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방법 논문

에 Microengineered 인간의 장내 융모와 생활 마이크로 바이 옴의 공동 문화 창자 - 온 - 어 - 칩 미세 유체 장치

22.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54344

⸱

2016년 8월 30일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, The University of Texas at Austin, 2Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering at Harvard University, 3Vascular Biology Program, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 4John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University

이 논문에서

요약

우리는 인간의 장 - 온 - 어 - 칩 microphysiological 시스템을 사용하여 확장 된 기간 동안 체외 프로토콜 공동 문화 장내 마이크로 바이 옴과 장 융모에 대해 설명합니다.

초록

여기서는 인간 소화관 온 칩 microphysiological 장치 microengineered 장내 융모와 멀티 종 장기적 공 배양 인간 소화관 마이크로 바이을 수행하는 프로토콜을 기술한다. 우리는 생리 기계적 변형 및 유체 전단 흐름이 지속적으로 연동 운동을 모방 적용되는 미세 유체 장치에서 장 루멘 - 모세관 조직 인터페이스를 요점을 되풀이. 루멘 마이크로 채널에서, 인간의 장내 상피 카코이 세포는 '무균'융모 상피 세포를 형성하고 소장 융모를 재생하는 배양. 전 배양 된 미생물 세포 호스트 미생물 생태계를 확립 내강 측에 접종한다. 미생물 세포가 융모의 선 단면에 부착 한 후, 유체 유동 및 기계적 변형은 정상 상태의 신선한 배지 끊임없이 공급되는 미세 언 바운드 박테리아 (뿐만 아니라 박테리아 폐기물) 연속 제거를 생성 재개된다. 확장 공 배양 후 F주에 ROM 일 여러 microcolonies 임의로 융모 사이에 위치한 것으로 밝혀졌다, 미생물 및 상피 세포 모두 배양 최소 1 주일 동안 생존과 기능을 유지. 더불어 배양 프로토콜은 건강과 질환 조율 인간 마이크로 바이 역할의 시험 관내 연구를 용이하게 할 수있다 각종 인간 장기에서 발견 될 수있는 다른 호스트 마이크로 바이 생태계에 대한 다목적 플랫폼을 제공하도록 구성 될 수있다.

서론

인간의 장내 미생물 종의 놀랄만큼 다양한 배열 (<1,000 종)과 엄청난 미생물 세포의 수 (인간 숙주 세포보다 10 배 이상) 유전자 (인간 게놈보다 100 배 이상) 1 항구. 이러한 인간 microbiomes은 영양소 및 대사 생체 이물질 면역 반응을 조절하고, 2 장 항상성 유지에 중요한 역할을한다. 당연히 이러한 다양한 기능 제공, 공생 장내 마이크로 바이 옴은 광범위하게 건강과 질병 (3)을 변조한다. 따라서, 장내 마이크로 바이 옴 및 호스트 - 미생물 상호 작용의 역할을 이해하는 위장관 (GI) 건강 증진 및 장 질환 4에 대한 새로운 치료제를 탐험하기 위해 매우 중요하다. 그러나, 시험 관내 장 모델 (예, 정적 인 배양)에 존재하는 시간의 짧은 기간 (<1 일) 균체 자라다 장내 장벽을 손상하기 때문에 호스트 마이크로 바이에 공 배양을 제한기능 5. 대리 동물 모델 (예를 들어, 무균 6 유전자 조작 생쥐 7)도 일반적으로 식민지와 인간의 장내 마이크로 바이 옴의 안정 유지가 어렵 기 때문에 호스트 장내 마이크로 바이 옴 크로스 토크를 연구하는 데 사용되지 않습니다.

이러한 문제를 극복하기 위해, 최근 살아있는 인간 대장 5,8- 발생 호스트 장내 마이크로 바이 상호 작용을 에뮬레이트하기 위해 "거트 온 칩"microphysiological 시스템 (좌도 1a) 생체 모방 인간을 개발 하였다. 창자 - 온 - 어 - 칩 마이크로 디바이스는 유연성, 다공성, 세포 외 기질 (ECM) 인간의 장내 상피 카코이 세포에 의해 줄 지어 코팅 된 막, 장 루멘 - 모세관 조직 인터페이스 (그림 1A을 흉내 낸에 의해 분리 된 두 개의 평행 한 미세 유체 채널을 포함 , 오른쪽) 9. 진공 중심의 순환 리듬 변형은 일반적으로 induc 변경을 모방 생리 기계적 변형을 유도(오른쪽 그림 1A) 연동 운동에 의해 에드. 흥미롭게도, 카코 -2 세포는 100 개 이상의 시간 동안 소화관 온 칩에서 성장 될 때, 자발적 단단히 접합, 정점 브러시 테두리 기저 지하실에 한정되는 증식 성 세포를 3 차원 (3D) 장내 융모를 형성 점액 생산 증가 약물 대사 활동 (예를 들어, 시토크롬 P450 3A4, CYP3A4), 향상된 글루코스 재 흡수 8. 이 '무균'미세 환경에서, 프로 바이오 틱 유산균 rhamnosus의 GG 또는 최대 2 주 5,10에 대한 호스트 상피 세포와 바이오 틱 박테리아 혼합물의 치료 형성하는 공동 문화 수 있었다.

