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방법 논문

생체 외 및 생체 내 모델에서 각막 내피 세포 - 중간 엽 전이를 공부하기

7.6K 조회수

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DOI:

10.3791/54329

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2016년 8월 20일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Far Eastern Memorial Hospital, 2Institute of Clinical Medicine, National Taiwan University, 3Department of Ophthalmology, National Taiwan University Hospital, 4College of Medicine, National Taiwan University

이 논문에서

요약

소 각막 내피 세포의 일차 배양 각막 내피 간엽 전이의 메커니즘을 조사 하였다. 또한, 래트 각막 내피 cryoinjury 모델 생체 내 각막 내피 간엽 전환을 증명 하였다.

초록

각막 내피 세포(CEC)는 활발한 펌핑을 통해 각막의 투명도를 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. CEC 수치가 감소하면 각막 부종이 발생하고 시력이 저하될 수 있습니다. 그러나 인간 CEC는 증식 가능성이 손상되기 쉽습니다. 또한, 세포 성장 자극은 점진적 내피-중간엽 전이(EnMT)에 의해 복잡해지는 경우가 많습니다. 따라서 EnMT의 메커니즘을 이해하는 것은 유능한 기능을 가진 CEC의 재생을 촉진하는 데 필요합니다. 본 연구에서는 각막에서 Descemet's membrane으로 CEC를 벗겨내어 소 CEC의 1차 배양을 준비하고, 소 CEC가 in vitro 배양에서 표현형 변화, β-catenin의 핵 전좌, EMT 조절인자인 달팽이와 민달팽이를 포함한 EnMT 과정을 나타냈음을 입증했습니다. 또한 쥐 각막 내피 냉동 손상 모델을 사용하여 in vivo에서 EnMT 프로세스를 시연했습니다. 총체적으로, 소 CEC의 체외 1차 배양 및 생체 내 쥐 각막 내피 냉동 손상 모델은 EnMT의 메커니즘을 조사하는 데 유용한 플랫폼을 제공합니다.

서론

각막 내피 세포(CEC)는 적극적인 펌핑을 통해 각막 기질의 수분 상태를 조절함으로써 각막의 투명도를 유지하여 시력을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다1. 인간 CEC의 증식 잠재력이 제한되어 있기 때문에 세포 수는 나이가 들면서 감소하며, 손상 후 각막 내피 상처의 복구는 일반적으로 세포 유사분열보다는 세포 확대 및 이동을 통해 이루어집니다2. CEC 수가 약 500 cells/mm2의 임계값 이하로 감소하면 각막 기질의 탈수 상태를 유지할 수 없어 수포성 각막병증 및 시력 손상이 발생합니다3,4.

인간 CEC의 제한된 증식 잠재력은노화 세포에서 표피 성장 인자와 그 수용체의 발현 감소5, 수액 내 항증식성 TGFβ26, 접촉 억제2,7 등 여러 요인에 기인합니다. 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)와 같은 일부 성장 인자는 배양된 인간 각막 내피에서 증식을 증가시킬 수 있지만, 배양 효율은 여전히 제한적입니다8,9. 또한, CEC는 생체 외 확장 중에 상피-중간엽 전이(EMT)10-13과 유사한 표현형 변화를 겪을 수 있습니다. EnMT(Endothelial-mesenchymal transition)는 세포 접합 불안정화, 정점-기저 극성 손실, 세포골격 재배열, 알파 평활근 액틴 발현 및 I형 콜라겐 분비를 특징으로 합니다14. 이러한 모든 특성은 CEC의 정상적인 기능을 폐지하여 조직 공학에서 체외 배양 CEC의 사용을 방해할 수 있습니다. 또한, EnMT는 Fuchs 내피 각막 이영양증(endothelial endecal dystrophy) 및 후각막막 형성(retrocorneal membrane formation)을 포함한 여러 각막 내피 질환의 발병기전과 관련이 있습니다15,16. 따라서 EnMT의 메커니즘을 이해하면 EnMT 프로세스를 조작하는 데 도움이 될 수 있으며 CEC를 재생하여 유능한 기능을 수행할 수 있습니다.

