암세포를 콜라겐 겔에 삽입한 다음 무세포 피브린 겔에 끼워 넣어 위성 종양의 침습성과 형성을 모니터링할 수 있는 3D 배양 시스템을 생성합니다.
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이 논문에서
요약
초록
단일 층에서 포유 동물 세포 배양 널리 다양한 생리 학적 및 분자 과정을 연구하는 데 사용됩니다. 그러나 성장 세포를 연구하는이 방법은 종종 원치 않는 아티팩트를 생성합니다. 따라서, 주로 세포 외 기질 성분을 사용하여 3 차원 (3D) 환경에서 세포 배양이 때문에 생체 조직 또는 기관에서 고유로 그 유사성 흥미로운 대안으로 나타났다. 우리는 피브린 겔 이루어지는 의사 차 macrospherical 종양 및 (ⅱ) 주연 무 세포 격실 콜라겐 겔 연기에 포함 된 암 세포를 함유하는 중앙 구획 개의 구획, 즉 (i)를 이용하여 3 차원 세포 배양 시스템을 개발 즉, 센터에서 사용되는 다른 세포 외 매트릭스 성분이있는 암세포 마이그레이션 (내습 전면) 및 / 또는 보조 위성을 나타내는 종양 microspherical 종양을 형성 할 수있다. 주변 구획 위성 종양의 형성은이 현저 차원 배양 시스템의 차별화 네이티브 종양 세포의 공지 공격성 또는 전이성 기원 상관. 이 세포 배양 방법은 암 세포의 침윤과 운동성, 세포 외 기질의 상호 작용 및 항암 약물의 특성을 평가하는 방법으로 평가하는 것으로 간주 될 수있다.
서론
암 세포 침공 / 마이그레이션 및 후속 전이 설립의 기본 및 생물 의학 특성을 조사하는 강렬한 연구 1, 2의 주제이다. 전이 암의 최종 단계이며, 임상 관리하기 어려운 남아있다. 세포 및 분자 수준에서의 전이에 대한 이해는보다 효율적인 치료 (3)의 개발을 가능하게한다.
전이성 세포의 여러 특성은 자신의 stemness 및 마이그레이션 내에서 기본 종양 5 침공 전이 상태 (예를 들면, 상피 - 중간 엽 전이를) 획득 가능성을 포함하여 시험 관내 4 탐험 할 수 있습니다. 그것은 거의 혈액 / 림프 순환의 기여를 배제하기 때문에, 내습 / 전이 과정의 시험 관내 평가는 도전하고있다. 콜라겐 젤에 종양 조각을 삽입의 Organotypic 문화는 기존에 가지고교활한 암의 공격성을 모니터링하는 데 사용되었다. 종양의 복잡도가 보존되어 있지만 (예를 들면, 비 - 암성 세포의 존재), 종양 절편 샘플링 변동 제한된 확산 매체에 노출 및 기질 세포 (6)의 과도한 성장한다. 대안적인 방법은 3 차원 셀 환경을 모방 세포 외 기질 (ECM)의 구성 요소 내에서의 암세포 성장에있다. 콜라겐 겔 및 / 또는 기저막 유래 매트릭스 유방암 세포주의 증식 차원 세포 배양의 가장 특징으로하는 실시 예 사이이다. 특정 3 차원 세포 배양 환경을 사용하여 표준 조건 하에서 성장 유방암 세포에 대해 관찰 된 무질서 조립체 유방 꽈리 및 관상 구조 7-10의 자연 형성에 역전 될 수있다. 또한, 선암종 암세포 유래의 다세포 종양 타원체의 형성은 (서로 다른 기술을 이용하여 군집예를 들면, 현재 가장 일반적으로 사용되는 3 차원 세포 배양 분석법 11-13을 구성하는) 매립 한천, 타원체, 플로팅 방울 매달려. 그러나 이러한 분석은 구 상체를 형성 할 수있는 암 세포주의 제한된 세트에 의해 이러한 조건에서 세포를 연구 할 수 짧은 기간에 의해 제한된다.
이러한 시각화 방법에서, 우리는 본 명세서에서 관심있는 암세포 대안 기저막 유래 매트릭스로 피복 될 수있는 의사 원발 종양의 체외 형성을 허용하기 위해 콜라겐 겔에 포함 된 정교한 3D 세포 배양 분석을 소개한다. 형성되면, 가상 기본 종양 후 암세포 두 매트릭스 구획과의 계면을 통과 할 수있는 무 세포 기질 (본 경우 피브린 겔)에 끼워진다 (도 1 참조). 흥미롭게 공격적인 암세포와 함께 의사 원발 종양 유래 이차 종양 같은 구조가 나타나지섬유소 젤. 이러한 3 차원 배양 시스템은 예를 들어, 항암제, 유전자 발현 및 세포 - 세포 및 / 또는 세포 ECM 상호 14-16 조사하는 필요한 유연성을 제공한다.
