간섭이없는 마이크로 / 나노 입자의 세포 공학을위한 미세 유체 버퍼 교환

요약

이 프로토콜은 언 바운드 입자의 효율적인 고갈과 마이크로 / 나노 입자 설계 세포를 정화하는 관성 미세 유체 기반의 버퍼 교환 전략의 사용을 설명합니다.

초록

활성 성분 로딩 마이크로 / 나노 입자 공학 세포 (NPS는) 고유 치료 특성을 향상 바이오 이미징 활성화 및 세포 표현형을 제어하기 점점 더 많이 사용되는 방법이되고있다. 중요한 아직 부적절하게 해결 문제는 쉽게 기존의 원심 분리로 제거 할 수없는 셀 라벨 후 언 바운드 남아있는 입자의 상당수입니다. 이 생체 촬상 배경 잡음의 증가를 초래하고 인접 비 표적 세포 상 변화시키는 효과를 부여 할 수있다. 이 프로토콜에서는, 우리는 효율적으로 높은 처리량 방식으로 무료 NP에에서 표지 세포를 분리 딘 흐름 분획 (DFF) 되나 관성 미세 유체 기반의 버퍼 교환 전략을 제시한다. 결합되지 않은 형광 염료 또는 염료 로딩 된 NP (SIL의> 95 % 고갈을 달성하면서 개발 된 나선형 마이크​​로 디바이스는, 새로운 완충액에 현탁 정제 세포 (THP-1 및 중간 엽 줄기 세포)의 연속 컬렉션 (> 90 %의 세포 복구)을 용이ICA 또는 PLGA). 이 단일 단계 크기 기반 셀 정제 전략은 높은 셀 처리량 ⁽¹⁰⁶ 세포 / 분)을 가능하게하며, 무 간섭 임상 적용을 달성하기 위해, 마이크로 / 나노 공학 세포의 대용량 전지의 정제에 매우 유용하다.

서론

에이전트로드 마이크로 / 나노 입자 NPS ()에 의해 세포를 엔지니어링하는 bioimaging 기능을 강화하고 재생 의학에 네이티브 치료 특성을 보충 / 보강하는 간단한, 게놈 통합이없는, 그리고 다양한 방법입니다. ^1-3 세포 변형이 라벨에 의해 달성된다 에이전트로드 NP에 과량의 농도와 세포막이나 세포질은 결합 부위를 포화합니다. 그러나,이 방법의 주요 단점은 변형이 포함 된 NP에 상당한 잠재적으로 입자 조작 된 세포의 정확한 식별을 혼동 또는 치료 결과를 복잡하게. ^4,5 또한 수 셀 라벨 처리 후 용액에 남아있는 언 바운드 입자의 양, 노출입니다 과도하게 높은 농도의 제 (성장 인자, 스테로이드 등) 비 표적 세포에 대한 의도하지 않은 결과를 유발할 수 잘못 전달 독성 및 노출을 야기 할 수있다. O를 포함하더라도 입자 캐리어f를 "생체 적합성"재료 [예를 들어, 폴리 (유산 공동 글리콜 산), PLGA]는 강력한 면역 세포의 특정 조건에서 반응뿐만 아니라 선동 할 수 있습니다. ^(6)이 손상된 면역 (예를 들어, 류마티스 관절염) 잠재적으로 지연을 가진 개인에서 특히 위험하다 전신 나노 틈새. ⁽⁷⁾ 따라서, 종래의 입자 공학 세포 도입 자유 입자의 효....

프로토콜

중간 엽 줄기 세포와 단핵구 1. 나노 입자 (NP에) 라벨링

1. 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM)에서 배양 된 중간 엽 줄기 세포 (MSC들)은 종래 라벨링 ≥80 %의 컨 플루 언시에 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 항생제가 보충. 마찬가지로, 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI)에서 배양 THP-1 세포 (ATCC)는 1640 배지는 10 ~ ¹⁰⁶ 세포 / ml의 농도로 10 % FBS가 보충.
2. 로드 실리카 NP는 (~ 500 μm의) 밤새 교반 칼 세인을 사용하여 염료 용액 (200 μM)과. 앞에서 설명한 프로토콜 사용 PLGA-칼 세인의 AM (CAM)을 제작한다. ⁽²²⁾
   1. 250 μg의의 CAM과 4 ° C에서 클로로포름 100 mg의 PLGA (50:50)을 녹인다.
   2. 실온에서 고속 균질화 (13,600 × g으로 60 초)를 사용하여 단일 에멀젼 NPS를 생성한다. (더블 disti을 (3,400 XG 5 분) 원심 분리를 이용하여 세척 수집하기 전에 화학 후드 (≥3 시간)에 클로로포름을 증발채워진 물), 동결 건조 및 저장을 -20 ° C에서.
3. 20 분 - CAM-PLGA NP에 (1 mg)을 15 시간 동안 실온에서....