이 연구에서는 각막에서 소 CEC를 분리하는 방법을 설명했습니다. 1차 in vitro 배양에서는 표현형 변화, β-catenin의 핵 전좌, EMT 조절자 달팽이와 민달팽이를 포함한 EnMT 과정이 관찰되었습니다. 우리는 쥐 각막 내피 동결 손상 모델을 사용하여 생체 내에서 EnMT를 시연하는 방법을 추가로 설명했습니다. 이 2가지 모델을 사용하여 광범위한 MMP(Matrix, 기질단백분해효소) 억제제인 마리마스타트(marimastat)가 EnMT 과정을 억제할 수 있음을 입증했습니다. 설명된 프로토콜은 EnMT 메커니즘에 대한 자세한 분석과 추가 임상 적용을 위해 EnMT 프로세스를 조작하기 위한 전략 개발을 용이하게 합니다.

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프로토콜

모든 절차는 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용을위한 비전 및 안과 문에 연구를위한 협회 부여 본 연구에서 다음과 국립 대만 대학 병원의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 격리, 차 문화의 제조 및 소 CECs의 면역 염색

  1. 로컬 도살장에서 신선한 소 눈을 획득.
  2. 3 분 동안 10 %의 v / w 포비돈 요오드 용액에 눈 소독. 인산염 완충 식염수 (PBS) 솔루션을 씻으십시오.
  3. 무균 조건에서 메스와 가위로 각막 버튼을 수확. 해부 현미경 집게로 껍질 데스 메막 (이 연구에서 그주의, 소 눈은 로컬 도살장에 의해 적출 된, 따라서 첫 번째 연구 절차는 실험실에서 preenucleated 눈의 소독이었다).
  4. 시도 1 ㎖에 데스 메 막을 품어30 분 동안 37 ° C에서 psin. 5 분 112 XG에서 원심 분리하여 소 CECs를 수집합니다. 보충 호르몬 상피 매체 (SHEM) HEPES 완충 둘 베코 변형 이글 배지와 5 % 소 태아 혈청이 보충 된 햄 F12 배지, 0.5 % 디메틸 술폭 시드, 인간 표피 2 ng를 / ㎖의 동일한 양을 함유하는 1 ml의 세포를 재현 탁 성장 인자, 5 밀리그램 / 인슐린 ㎖, 5 밀리그램 / 트랜스페린 ㎖, 5 NG / 셀레늄 ㎖, 콜레라 독소의 1 nmol의 / l, 50 밀리그램 / 젠타 마이신 ㎖, 1.25 밀리그램 / 암포 테리 신 B의 용액
  5. 6 형상 접시에 세포 (안구 당 ​​약 1 × 105 세포)를 시드. 셈 문화를. 공기 중 5 % CO 2 분위기하에 37 ℃에서 인큐베이션 접시. 3 일마다 배지를 변경합니다.
  6. 세포가 합류점에 도달하면, PBS로 씻어, 5 분 동안 37 ° C에서 트립신 1 ㎖ 그들을 부화. 5 분 112 XG에서 원심 분리를 수집합니다. 셈 1 ㎖의 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
    1. 혈구의 세포를 계산합니다. A A 24 웰 플레이트에 웰 당 1 × 104의 밀도, 문화 셈의 셀에서 커버 슬라이드에 세포를 시드. 타틴의 EnMT 억제 효과를 조사하는 경우, 타틴의 μM이 배양 배지에 첨가 10 SHEM에서 세포를 배양하고, 3 일마다 배양액을 변경합니다.
  7. 실온에서 30 분 동안 4 % 파라 포름 알데하이드 250 ㎕를, pH가 7.4으로 지시 된 시점에서 세포를 고정한다. 5 분 동안 0.5 % 트리톤 X-100 250 ㎕를 함께 Permeabilize 하시려면. 30 분 동안 10 %의 소 혈청 알부민으로 차단.
  8. 밤새 4 ℃에서 활성 베타 - 카테닌 (ABC), 달팽이와 민달팽이에 대한 일차 항체와 세포를 품어. 200 : 사용 된 일차 항체의 희석은 1입니다. 항체는 10 mM의 PBS, 1 %의 v / w 소 혈청 알부민 및 0.09 % w / V의 아 지드 화 나트륨으로 구성된 항체 희석제로 희석된다.
  9. 15 분 동안 PBS로 두 번 세포를 세척하고, 품어1 시간 동안 실온에서 (항체 희석액 100 1) 알렉사 형석 접합 이차 항체 m.
  10. 4 ', 6-diamidino-2-페닐 인돌 2 μg의 / ml의 세포를 피복하여 세포 핵 Counterstain과 15 분 동안 PBS로 두 번 세포를 씻어 장착 용액을 안티 페이드로 마운트.
  11. 20X 목적 배율 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여 405 및 488 nm의의 여기 파장에서 면역 형광 이미지를 얻습니다.