그림 1 :.. 방법의 개요 암 연구를위한 모델로 3D 세포 배양 시스템을 생성하는 방법의 도식 요약 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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프로토콜
참고 : 동물과 인간의 암 세포가 구입하거나 친절하게 우리에게 제공 되었기 때문에 없음 윤리 고려.
1. 만들기 콜라겐 플러그 (의사 차 종양)
- 콜라겐 분산을 준비합니다. 이전에 17 일 또는 구입을보고 나도 추출하여 멸균 할 수 있습니다 쥐의 꼬리 힘줄 (RTT)에서 콜라겐 입력합니다. (; 다섯 2 분 실행 고속 설정) 균일 한 혼합을위한 동결 건조 된 RTT 콜라겐 (0.02 N 아세트산에 3.25-3.50 ㎎ / ㎖) 블렌더를 사용하여 분산.
- 수확 (트립신 EDTA, 보통) 및 혈구를 사용하여 가능한 세포를 카운트 트리 판 블루 배제을 사용합니다. 원하는 세포 밀도 (플러그 당 5 × 10 4 세포)로 조정합니다.
- 무균 조건 하에서 모든 솔루션 (수산화 나트륨, 소 태아 혈청, DMEM 5 배,의 NaHCO3) 별도로 (표 1)을 준비하고 얼음에 냉장 보관하십시오. 주 : 각종 용액의 첨가 순서는 셀 또는 산성 삼투압 충격을 방지하는 것이 중요하다.
- 가능한 한 빨리 최종 콜라겐 용액 (5 mL)에 셀 분산액 (1.25 × 10 6 세포)를 수행한다. 기포를 방지하고 신속 96- 웰 플레이트의 각 웰에 즉시 사용 용액 200 μL를 배포하면서 (최대 피펫 아래쪽으로) 잘 섞는다. 부드럽게 기포를 제거하는 세포 배양 후드의 작업 영역 표면의 멀티 웰 플레이트를 찍는 웰 내부에서 균일 용액을 전파.
- 모든 우물을 작성 후 인큐베이터에 보관 (이 단계는 96 웰 플레이트 당 약 15 ~ 20 분 소요).
- 하룻밤에 2 시간에서 37 ° C에서 접시를 품어. 콜라겐 겔화 (즉, fibrillogenesis)는 30 분 이내에 발생합니다. 하룻밤 배양을 수행하기 위해 문화 문화 매체 (100 μL / 웰)를 추가합니다.
섬유소 젤 2. 첫 번째 레이어
- 피브리노겐 용액 준비.
주 : 피브린 겔 같은 일괄 적 재현성 있습니다 END_STRONG_1 사용해야TS와 같은 피브린 겔 형성은 상업 동결 건조 피브리노겐의 다른 배치에 따라 다를 수 있습니다.- 항상 새로 제조 피브리노겐 용액을 사용한다. 수화물 결정 형성을 방지하기 위해 유리 병을 열기 전에 실온으로 동결 건조 된 피브리노겐을 가지고.
- 점진적으로 사전 예열 (37 ° C) 칼슘과 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS가) / 3 ㎎ / ㎖의 작업 농도의 Mg 2+ (최소 최종 부피의 15 % 초과를 준비 고려할 필요에서 피브리노겐을 용해 : 예를 들면, 5 ml의 솔루션에 대한 5.75 용액에 17.25 mg)을 얻었다.
- 피브리노겐 조각을 용해하기 위해 처음에 미리 예열 HBSS의 적하를 추가합니다. 비커에 주걱으로 더 큰 조각을 분해. 시간과 혼합 용이하게하기 위해 시간을 비커를 교반. 절차를 수행하는 동안 교반기 플레이트를 사용하지 마십시오. 위아래 정지를 피펫 팅하여 나머지 분말을 녹여.
- steri 동안 미지근한 피브리노겐 용액 유지0.22 ㎛의 필터에 통과시켜, 용액을 LIZING. 주 : HBSS 충분히 따뜻하지 않거나 피브리노겐이 완전히 용해되지 않은 경우, 솔루션은 필터를 막히게 할 수있다. 해당되는 경우, 피브리노겐 농도를 감소, 따라서 섬유소 응고 강성 수있는, 한 번 또는 두 번 필터를 교체합니다.