결과

밤새 바이오 영상 화제 장착 된 NP와 세포를 라벨링 한 후, 표지 된 세포 (유리 입자를 포함) 수확 단일 단계 공정 (도 1a)에 자유 NPS를 제거 DFF 나선형 마이크로 디바이스에 의해 정제 하였다. 2 입구, 2 콘센트에 나선 마이크로은 SU-8 포토 레지스트를 사용하여 엔지니어링 소프트웨어에 의해 설계 및 마이크로 제조된다. 패턴 화 된 실리콘 웨이퍼를 다음 소프트 리소그래피 기술 (도 1b)를 이용하여 PDMS 복제 성형 용 주형으로 사용한다. 내벽 입구는 세포 샘플의 흐름을 끼지 높은 유량 (1시 10분) 신선한 완충액을 실행하면서 세포의 선별을 수행하기 위해, 세포 샘플을 나선형 마이크​​로 디바이스의 외벽 유입구로 펌핑된다. 분리 관성이 내벽과 외벽 (도 2A)를 향해 작은 비 결합 된 NP 딘 유도 재순환에 큰 표지화 된 세포의 초점을 맞춤으로써 달성된다. 이.......

토론

여기에 기술 된 셀 DFF 정화 기술은 높은 처리량의 방식으로 표지 된 세포의 신속한 연속 분리 할 수​​있다. 이 분리 방법은 많은 샘플 량 또는 높은 세포 농도 시료 처리에 적합하고, 장시간 사용 후에 막히는 경향이 종래의 막 여과 계보다 낫다. 마찬가지로, 선호도 기반의 자기 분리가 힘들고 비용이 추가 셀 라벨 단계가 필요합니다. 정제 된 세포 (채널 내에 때문에 짧은 체류 시간에 자신의 레이블 에이전트와 잘 세포 형태 최소 유량 / 전단 유발 효과 (그림 3) (전단 응력 τ ~ 200-250 다인 / ㎝ ^2)를 유지하기 위해 표시됩니다 < 1 초) ^{20, 24.} 또한, 사용자는 단순히 원하는 미디어 또는 완충액 시스 완충액 (식염수)를 대입하여 정렬 표지 된 세포의 용출 용액을 선택할 수있다.

그것은이 중요하다나쁜 세포 초점을 맞추고 행동에 영향을 미칠 수있는 마이크로 이전에 사용에는 먼지 나.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
세포주 & 매체
중간엽 줄기세포(MSC)	Lonza	PT-2501
Dulbecco' s 변형 된 독수리' s medium (DMEM)	Lonza	12-614F
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-106
THP-1 monocyte cells (THP-1)	ATCC	TIB-202
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media	Lonza	12-702F
Reagents & 재료
0.01% 폴리-L-라이신(PLL)	Sigma-Aldrich	P8920
3ml 주사기	BD	302113	주사기 3ml Luer-Lock
60ml 주사기	BD	309653	주사기 60ml Luer-Lock
소 혈청 알부민(BSA)	Biowest	P6154-100GR
Calcein, AM (CAM)	Life Technologies	C1430
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875
이소프로판올	Fisher Chemical	#P/7507/17	HPLC 등급 2.5L
인산염 완충 식염수(PBS)	Lonza	17-516Q/12
일반 현미경 슬라이드	Fisher Scientific	FIS#12-550D	75 x 25 x 1mm3
폴리디메틸실록산(PDMS)	Dow Corning	SYLGARD® 184
스카치 테이프	3M	21200702044	18 mm x 25 m
실리카 NPs (∼ 200 &뮤; m)	Sigma-Aldrich	748161	기공 크기 4 nm
주사기 팁	JEC 기술	7018302	23 G 0.013 x 0.25
트립신-EDTA (0.25 %)	생명 기술	25200-056
Tygon 튜빙	Spectra-Teknik	06419-01	0.02 x 0.06 " 100
폴리 (D, L- 락타이드 - 코 글리콜 라이드) (PLGA; 50 : 50)	시그마 알드리치	P2191
Equipment
Biopsy punch	Harris Uni-Core	69036-15	1.50 mm
Dessicator	Scienceware	111/4 IN OD
고속 카메라	팬텀	V9.1
반전 위상차 현미경	니콘	이클립스 Ti
플라즈마 클리너	해릭 플라즈마	PDC-002
주사기 펌프	Chemyx	CX Fusion 200