방법 논문

배양 된 세포를 세포 열 효과를 조사하기 위해 가열하는 연속파 툴륨 레이저

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DOI:

10.3791/54326

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2017년 6월 30일

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1Institute of Biomedical Optics, University of Luebeck, 2Medical Laser Center Luebeck GmbH, University of Leubeck, 3Department of Ophthalmology, University of Luebeck

이 논문에서

요약

1.94 μm 연속파 레이저 방사를 사용하여 배양 접시에서 세포를 가열하는 독창적 인 실험 장치를 소개합니다. 이 방법을 사용하여 다양한 열 노출 후 망막 색소 상피 세포 (RPE)의 생물학적 반응을 조사 할 수 있습니다.

초록

생물학적 평가를 위해 1.94 μm 연속파 툴륨 레이저를 사용하여 배양 된 세포를 가열하는 독창적 인 방법을 소개합니다. 툴륨 레이저 방사는 물에 강하게 흡수되며 배양기 바닥의 세포는 열 확산을 통해 가열됩니다. 365 μm의 직경을 가진 레이저 섬유는 배양 접시의 약 12 ​​cm 위에 놓여 있으며, 레이저 빔 직경은 배양 접시 (30 mm)의 내경과 거의 동일합니다. 각 실험에서 일관된 양의 배양 배지를 유지함으로써 재현성 높은 온도 증가로 세포를 조사 할 수 있습니다.

각각의 파워 세팅을 위해 하나의 세포 배양 접시에서 온도 증가 및 그 분포를 보정하기 위해, 온도는 상이한 위치 및 세포 수준에서 10 초 동안 조사되었다. 온도 분포는 수학 그래픽 소프트웨어프로그램, 문화 격판 덮개의 맞은 편에 그것의 본은 가우스 모양에서이었다. 레이저 조사 후, 온도 의존성 세포 반응을 평가하기 위해 상이한 생물학적 실험을 수행 할 수있다. 이 원고에서 생존 염색 (생존, 세포 자멸 및 사멸 세포 구별)은 시간 경과에 따른 세포 사멸 및 사망의 역치 온도를 결정하는 데 도움이됩니다.

이 방법의 장점은 전체 세포 배양 접시에서 가열 세포의 고효율뿐만 아니라 온도 및 가열 시간의 정확성입니다. 또한, 컴퓨터 운영 체제로 잘 제어 할 수있는 다양한 온도 및 시간 간격으로 학습 할 수 있습니다.

서론

온도 의존성 세포 생물학적 반응을 이해하는 것은 성공적인 고온 치료에 매우 중요합니다. 안과에서 사용되는 열 레이저로 망막 레이저 광응고술은 의학에서 가장 잘 알려진 레이저 치료법 중 하나입니다. 주로 녹색에서 노란색 파장의 가시 광선이 망막 레이저 치료에 사용됩니다. 빛은 망막 색소 상피 (RPE) 세포에서 멜라닌에 의해 많이 흡수되며 망막의 최 외각 세포 단층을 형성합니다. 여러 종류의 망막 장애에 대한 새로운 치료 전략으로 매우 가벼운 열 방사선 (sub-visible photocoagulation)에서 의사와 연구자들 사이에 최근의 관심이있었습니다 1,2 . 이러한 추세에 따라, 우리의 관심은 온도 조절 광열 요법 (TC-PTT)이라는 정확한 온도 조절하에 RPE 세포를 치사 적으로 가열하는 것에 있습니다.

최근 옵토우리 연구소의 음향 기술은 망막의 조사 된 부위에서 온도 증가를 실시간으로 측정 할 수있게 해주었습니다. 이로써 조사 중 온도 상승을 제어 할 수 있습니다 3 . 그러나 온도를 측정하고 조절할 수 없기 때문에 RPE 세포를 준 사염 적으로 가열함으로써 망막의 치명적이지 않은 고열이 이전에 고려되지 않았기 때문에 열 레이저 조사 후 RP....

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프로토콜

1. RPE 세포 배양

  1. 돼지 눈에서 RPE 세포 분리
    1. 지역의 도축장에서 새롭게 적출 된 돼지 눈을 구하십시오. 차가운 곳 (4 ° C)과 어두운 곳에서 보관하십시오.
    2. 가위로 세포 외 조직을 제거하고 눈을 소독액에 5 분간 담근다.
    3. 사용하기 전 칼슘과 마그네슘이없는 멸균 된 인산 완충 식염수 (PBS (-))에 눈을 넣으십시오.
    4. 메스를 사용하여 각막 윤부 후방 약 5 mm에서 공막을 관통시킵니다. 각막 윤부와 평행하게 모든 방법을 통해 가위로 절단하여 눈 앞부분 전체를 절제하십시오.
    5. 눈 앞부분 ( 즉, 각막과 렌즈)과 유리체를 제거하십시오. PBS (-) 1 ML을 추가하고 부드럽게 신경 망막을 제거합니다.
      참고 :이 "안구 컵"은 공막, 맥락막 및 RPE로 구성되어 이제 준비되었습니다.
    6. P에서 예열 된 (37 ° C) 0.25 % 트립신 추가BS (-)를 아이 컵에 넣으십시오. 아이 컵의 약 80 %가이 트립신 용액으로 채워지도록 볼륨을 조절하십시오.
    7. 37 ° C에서 10 분 동안 5 % CO 2 배양기에서 트립신 용액으로 아이 컵을 배양하십시오.
    8. 인큐베이터....

