks 자동화 소프트웨어Agilent Bravo Momentum Software의 제어 및 프로토콜 작성에 사용되는Agilent
소프트웨어Thermo ScientificTask Orbiter RS
Liquid Handling Control 2.17 소프트웨어Microscope의 프로토콜을 제어하고 작성하는 데 사용되는Biotek
Olympus
Zyla 3-Tap 현미경 카메라Andor
ET-CY3/TRITC 필터 세트Chroma Technology Corp49004
Rohament CLAB 효소샘플 병저비용 셀룰라아제
Rohapect UFAB 효소샘플 병저비용 펙티나제
Rohapect 10LAB 효소샘플 병저비용 펙티나아제/아라비나제
Linsmaier & Skoog 기초 매체Phytotechnology LaboratoriesL689
2,4-dichlorophenoxyacetic acidPhytotechnology LaboratoriesD295
프로피듐 요오드화물Sigma AldrichP4170
폴리(에틸렌 글리콜) 4000Sigma Aldrich95904-250G-F이전 Fluka PEG
Propidium IoddideFisher Scientific25535-16-4아크로스 오가닉스
CaCl2Sigma AldrichC7902-1KG
아세트산나트륨Fisher ScientificBP333-500
만니톨AldrichM1902-1KG
설탕Fisher ScientificS5-3
KH2PO4Fisher ScientificAC424205000
KOHSigma AldrichP1767
Gelzan CMSigma AldrichG1910-250G
6웰 플레이트Thermo Scientific103184
96웰 1.2ml 딥 웰 플레이트Thermo ScientificAB-0564
96웰 광학 바닥 플레이트Thermo Scientific165305
Finntip 1000 와이드 보어 피펫 팁Thermo Scientific9405 163
NaClFisher ScientificBP358-10
KCl시그마 AldrichP4504-1KG
MESFisher ScientificAC17259-5000
MgCl2Fisher ScientificM33-500
7000190 제어를 위한 스케줄링 소프트웨어 MultiFlo FX IX81 Inverted 소프트웨어

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Atkinson, H. J., Lilley, C. J., Urwin, P. E. Strategies for transgenic nematode control in developed and developing world crops. Curr. Opin. Biotech. 23 (2), 251-256 (2012).
  2. Duke, S. O. Perspectives on transgenic, ....

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