2. 쥐 각막 내피 Cryoinjury 모델 및 내원시 주입

  1. 2 % 자일 라진 (5.6 ㎎ / ㎏) 및 tiletamine 플러스 zolazepam (/ kg 18 mg)을 근육 주사이 12 주령의 수컷 흰쥐를 마취. 가볍게 피부 경련의 부재하에 적절한 마취를 확인하기 위하여 동물의 피부를 끼우는.
  2. 눈의 통증과 깜짝 반사를 최소화하기 위해 각 쥐의 오른쪽 눈에 0.5 % proparacaine 염산염 한 방울을 주입. 주입왼쪽 눈에 테트라 사이클린 연고는 각막 건조를 방지합니다.
  3. 액체 질소 스테인레스 스틸 프로브 (직경 = 3 mm)를 냉각. 30 초간 오른쪽 눈의 중심 각막 스테인리스 프로브를 적용한다. 자주 각막 건조를 방지하는 절차 중 우측 눈에 PBS를 주입.
  4. 즉시 cryoinjury 후 0.1 % 아트로핀 및 0.3 % 황산 젠타 마이신을 주입 매일 한번 섬모 경련으로 인한 안구 통증을 완화하고, 감염을 방지 할 수있다.
    1. 시술 후, 래트를 가열 램프를 이용하여 보온, 그들은 모터 제어를 회복 할 때까지 마취 회복 후에도 15 분마다 관찰. 또한 회복 기간 동안 각막의 건조를 방지하기 위해 우안에 테트라 사이클린 연고를 적용한다.
  5. 3 일 연속 각막 cryoinjury를 반복합니다.
  6. 전술 한 바와 같이 쥐 눈의 전방 챔버로 타틴 또는 bFGF를 전달 들어, 래트를 마취. 한 방울을 주입오른쪽 눈에 0.5 % proparacaine 염산염의 눈의 통증과 깜짝 반사를 최소화합니다.
  7. 멸균 PBS와 안구 표면을 관개. 홍채에 위의 평행 한 평면에 paralimbal 맑은 각막에 1 ML의 주사기에 부착 된 30 G 바늘을 삽입하여 운영 현미경으로 전방 천자를 수행합니다.
  8. 바늘이 최대 베벨 켜고, 약간 약간의 방수를 배출하고 안압을 줄이기 위해 각막 상처를 우울. 에 각막 약 0.02 mL의 주입. 조심스럽게 바늘을 철수하는 동안면 끝이 바늘 관을 압축합니다.
  9. 운영 현미경 지시 된 시점에서, 외부 눈 사진.

3. 수확 쥐 각막 버튼과 면역 염색

  1. 래트를 안락사하려면 안락사 챔버에 배치 분당 챔버 부피 10-30 %의 충전 속도로 100 % CO 2 달이다. 에 대한 CO 2 주입 유지호흡의 부족 및 머 금고 눈 색깔 후 추가 분.
  2. 날카로운 블레이드와 윤부에서 쥐의 눈을 침투. 윤부를 따라 각막 가위로 각막을 잘라. 슬라이드에 각막을 평평하게. 각막이 꼬고 경우 추가 반경 방향 절개를합니다.
  3. 실온에서 30 분 동안 4 % 파라 포름 알데하이드 250 ㎕를, pH가 7.4으로 각막을 수정. 5 분 동안 0.5 % 트리톤 X-100 250 ㎕를 Permeabilize 하시려면로, 30 분 동안 10 %의 소 혈청 알부민으로 차단.
  4. (1)의 희석 4 ° C에서 하룻밤 ABC에 대한 일차 항체로 각막을 품어 : (200) 항체 희석액에. 15 분 동안 PBS로 두 번 씻어 각막 및 이차 항체로 배양 한 1 시간 동안 실온에서 (1 항체 희석제 100). 셀 2 μg의 4 / ㎖ ', 6-diamidino -2- 페닐 인돌로 세포를 피복함으로써 핵 및 15 분 동안 PBS로 두 번 세포를 씻어 Counterstain과.
  5. 설치 솔루션을 방지 페이딩의 각막을 탑재합니다. 산부인과20X 대물 확대 한 레이저 스캐닝 공 초점 현미경으로 면역 (405)의 여기 파장 및 561 nm의 이미지를 주석 박.

