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방법 논문

친 유성 독소루비신 전구 약물 미셀의 제조 및 특성화

14.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54338

⸱

2016년 8월 2일

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Hampton University

이 논문에서

요약

친 유성 독소루비신 전구 약물의 제조 및 특성화를위한 프로토콜 1,2- distearoyl- SN -glycero -3- phosphoethanolamine- N로드 - [아미노 (폴리에틸렌 글리콜) -2000 (PEG-DSPE) 미셀 설명한다.

초록

미셀은 항암제 전달에 성공적으로 사용되었습니다. 양친매성 폴리머는 자체 조립을 통해 수성 환경에서 코어 쉘 구조의 미셀을 형성합니다. 미셀의 소수성 코어는 약물 저장소로 기능하며 소수성 약물을 캡슐화합니다. 친수성 껍질은 미셀의 응집을 방지하고 생체 내에서 전신 순환을 연장합니다. 이 프로토콜에서는 독소루비신 친유성 친약물인 독소루비신-팔미틱산(DOX-PA)을 합성하는 방법을 설명하며, 이는 미셀로의 약물 로딩을 향상시킵니다. pH에 민감한 히드라존 링커를 사용하여 독소루비신을 지질과 접합하여 암세포 내에서 유리 독소루비신의 방출을 촉진했습니다. 합성된 DOX-PA는 디클로로메탄/메탄올을 용리액으로 사용하여 실리카겔 컬럼으로 정제했습니다. 정제된 DOX-PA를 박층 크로마토그래피(TLC) 및 1H-핵 자기 공명 분광법(1H-NMR)으로 분석했습니다. DOX-PA 로딩 DSPE-PEG 미셀을 준비하기 위해 필름 분산 방법을 사용했습니다. 또한 DOX-PA 농도 및 캡슐화 효율 측정, 입자 크기 및 분포 측정, 체외 항암 활성 평가를 포함하여 미셀 제형을 특성화하는 여러 방법이 설명됩니다. 이 프로토콜은 약물 적재 미셀의 준비 및 특성화에 관한 유용한 정보를 제공하므로 새로운 미셀 기반 암 나노의약품의 연구 및 개발을 촉진할 것입니다.

서론

화학 요법은 일반적으로 암의 다양한 형태를 치료하는 데 사용됩니다. 모든 경우 대부분은 화학 요법 약물은 더 많은 생명을 위협 조건, 오심, 설사 등의 관리가 작은 조건에 따라 다를 수 독성 부작용이있다. 대부분의 항암제는 독성이 있기 때문에 정상 조직에 대한이 약의 비 선택적 노출은 필연적으로 독성이 발생합니다. 따라서, 선택적으로 암세포에 약물을 전달할 수있는 치료 방법에 대한 중대한 필요성이있다. 항암제의 투여와 함께 또 다른 문제는 가난한 수용성이다. 일반적으로, 가용 화제는 이러한 난 용성 약물을 수립 할 필요가있다. 그러나, 디메틸 설폭 사이드와 같은 대부분의 가용 화제, (DMSO), 크레 모포 EL 및 폴리 솔 베이트 80 (트윈 80) 간 및 신장 독성, 용혈, 급성 과민 반응 및 말초 신경 병증의 원인이 될 수 있습니다. 1 따라서, 안전하고 생체 적합성 제제는 필요하다 가난한 사람들의 임상 사용LY 수용성 항암제. Nanocarriers은 상기 과제에 대한 약물 전달 시스템을 약속한다. 이 nanocarriers는 리포좀,이 나노 입자, 3 미셀, 4-7 고분자 - 약물 접합체, 8, 무기 물질을 포함한다. 9 몇 나노 의학 제품 (예를 들어, Doxil, 아브 락산 및 Genexol)는 암 환자를 치료하기 위해 규제 기관에 의해 승인되었습니다. (10)

고분자 미셀이 성공적으로 항암제의 전달에 사용 된 나노 크기의 약물 전달 담체를 약속한다. 4-7,11,12 전형적인 고분자 미셀은 자기 조립 공정을 통해 양친 성 중합체로부터 제조된다. 코어 - 쉘 구조 고분자 미셀은 친수성 ​​쉘과 소수성 코어를 포함한다. 친수성 쉘은 입체적으로 미셀을 안정화시키고 혈류에서의 순환을 연장 할 수 있습니다. 소수성 코어는 효과적으로 소수성 D를 캡슐화 할 수 있습니다양탄자. 때문에 미셀 (일반적으로 미만 200 ㎚) 및 장기 순환 속성의 작은 크기, 고분자 미셀이 향상 침투성 및 보존 (EPR) 효과 (수동 종양 타겟팅)을 대상으로 종양을 달성 할 것으로 추정된다.