- 다른 방법으로서, 최종 부피를 조절하면서 즉시 사용 피브리노겐 용액에 관심있는 세포 (예, 내피 세포)에 일시.
- 트롬빈 솔루션을 준비.
- DDH 2 O (50 NIH 단위 / ㎖)의 스톡 용액을 제조 한 후 0.22 ㎛의 필터를 사용하여 멸균.
- 피브리노겐 / 트롬빈 비율 ≥1 사용 0.0075 (V / V)이 피브린 겔을 생성하기 위해서이다.
- 섬유소 젤을 생성.
- 멸균 피브리노겐을 유지하고 모든 다음 단계 동안 얼음에 재고 솔루션을 트롬빈. 섬유소 젤은 24 웰 플레이트에 형성 할 수 있습니다.
- 즉시 오버레이 일각각의 E면 웰과 기포의 형성을 피하면서 피브리노겐 용액 (200 μL / 웰). 한 번에 6 우물을 처리합니다.
- 피브리노겐 용액이 완전히 웰의 표면을 커버하면, 45 ° 각도로 플레이트를 기울 웰의 중심에 트롬빈 놓아 제 1 웰에 트롬빈 용액 1.5 μL를 추가 한 다음 부드럽게 대해 가로 판 소용돌이 1-2 초.
- 층류 후드 (5-10 분) 겔화 / 응고 과정이 완료 될 때까지 아래 안정 위치에서 상기 플레이트를 남겨 (NB : 중합 공정은 인큐베이터에 플레이트를 반송하여, 예를 들어 방해 안된다).
- 처음 여섯 우물이 중합 한 후 모든 우물이 처리 될 때까지, 다음 6 우물에 동일한 순서 (즉, 3 이전 단계)를 반복합니다.
섬유소 젤과 샌드위치 콜라겐 플러그의 3 번째 레이어
- 선택권A : (즉시 콜라겐 플러그를 사용).
- 섬유소 젤의 제 1 층 섬세 접시를 기울여 모든 우물에서 중합 것을 확인합니다. 콜라겐 플러그의 전송을 쉽게하기 위해 (섬유소 젤을 포함) 24 웰 플레이트 옆에 콜라겐 겔 플러그 측을 포함하는 96 웰 플레이트를 놓습니다.
- 콜라겐 플러그를 함유하는 플레이트의 각 웰에 HBSS 한 방울을 추가한다.
- 얇은 (핸들로 사용) 주사기에 장착 된 바늘 또는 (동영상 참조) 마이크로 스푼을 이용하여 우물에서 각 콜라겐 플러그를 제거합니다. 콜라겐 플러그 웰 웰에 중심을 그 불임성이 잘 유지되고 있는지 확인하면서, 하나 또는 두 개의 마이크로 숟가락을 사용하여 상기 제 피브린 겔 층에 각각 콜라겐 플러그를 옮긴다.
- 피브리노겐 용액의 두번째 층이 미리 형성된 피브린 겔 오버레이 (300 μL / 웰) 및 2.3에 기재된 바와 같이 최소한 1 유지 트롬빈 소개 :. 한번에 0.0075 비율 여섯 웰 시퀀스
- (성장 인자 - 감소 지하 막 (GFRBM)의 얇은 층으로 콜라겐 플러그 코팅) 옵션 B.
- 쿨 모든 준비 솔루션 및 악기 사전 및 GFRBM의 냉동 분취 이후 처리 과정 (예를 들면, 피펫, 조언, 테스트 튜브) 4 ° C 또는 얼음에 그들을 유지는 (제조업체의 지침에 따라) 해동시 과도한 가열 속도에 매우 민감하다 .
- 플레이트 웰로부터 제거 후, 순수 GRFBM 용액 100 ㎕를 함유하는 얼음에 1.5 mL의 원심 분리 튜브에서 2 분 동안 각각 콜라겐 플러그 소크.
- 전술 한 바와 같이 그것을 보장하는 것은 물론 중심 동안 첫 번째 섬유소 층에 각각 코팅 플러그를 전송합니다. 5 분의 GRFBM이 겔을 형성 할 수 있도록 37 ℃에서 플러그 - 함유 플레이트를 인큐베이션. 단계 3.1.4에서와 같이 두 번째 섬유소 층을 추가합니다.
4. 세포 배양 중간 조건
- (배지와 잘 4 각 채우기00 μL). 배양액 및 보조제는 세포주 및 실험 조건에 따라 선택 될 것이다.
- 100 칼리 크레인 저해 단위 (KIU) / ㎖의 최종 농도로 배양 배지에 아프로 티닌, antifibrinolytic 제를 추가한다.
