Method Article

양자점 나노 입자를 사용하여 상호 빛 - 및 전자 현미경

DOI:

10.3791/54307

⸱

August 7th, 2016

 , 
1South Western Sydney Clinical School, Faculty of Medicine, University of New South Wales Australia, 2School of Medicine, Western Sydney University, 3Correlative Microscopy Group, Ingham Institute for Applied Medical Research, 4Electron Microscopy Laboratory, Department of Anatomical Pathology, Sydney South West Pathology Service, New South Wales Health Pathology, 5School of Medical Sciences, Faculty of Medicine, University of New South Wales Australia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

양자점(QD) 나노입자를 에폭시 포매 인간 병리학 조직의 상관 면역세포화학적 연구에 사용할 수 있는 방법을 설명합니다. 당사는 광시야 형광 현미경 및 투과 전자 현미경으로 시각화되는 상용 항체 단편 접합 QD를 사용합니다.

Abstract

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양자점 (QD) 나노 입자가 위드 형광 광 현미경 및 투과 전자 현미경 (TEM)을 이용하여 인간의 병리 조직의 면역 세포 화학적 상호 연구에 사용될 수있다하는 방법을 설명한다. 스트렙 타비 딘 결합 585 nm의 카드뮴 - 셀레늄 (의 CdSe) 양자점 (양자점)과 바이오틴 차 항체 및 시각화 다음에 우리가 소마토스타틴 (somatostatin)에 대한 일차 항체를 사용하여 인간의 소마토스타틴 종양의 초박 에폭시 섹션을 immunolabeled 한 프로토콜을 설명합니다. 그런 다음 섹션 위드 형광 빛 현미경으로 관찰 유리 슬라이드 상에 배치 된 시료 TEM 그리드 상에 장착된다. 광학 현미경은 종양 세포 내의 세포질 과립 패턴을 형성 밝은 오렌지 형광으로서 585 나노 QD 라벨링을 보여준다. 광학 현미경에 의한 중간 범위에서 낮은 배율 표지 패턴을 쉽게 인식 할 수 있으며, 비특이적 또는 배경 라벨링의 수준을 평가. 이것은 중요하다형태 학적 맥락의 후속 TEM에 의해 immunolabeling 패턴의 해석과 평가 단계. 같은 부분은 건조 도말 및 TEM으로 볼 수 있습니다. QD 프로브는 개별 분비 과립에 포함되는 비정질 재료에 부착하는 것으로한다. 이미지는 상관 분석을위한 광학 현미경으로 볼 수이자 (ROI)의 같은 지역에서 취득. 각 양상에서 이미지를 대응하는 다음 해당 지역의 TEM의 미세 구조에 형광 데이터를 오버레이 배합 할 수있다.

Introduction

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라이트 - 상관 및 전자 현미경 (클레멘 타인)의 과도 동적 이벤트 한 희귀 이벤트 2, 3, 4 복잡한 시스템의 분석을위한 강력한 방법이다. 질문에 따라 5 사용할 수 많은 다른 기술 순열 요청을 받고 있습니다 그러나 일반적인 요구 사항은 단일 샘플 6 동일한 구조가 여러 현미경 양식에 의해 촬영되어 있다는 것입니다. 클레멘 타인에 대한 우리의 특정 접근 방식은 보관 인간의 병리 조직의 연구 잘 특징과 7 이전에 게시 된 여기에 사용되는 경우에 개발되었다. 목적은 초 미세 구조 레벨에서 나타나는 면역 세포 표지 패턴의 내용을 명확하게하는 데 도움 형광 광학 현미경을 사용하여, 두 번째 단일 또는 외과 생검 샘플로부터 분석 된 데이터를 최대화하기 위해, 우선이었다.

양자점 나노 입자 (양자점)이 범용 마커 시스템 ABL의 가능성을 제공한다E는 모두 볼 수 있도록, 형광 광학 현미경 및 전자 현미경 (8, 9), (10). 이들 결정질 코어 구조들은 발광 스펙트럼 (11)까지의 파장의 광에 의해 여기 될 때 다른 크기의 양자점 형광 발광 피크의 넓은 범위를 생성 할 수있다. 이들 원자량....

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Protocol

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1. 조직 해부 및 고정

  1. 조직의 해부
    1. 외과 적 절제 종양 생검 검체 또는 조직에서 조직 조각을 해부.
      참고 :이 연구에 사용 된 조직이 일상적으로 포르말린에 고정하지만 신선한 조직에도 적합하다. 우리 일상 조직 학적 염색 및 항 - 소마토스타틴 면역은 (미도시) 이후 소마토스타틴 종양을 포함하는 해부학 적 병리학 자에 의해 확인되고보고 영역을 선택 하였다.
    2. 약 1.0 mm 3 이하 더 큰 조직 조각을 사용합니다.
  2. Cacodylate 버퍼 준비
    1. 나트륨 cacodylate 21.4 g을 첨가하여 스톡 완충 용액 (1 M)을 준비한다 (자재 목록 참조) 및 90 ml의 증류수 후 100 ㎖의 최종 부피로 용액을 토핑 3.0 ml의 % 1 염화칼슘 용액. 솔루션을 저어 결정 시약이 완전히 용해되도록 밤새 정치를 둡니다.
      2. 표시등 스트립 pH를 확인 후, 물 170 ml의 원액 20 ㎖를 첨가하여 솔루션을 작업 버퍼를 준비합니다. 3 % HCl 4 방울 - (3)을 첨가하여 7.4로 pH를 조정한다. 0.1 M. 최종 몰 농도로 200 ml의 최종 부피로 용액을 최고
    <....