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결과

소 CECs의 분리 후, 세포를 시험관 내에서 배양 하였다. (1)가 소 CECs의 위상차 이미지를 보여주고있다. 합류 셀의 육각형은 세포가 세포 분리 동안 각막의 간질 섬유 아세포에 의해 오염되지 않은 것으로 나타났다. (2)는 지정된 시점에서 ABC, 달팽이와 민달팽이에 대한 항체를 이용하여 수행 한 면역 염색을 보여주고있다. 외에도 체외 배양 표현형 변화에서, ABC 및 EMT 레귤레이터 대응 핵 전위가 관찰되었다.도 3은 시험 관내 배양 소 CECs의 EnMT 프로세스에 타틴 효과, 광범위한 스펙트럼 MMP 억제제를 나타낸다.도 도 4는 전방 내 주사 하였다 cryoinjury 후 쥐의 외부 눈 사진을 포함한다.도 5는,...

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토론

CECs는 세포 증식 동안 EnMT를 받아야하는 그들의 성향 알려져있다. 치료 목적 EnMT 처리를 억제하기위한 전략을 개발하려면 EnMT기구의 완전한 이해가 필요하다. 우리는 EnMT, 체외 배양 모델 쥐의 각막 내피 세포의 cryoinjury 모델, 즉 소 CEC를 조사하기 위해이 모델을 설명했다. 우리의 결과는 두 모델의 EnMT 과정을 보여 주었다. 또한, 타틴의 EnMT 억제 효과는이 두 모델은 동일한 메커니즘을 공유 할 것을 제안, 두 모델에서 재현되었다.

체외 배양 모델의 소 CEC는 조작의 용이성을 제공합니다. 또한, 이전의 연구 (17, 18)에 사용되는 체외 배양 모델에서 인간 영장류 또는 CEC 비해 소의 눈을 더 크고 더 확보하기 쉽게하고, 따라서 더 CECs 사용할 수있다. 우리의 연구에서, 우리는 지역 도살장에서 세포핵이 제거 된 소의 ...

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공개 사항

저자는 선언할 경쟁적인 재정적 이해관계가 없습니다.

감사의 글

기술 지원에 대해 National Taiwan University Hospital 의학 연구과 Second Core Lab 직원들에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
트립신ThermoFisher Scientific12604-013
Dulbecco' s 변형된 Eagle 매체와 Ham's F12 매체ThermoFisher Scientific11330
태아 소 혈청ThermoFisher Scientific26140-079
디메틸 설폭사이드SigmaD2650
인간 표피 성장 인자ThermoFisher ScientificPHG0311
인슐린, 트랜스페린, 셀레늄 ThermoFisher Scientific41400-045
콜레라 독소SigmaC8052-1MG
겐타마이신ThermoFisher Scientific15750-060
암포테리신 BThermoFisher Scientific15290-026
파라포름알데히드전자 현미경 과학111219
Triton X-100SigmaT8787 
소 혈청 알부민SigmaA7906
marimastatSigmaM2699-25MG
항활성 베타 카테닌 항체Millpore05-665
항달팽이 항체Santa cruzsc28199
항민달팽이 항체Santa cruzsc15391
염소 항마우스 IgG (H+L) secondary ThermoFisher ScientificA-11001소 CECs
염소 안티 마우스 IgG (H + L) 2 차 항체ThermoFisher ScientificA-11003쥐 각막 내피
염소 안티 토끼 IgG (H + L) 2 차 항체ThermoFisher ScientificA-11008달팽이 및 소 CEC
항체 희석제염색 생명공학10-0001
4',6-디아미디노-2-페닐린돌 ThermoFisherScientificD1306
마운팅 매체Vector LaboratoriesH-1000
레이저 스캐닝 컨포칼 현미경ZEISSLSM510
xylazine 바이엘N/A
틸레타민 플러스 졸라제팜VirbacN/A동물용 약물
프로파라카인 하이드로클로라이드 안과 용액AlconN/A동물용 약물
0.1% 아트로핀Wu-Fu Laboratories Co., LtdN/A임상 약물 
0.3% 겐타마이신 설페이트Sinphar 그룹N/A임상 약물 
기본 섬유아세포 성장 인자ThermoFisher ScientificPHG0024임상 약물 
항체 의 ABC 염색 :

참고문헌

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