봉입 안정성은 미셀의 능력을 표적 종양 중요하다. 최적 종양 타겟팅을 달성하기 위해, 미셀은 종양 부위에 도달하기 전에 최소 누설 약물이 아직 신속 암세포를 입력 한 후 약물을 방출한다. 제제의 안정성이 제품 개발의 실행 가능성뿐만 아니라 개발 된 제품의 저장 수명을 결정하기 때문에 또한 제제 안정성, 또한, 제품 개발을위한 필수 요건이다. 최근 많은 노력 전달 담체에 약물의 로딩을 개선하려고했다. 친 유성 전구 약물 접근 지질 나노 입자 에멀젼에 약물 로딩을 개선 탐색 된 전략이다. 13,14 접속사약물과 지질의 ugation 크게 자신의 친 유성을 개선하고 nanocarriers의 친 유성 성분의로드 및 보존을 향상시킬 수 있습니다.

여기서는 친 독소루비신 전구 약물로드 미셀을 제조하는 프로토콜을 기술한다. 우선, 친 유성 약물 독소루비신위한 합성 과정을 설명한다. 이어서, 필름 분산 법 마이셀을 생성하는 프로토콜이 도입된다. 이 방법을 성공적으로 이전 연구에서 사용되었다. 5 DSPE-PEG가 성공적 미셀 약물 전달을 위해 사용 되었기 때문에 미셀을 제조하기위한 담체 물질로서 선택 하였다. (15, 16)는 마지막으로, 미셀을 특성화하는 데 사용되는 여러 가지 시험 관내 분석을 서술 제형은 항암 활성을 평가 하였다.

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프로토콜

DOX-PA 1. 합성

  1. 독소루비신의 390 밀리그램과 팔 미트 산 히드라 지드 243 mg의 무게를 측정하고, 둥근 바닥 플라스크에 전송할 수 있습니다.
  2. 유리 주사기와 플라스크에 무수 메탄올 150 ㎖를 추가합니다. 피펫으로 트리 플루오로 아세트산 (TFA)의 39 μl를 추가합니다. 자기 교반기를 사용하여, 어두운 곳에서 실온에서 18 시간 동안 반응 혼합물을 교반 하였다.
    비고 : 반응 물질의 양을 확장 할 수있는 아래 DOX-PA의 상이한 양을 얻었다. 반응물의 비율을 같은 비율로 유지되어야한다. 78 ㎎을 1,170 ㎎의 범위에서 DOX 수량을 사용하는 반응은 일반 화학 실험실에서 수행 될 수있다.
  3. 실리카 겔 컬럼을 사용 DOX-PA 정제. 17
    1. 로타리 증발기로 반응 혼합물 중의 용매를 제거한다. 혼합물의 부피를 약 20 mL로 감소 된 후 실리카겔 3g을 추가한다. 건조 분말을 얻었다 회전 증발을 계속 t 수 있도록그 실리카 겔에 흡착 제품. 건조 분말을 형성 한 후 추가로 30 분 동안 진공 상태에서 시료를 유지한다.
    2. 용매로서 디클로로 메탄을 이용하여 컬럼에 실리카 겔 50g을 팩. 조심 컬럼에 흡착 생성물을 함유하는 실리카 겔 샘플을 추가한다.
    3. 이에 서서히 극성 용매 (표 1)의 증가, 메탄올의 비율을 증가시키면서, 디클로로 메탄 및 메탄올의 혼합물로 컬럼을 용출시켰다.
    4. 시험관에서의 용출액 분획 (25 ㎖ / 튜브)를 수집하고, 박층 크로마토 그래피 (T​​LC)에 의해 진행 상황을 모니터링한다.
    5. 순수한 DOX-PA 포함하는 모든 분획을 합하고 건조 분말이 형성 될 때까지 회전 증발기를 사용하여 용매를 제거한다. 또한 진공 O의 /의 N에서 제품을 건조.
  4. TLC에 의해 DOX-PA의 분석.
    1. TLC 판의 4cm X 8cm 부분을 잘라. TLC 스포팅 모세관을 가진 판의 바닥에서 현장 샘플 용액 0.5 cm 충족 사용용매로 한올.
    2. 디클로로 메탄 및 메탄올의 혼합물을 함유하는 현상 챔버로 TLC 판 위 (3/1, v / v)로. 용매의 깊이는 0.5 cm보다 그냥 작아야합니다.
    3. 용매 전면 판의 상단에 도달 할 때 현상 실에서 플레이트를 제거합니다. 연필로 용매 앞의 위치를​​ 표시하고 판을 건조 할 수 있습니다. 샘플을 시각화하기 위해 포화 된 요오드 증기를 함유하는 염색 챔버로 TLC 플레이트를 놓는다.
  5. 1 H 핵 자기 공명 분광법 (1H-NMR)와 DOX-PA 분석. 18
    1. 메틸 술폭 시드-D6 (DMSO) 1 ㎖에 DOX-PA 15 mg을 용해하고, NMR 튜브에 시료를 옮긴다.
    2. 핵 자기 공명 악기의 자석에 NMR 튜브를 삽입합니다. 용매로서 DMSO를 선택 양성자 스펙트럼을 측정한다. 자석에서 NMR 튜브를 제거합니다. NMR의 결과 (18)를 분석합니다.