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Results

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본 연구에 사용 된 소마토스타틴 종양 표본 stomal 콜라겐 조직과 혼합 도관 구조를 형성하는 종양 세포를 포함. 형광 빛 현미경으로 풍부한 분비 과립을 함유 개별 종양 세포는 호르몬 소마토스타틴 양성 표지를 나타내었다. 핵은 최소한의 비 특정 라벨 검출 (그림 1)과 어두운 구멍을 보였다. 낮은 배율 가변적 강렬한 과립 오렌지 형광이 아니라 특징으로하는 종양 세포의 세포질에서 나타났다. 형광 오렌지 색상이 사용 QD의 크기에 의해 결정 하였다. 이 연구에서 우리는 365 nm의 빛으로 흥분 할 때 오렌지 신호를 방출하는 585 나노 양자점을 사용했다.

동일한 셀의 클레멘 타인 분석 (그림 2) 수 있었다. TEM 시험 허용 ROI를위한 광학 현미경으로 볼 때 같은 격자를 사용하여 인식 메신저합니다.......

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Discussion

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이 연구는 클레멘 타인의 연구를위한 범용 프로브로 양자점의 잠재적 인 유틸리티를 보여 주었다. 위드 광학 현미경으로 볼 수 있고 쉽게 TEM으로 관찰 할 때 사용하는 585 나노 양자점 나노 입자는 밝고 안정된 형광을 보였다. 본 저자 중 한 명으로 이전의 연구는 또한 초 고해상도 광학 현미경 (7)에 적합하도록 양자점을 보여 주었다. 이들의 광 안정성 확장 시청 기간과 긴 영상 노출에 특히 유용했다. 양자점은 크기가 다른 프로브는 동시에 동일한 여기 파장에 따라 다른 컬러 발광 스펙트럼을 가진 다중 면역을 위해 사용될 수있다.

양자점 충분한 원자량이 TEM에 의해 가시화 할 수 있지만, 이는 사용되는 나노 입자의 크기에 따라 도전였다 갖는다. 광학 현미경을 위해, 우리는 525 nm의 양자점 (녹색)보다 큰 585 nm의 (오렌지) 및 655 nm의 (적색) 형태에 비해 적은 배경 라벨을 생산하는 것을 발견했다. 그러나, 우리는 TEM에 의한 라벨의보다 .......

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Disclosures

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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

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저자는 Xiao Juan Wu(면역조직화학 실험실)와 호주 뉴사우스웨일스주 리버풀에 위치한 NSW Health Pathology의 Sydney South West Pathology Service(SSWPS) 해부병리학과의 지원에 감사를 표합니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
나트륨 카코딜레이트 ProscitechC0205유해 화학 오스
뮴 테트록사이드ProscitechC010흄 후드에서만 사용
우라닐 아세테이트Univar-Ajax569유해 화학 물질
에탄올 100 %프로닌JJ008
아세톤 100 %프로 닌JJ006
ERL 4221ProscitechC056
DER 732ProscitechC047
NSAProscitechC059
DMAEProscitechC050
Sodium metaperiodateAnalar BDH10259
anti-somatostatin 항체DakoA0566
항체 희석제DakoS3022
Qdot 585 스트렙타비딘 접합체 InvitrogenQ10113MP
Biotinylated 염소 항-토끼 IgG 항체 SigmaB7389-1ML
글루타르알데히드 50%EMS16320
일반 염소 혈청InvitrogenPCN5000
PBS "Dulbecco A"Oxoid 
BSAc (10%)Aurion900.022
ParafilmPechiney PPM
pH 지시약 스트립 (pH 2.0 - 9.0)Merck1.09584.0001
MicromouldsProscitechRL063
다이아몬드 나이프DiatomeUltra 45
투과 전자 현미경FEIMorgagni 268D
형광 현미경Carl ZeissAxioscope A1
그리드 300 메쉬 니켈(얇은 막대)Agar ScientificG2740N
초박절판RMCPowertome
TEM 카메라 제어 소프트웨어소프트 이미징 시스템AnalySIS버전 3.0
이미지 처리 소프트웨어Adobe Systems 통합된 포토샵 CS2
BR0014G

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
  2. Introduction to correlative light and electron micr....

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