주 : 시험 된 세포주에 이용되는 조건 하에서 세포 배양 인큐베이터에서 플레이트를 저장. - 매일 신선한 매체와 문화를 보충하거나 실험 일정에 따라, 그리고 아프로 티닌을 추가합니다. 새로운 배지를 추가하기 전에 약간의 (a 30 ~ 35 ° 각도로) 판을 기울 조심스럽게 일정한 관찰에서 조정 배지를 흡입하는 동안 잘의 측면에 대해 피펫을 경사.
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결과
앞서 언급 한 바와 같이,이 3 차원 세포 배양 검정의 흥미로운 특징은 암세포에만 인접 피브린 겔 콜라겐 플러그 마이그레이션뿐만 아니라, 이차 종양 (예, 위성 종양 형 구조)를 확립 할 수 있다는 것이다. 이는 직접 특히 긴 작동 거리 응축기 (도 2)과, 겔의 두께를 통해 저 및 고 배율에서의 역 위상차 현미경으로 관찰 할 수있다. 다른 실험 셋업 (15)에 반복적으로 입증 된 바와 같이,이 3 차원 세포 배양 방법을 사용하여, 알려진 전이성 세포의 문제가 용이하게 비 - 전이성 세포에서 발견되는 것과 비교 될 수있다. 극소수 작은 위성 종양 너무 비전 이성 대응, B16F0 세포주 (도 2에 의해 검출 될 수 있지만 예를 들면, 다수의 위성 종양 임의로 전이성 세포주 B16F10과 피브린 겔에 분산 발견되고).
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토론
중요한 기술적 각주, 갭 중앙과 주변 겔 사이의 계면에 존재하지 않는 것이 중요하다. 그렇지 않으면 / 마이그레이션 피브린 겔 침투하는 전지의 용량을 줄일 수있다. 트롬빈 적절히 희석되지 않은 경우 콜라겐과 피브린 겔 사이의 공간은 배양의 처음 24 시간 동안 형성 할 수도있다. 콜라겐 겔을 초래할 수 시험 세포주 모두시켜 겔 사이에 형성하기 위해 상대적으로 큰 공간을 일으키는 동안 배양 수축하는 것도 가능하다. 간질 세포 인해 근섬유 유사한 활동 18 암세포와 함께 콜라겐 겔에 혼합되는 경우가 특히 기대된다. 이러한 이슈를 회피하기 위하여, 콜라겐 플러그가 오랜 기간 동안 37 ℃에서 항온 처리한다 (≥48 시간 ) 섬유소 샌드위치를 조립하기 전에 젤의 수축을 유도합니다.
또한 세이 조우 문제점이 존재하다섬유소 원 섬유 또는 덩어리의 식별. 이는 암세포 이동성 경로의 섭동 데이터의 해석을 복잡 피브린 겔에 흐린 대신 투명...
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공개 사항
저자는 공개하지 않았습니다.
감사의 글
Prostate Cancer Canada(SG 및 CJD에 보조금 # D2014-4)와 캐나다 보건 연구소(SG에 보조금 # MOP-111069)에서 부분적으로 자금을 지원받는 작업입니다. 편집 지원을 해주신 Richard Poulin 박사님과 기술적 도움을 주신 Chanel Dupont 여사님께 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 건조 콜라겐 | Sigma-Aldrich | C7661 | (Rajan et al. 참조, ref.#14) |
| 피브리노겐(동결 건조) | Sigma-Aldrich | F8630 | 유형 I-S, 65 - 85% 단백질, ≥ 단백질의 75%는 응고 가능 |
| Thrombin | EMD Chemicals Inc. | 605157 | 깁스타운, 뉴저지; NIH 단위/mg 건조 중량 |
| 성장 인자 감소 Matrigel | 코닝 | 356234 | 이전에 BD Biosciences |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A6279에서 발췌 | 5 - 10T IU/ml의 용액 (트립신 억제제 단위) |
| 마이크로스푼 | Fisher Scientific | 2140115 | Fisherbrand Handi-Hold Microspatula |
| 96 웰 플레이트, 원형 베이스 | Sarstedt | 3925500 | |
| 24웰 플레이트 | Sarstedt | 3922 | |
| Dulbecco의 변형된 Eagle's Medium | Sigma Chemical, Co. | D5546 | DMEM |
| 태아 소 혈청 | VWR | CAA15-701 | FBS, 캐나다 원산지. |
| 트립신-EDTA | 시그마 화학, Co. | T4049 | |
| 행크 s 균형 잡힌 소금 솔루션 | 시그마 케미컬, Co. | H8264 | HBSS |
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