이. 필름 분산 방법에 의해 DOX-PA 미셀 준비

  1. DSPE-PEG (40 mg) 및 PA-DOX (4 mg)을 10 mL 유리 바이알에 2 ㎖의 메탄올로 용해.
  2. 바이알의 박막이 형성 될 때까지 회전 증발기를 사용하여 진공하에 유기 용매를 제거한다.
    대안 적으로, (예를 들어, 아르곤 또는 질소 가스) 막을 형성하고 상기 잔류 용매를 제거하고 진공 건조기에서 바이알을 유지하는 불활성 가스하에 유기 용매를 증발 : 참고.
  3. 전송 유리 병에 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 (pH가 7.4, DPBS) 2 ㎖.
  4. 미셀을 생성하는 RT에서 3 분 동안 초음파 욕조에 병을 놓습니다.
    주 : 초음파 전력은 초음파 화장실의 다른 모델마다 다릅니다. 얇은 폴리머 / 약물 필름을 분산 할 수있는 충분한 초음파 전력을 생성 할 수있는 단위를 선택합니다. 이 프로토콜에서 사용되는 초음파 욕의 출력 전력은 110 (W)이다
  5. 단기 저장을 위해 4 ° C에서 미셀을 유지하고 -20 오래 ° C ~-term 저장.
    참고 : 또한, 미셀은 또한 동결 건조 및 사용하기 전에 물을 재구성 할 수 있습니다. 일반적으로, 더 동결 방지제 또는 lyoprotectant이 제제 필요하지 않습니다.