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결과

다양한 전원 설정 후 온도 분포

각 단일 조사에 대한 모든 온도 변화는 온도 보정에서 모니터링되었습니다. 이 데이터로부터 측정 된 점에서 최대 온도가 구해지고 T max (℃)로 정의됩니다. 도 3A에 나타낸 바와 같이, 배양 접시가 가열판에 놓인 시점에서 프로그램을 수행 하였다. 37 ° C에서 안정된 중간 온도를 보관하는 데 필요한 140 초의 "예열 시간 1"후 8 초의 예열 시간 2 동안 배양 접시의 덮개가 제거되었습니다. "예열 시간 2"가 끝나면 레이저 방출이 자동으로 시작됩니다. 이 곡선은 10 초 조사의 대표적인 온도 진행입니다. 조사 동안, 온도는 증가하였고, 레이저 방출 직후꺼지면 온도가 내려 가기 시작했습니다. 배양 접시의 중심에서 최대 온도는 본 연구에서 T ma.......

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토론

온도와 관련된 생물학적 세포 반응을 논의 할 때, 대부분의 생화학 적 과정은 시간에 의존하기 때문에 온도뿐 아니라 증가 된 온도의 지속 시간도 중요합니다. 특히 안과에서 레이저로 유발되는 고열의 경우 밀리 초에서 초까지의 짧은 시간 범위로 인해 정확한 온도 제어로 세포 열 효과를 조사하기가 어렵습니다. 따라서, 세포 배양 모델 및 엄격한 온도 및 시간 제어를 가능하게하는 조작 시스템에 적합한 레이저 조사 장치가 요구된다. 단백질 발현이나 분비와 같은 열 노출 후 세포 반응의 생물학적 평가는 충분한 수의 영향을받는 세포에 대해 반복적으로 정량적 평가가 필요합니다. 이것은 임상 치료에서와 같이 직경이 수백 마이크로 미터 인 레이저 스폿을 사용하는 연구에 장애가되고 있습니다. 단일 레이저 지점에서의 정량 분석은 매우 유용합니다.rdensome. 이 연구에서는 가능한 한 이러한 요구를 충족시키기위한 시도가 이루어졌다. 조사 제어 프로그램과 함께 1.94 μm 파장의 연속파 두륨 레이저를 사용함으로써, 짧은 시간 내에 전체 세포 배양에.......

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 독일 연방 교육 연구부 (BMBF) (부여 # 13GW0043C)와 유럽 우주 항공 연구 개발국 (EOARD, grant # FA9550-15-1-0443)의 연구비 지원에 의해 지원되었으며,

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약
Dulbecco' 의 변형된 독수리' s 매체 - 고혈당Sigma-AldrichD5796-500ML사용하기 전에 (2)-(4)를 추가하십시오. 37 °에서 따뜻하게; C 사용 전 수조.
항생제 항진균 용액 (100 ×)시그마 AldrichA5955-100ML10,000 단위 페니실린, 10 mg 스트렙토 마이신 및 25 &mu를 포함; g 암포테리신 B 1mL. 사용하기 전에 500mL 중간 크기의 병(1)에 5.5mL를 넣으십시오.
피루브산나트륨 (100 mM)Sigma-AldrichS8636-100ML사용 전 500 mL 중간 크기 병(1)에 5.5 mL 첨가 (최종 농도: 1 mM)돼지
혈청Sigma-Aldrich12736C-500ML사용 전 500 mL 배지 병(1)에 50 mL 첨가 (최종: 10%)
인산염 완충 식염수(PBS)Sigma-AldrichD8537-500ML
돼지 췌장에서 추출한 트립신Sigma-AldrichT4799-25G
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)시그마-알드리치ED-100G
인간 VEGF 퀀티킨 ELISA 키트R& D 시스템DVE00
Oxiselect 총 글루타티온 분석 키트Cell Biolabs, IncSTA-312
세포사멸/괴사/건강한 세포 검출 키트PromoKinePK-CA707-30018
NameCompany카탈로그 번호Comments
Equipments
Thulium laserStarmedtec GmbHPrototype0-20 W
365 mm 코어 직경파이버 레이저 구성 요소 독일CF01493-52
열전대Omega Engineering IncHYP-0- 33-1-T-G-60-SMPW-M
가열판MEDAX
Microplate 리더 ( 분광형광계)분자 장치Spectramax M4
세포 균질화기QIAGENTissueLyser, LT
형광 현미경NikonECLIPSE, Ti
수학 소프트웨어 프로그램The Mathworks. IncMATLAB 릴리스 2015b
시스템 설계 플랫폼National InstrumentLabviewLaboratory Virtual Instrument Engineering Workbench
: , , , , , ,

참고문헌

  1. Inagaki, K., et al. Comparative efficacy of pure yellow (577-nm) and 810-nm subthreshold micropulse laser photocoagulation combined with yellow (561-577-nm) direct photocoagulation for diabetic macular edema. Jpn J Ophthalmol. 59 (1), 21-28 (2015).
  2. Roider, J., et al.

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재인쇄 및 허가

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