DOX-PA 미셀 3. 특성

  1. 미셀의 약물 봉입 효율 DOX-PA 농도의 결정
    1. 1 ㎍ / ㎖, 5 μg의 / ㎖, 20 ㎍ / ㎖, 50 ㎍ / ㎖, 100 μg의 / ㎖ : DOX-PA 다섯 가지 농도 DOX-PA 용액을 제조 DMSO에 이전 단계에서 합성 녹인다. 490 nm에서 UV-VIS 스펙트로 DOX-PA 용액의 흡광도를 측정한다. DOX-PA 약물 농도 및 490 nm에서 그들의 대응 흡수에 기초하여 표준 곡선을 생성한다.
    2. DMSO 500 μL와 약물로드 미셀의 25 μl를 희석. 자외선 VIS 분광기로 490 nm에서 흡광도를 측정한다. 3.1.1에서 생성 된 표준 곡선과 약물 농도를 계산한다.
    3. 다음 식을 사용하여 캡슐화 효율을 계산한다 :
      약물의 포위 효율 (%) = (미셀의 약물의 양) / (첨가 약물의 양) × 100 %
  2. 동적 광 산란 입자 크기의 특성 (DLS)
    1. 1 ㎎ / ㎖의 최종 DSPE-PEG 농도 DPBS (PH 7.4)으로 희석 미셀. Z 축 평균 크기 및 분산도 지수 (PDI)를 획득하기 위해 입도 분석기 2 mL의 샘플을 분석한다.
  3. 생체 외 항암 활성 평가
    참고 : 적절한 무균 기술을 사용하고 바이오 안전성 캐비닛 내부에 작동합니다.
    1. 세포 배양 플라스크에서 (예를 들어, T25)를 포함하는 DU-145 인간 전립선 암 세포를 세포 배양 배지를 제거하고 2 ㎖ DPBS (PH 7.4)에 세포를 헹군다.
    2. 대기음 DPBS는 트립신 용액 (0.25 %) 1 mL를 넣고 세포를 분리하여 37 ℃에서 2 분간 배양한다.
    3. 10m 추가세포 배양 배지 L (RPMI 1640 + 10 % 태아 소 혈청 + 1 % 항생제 - 안티 곰팡이), 세포의 대부분은 플라스크로부터 분리 될 때. 15 ㎖의 원심 분리기 튜브와 원심 분리기 5 분 1,000 XG에 세포에 세포를 전송합니다.
    4. 세포 배양 배지 5 ㎖과 세포 펠렛을 다시 중지 및 혈구 세포 수를 카운팅하는 샘플을 제거한다. 50000 세포 / ml의 농도로 세포 배양 배지와 세포를 희석. 96 웰 세포 배양 플레이트에 희석하여 세포 현탁액을 추가 (100 μL / 웰). 세포 배양 인큐베이터에서 인큐베이션 셀 (37 ° C를 5 % CO 2) 18 시간 동안 세포 부착을 허용한다.
    5. 각각 0.1 μM, 0.5 μM, 2 μM, 5 μM, 10 μM을 최종 약물 농도를 얻기 위하여 세포 배양 배지와 DOX의 디메틸 술폭 시드 (DMSO) 용액 DOX-PA DMSO 용액을 희석. 0.5 %에 위의 모든 샘플에서 최종 DMSO 농도를 유지합니다. 최종 약물 공동 얻었다 세포 배양 배지와 DOX-PA 미셀 희석0.1 μM의 ncentrations 각각 0.5 μM, 2 μM, 5 μM, 10 μM. 빈 세포 배양 배지에게 컨트롤을 사용합니다.
    6. 배양기에서 96 웰 세포 배양 플레이트를 제거하고 (각 그룹에 대해 N = 4) 단계 3.3.5에서 제조 된 다른 치료제를 함유하는 배지 100 ㎕와 세포 배양액을 교체한다. (2 37 ° C, 5 % CO) 추가로 72 시간 동안 세포 배양기에서 세포를 인큐베이션.
    7. 배지를 흡인 및 3- (4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일) 0.5 ㎎ / ㎖을 함유하는 배지 100 ㎕ -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT)를 추가한다.
    8. 추가로 2 시간 동안 세포 배양기에서 세포를 인큐베이션. 조심스럽게 매체를 제거하고 포르 마잔 결정을 용해 DMSO 100 ㎕를 추가합니다.
    9. 570 nm 파장과 670 nm의 참조 파장의 마이크로 플레이트 분광 광도계로 흡광도를 측정한다.
    10. 다음 식을 사용하여 세포 생존율을 계산한다 :
      세포 생존율 (%) =는 (A 테스트 / A 컨트롤) × 100 %
      주 : 변동 (ANOVA) 통계 시험의 분석을 사용하여 서로 다른 그룹의 세포 생존율을 비교한다. 약물 농도 데이터 대 세포 생존 능력에 기초하여, IC (50)를 계산한다.

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결과

그림 1은 DOX-PA의 합성 방식을 보여줍니다. DOX-PA는 pH 민감성 히드라 존 결합을 통해 독소루비신 팔 미트 산의 결합에 의해 합성 하였다. 팔 미트 산 히드라 지드의 약간 과량은 반응의 완료를 용이하게하기 위해 사용되었다. 이 반응에있어서 매우 높은 효율이 독소루비신의 소량은 18 시간 반응 (도 2) 뒤에 남아 있었다. 수율은 약 88 %였다. 반응의 끝에서, DOX-PA는 실리카 겔 컬럼을 사용하여 정제하고 순수한 적색 고체 생성물을 얻었다. DOX-PA 정제 된 DOX-PA (도 2)에 대해 하나의 스팟을 보여 TLC로 분석 하였다. (3)이 PA-DOX의 1 H-NMR 스펙트럼을 나타낸다. 독소루비신 및 팔미틴산 모두의 특성 NMR 피크 상기 접합 반응의 성공을 확인하는 관찰되었다...

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토론

본 연구에서 우리는 미셀의 제조를위한 단순한, 신속한 필름 분산 법을 설명한다. 이 방법은, 양친 성 고분자의 자기 조립 특성을 이용한다 (예를 들어 DSPE-PEG)를 수성 환경에서 코어 - 쉘 구조의 미셀을 형성한다. 이 미셀의 제조 방법은 여러 가지 장점을 갖는다. 1. 일반적 리포좀, 나노 입자 및 nanoemulsions. 19 (2)의 제조에 사용되는 (예를 들면 압출 또는 균질화 같은) 복잡한 크기 환원 단계의 사용을 피하는 간단한 제형 공정을 포함한다. 그것은 좋은 재현성을 가지고있다. 제제 최적화 확립 된 후에 우수한 뱃치 일관성을 달성 할 수있다. 프로토콜은 이러한 초음파 강도와 시간 등 제조 공정 변수의 변화에​​ 관대하다. (예 : 투석 방법이나 에멀젼 용매 증발 방법 등) 다른 방법 미셀의 제조에 사용할 수 있지만, 막 분산액방법은 더 편리하고 효율적이다. 따라서 제약 산업의 미셀의 대규모 제조에 사용하기 위해 적응 될 수있는 큰 잠재력을 갖는다. 이러한 방법의 한계는...

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공개 사항

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감사의 글

이 작업은 NIH-SC3 보조금, NSF-PREM 보조금, Hampton University Faculty Research Grant의 지원을 받았습니다. 입자 크기 분석기를 사용해 주신 Virginia Institute of Marine Science(VIMS)의 Mrs. Michele A. Cochran에게 감사드립니다. 또한 원고를 검토해 주신 Corinne R. Ramaley 여사에게도 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DSPE-PEG2KCordenpharmLP-R4-039>95%
DoxorubicinLC LaboratoriesD-4000>99%
Palmitic Acid HydrazideTCI AMERICA   P000425G>98.0%
메탄올ACROS 유기물610981000무수
메틸렌 클로라이드 낚시꾼 D151-499.90
%메틸 설폭사이드-d6ACROS 유기물AC320760075NMR 용매
트리플루오로아세트산 ACROS OrganicsAC29381100099.50%
실리카 겔FISHER L-7446230-400 메시
베이커 플렉스 TLC 플레이트FISHER 
NC9990129 DPBS시그마-알드리치D8537
DU 145  전립선 암 세포ATCCHTB-81
MTTACROS 유기물15899005098%
RPMI 1640 매체MEDIATECH INC 10041CV
항생제-항진균제 라이프 테크놀로지스 15240062100x 스톡 솔루션
태아 소 세럼LIFE TECHNOLOGIES 
핵 자기 공명 분광법Varian, Inc300 NMR 
Bü chi R-3 RotavaporBuchi1103022V1 회전 증발기
초음파 욕조BRANSON ULTRASONICS CORPORATION 
UV-VIS 분광계 Biomate 3Thermo Spectronic
Zetasizer Nano ZS90 Malvern Instruments입자 크기 분석기
마이크로플레이트 분광광도계 Rio-Rad벤치마크 플러스 
세포 배양 인큐베이터NapcoCO2 6000
생물학적 안전 캐비닛Nuaire
SigmaPlot 시스타트 소프트웨어, Inc.분석 소프트웨어
96-웰 세포 배양 플레이트Becton Dickinson353072
Trypsin  0.25%Corning Cellgro25-053-CI
10437077CPX952318R

참고문헌

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