본 연구에서는 장기간 장내 온칩 장치 호스트 장내 마이크로 바이 공동 배양을 수행하는 상세한 프로토콜을 설명한다. 또한, 우리는 중요한 문제와 잠재적 인 문제를 논의하는 것은이 호스트 마이크로 바이 옴 공동 문화 (p)의 폭 넓은 응용 프로그램에 대해 고려해야 할rotocol.

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프로토콜

창자 - 온 - 어 - 칩 장치 1. 마이크로

주 : 창자 - 온 - 칩은 플렉시블 의해 분리 된 두 개의 평행 한 미소 유로 (1mm 폭 × 150 μm의 높이 X 1cm 길이)를 포함하는 투명 가스 투과성 실리콘 중합체 (폴리 디메틸 실록산, PDMS)로 이루어지는 미세 유체 소자이며 기공 (세공 직경 10 ㎛의 간격, 공극 25 μm의 세공을 위해) 막을 PDMS 5,9. 제공되는 단계에 따라 창자 - 온 - 어 - 칩 (왼쪽 그림 1A)를 제작.

  1. 창자 - 온 - 어 - 칩 5,9의 미세 절차.
    1. PDMS의 예비 중합체와 경화제를 혼합하여 경화되지 탈기 PDMS 준비 (15 w / w 1), 30 분 동안 진공 건조기에 배치.
    2. 30g 각각 SU-8 위의 기반 미세 패턴과 장 - 온 - 어 - 칩의 낮은 마이크로있는 각 실리콘 몰드 상에 미 경화, 탈기 PDMS의 3g을 따르십시오. 이어서 L에 대한 건조 오븐에서 60 ℃에서 경화동쪽 4 시간.
    3. 수술 용 메스를 이용하여 주변 에지 절단에 의해 각 실리콘 주형으로부터 상하부 PDMS 층 탈형. 조직 검사 구멍을 뚫는 (구멍 직경 2.0 mm)를 사용하여 6 홀 (두 개의 입구, 두 개의 출구, 2 개의 진공 챔버)를 펀치.
    4. w 1 : 평면과 중첩 원형 기둥 (직경 10 μm의 높이가 25 μm의) 포스트 어레이를 포함하는 실란 화 된 실리콘 웨이퍼 상에 경화되지 않은 탈기 PDMS의 10g을 주입하여 다공성 막을 제조, PDMS 지지층 (15 실란 화 / w; 1cm 두께). 설정에 3kg 중량 누름을 넣고 12 시간 이상 60 ℃에서 폴리머를 경화.
    5. 신중 웨이퍼로부터 슬래브의 모서리를 들어 올려, 다공질 PDMS 막을 완전히 웨이퍼로부터 분리 될 때까지 박리하여 실리콘 웨이퍼의 PDMS지지 슬래브에 부착 다공성 PDMS 막의 설정 탈형.
    6. 는 PL 및 공막 측 : 상위 계층의 채널 사이드 (1, w / w PDMS 15) 폭로ASMA은 각각 1 분, 3 초를위한 휴대용 코로나 treater에 의해 생성.
    7. 기포없이 병렬로 각 조각을 배치하여 등각 접촉 다공질 PDMS 막의 상부 미세 층의 플라즈마 처리 한 표면에 놓는다.
    8. 두 PDMS 층의 비가 역적 결합 80 ° CO / N에서 전체 설치를 품어.
    9. 주의 지지층의 모서리를 들어 올려, 상기 지지층을 완전히 막과 상층으로부터 분리 될 때까지 박리하여 다공성 막과 상층의 어셈블리에서 PDMS 지지층 벗겨.
    10. 중공 진공 챔버를 만들기 위해 미세한 팁 핀셋을 이용하여 진공 챔버 (메인 채널의 양쪽에 위치하는 두 챔버) 위에 위치하고이 멤브레인의 일부를 절취.
    11. 내가 설명 된대로 상단 부분과 같은 방법으로 플라즈마에 낮은 조각에 새겨진 채널 측면에 부착 된 막으로면을 노출n은 1 분간 1.1.6 단계.
    12. 입체경 하에서 기포없이 병렬로 각 조각을 배치함으로써 균일 한 접촉 다공성 멤브레인 미세 상부 층과 하부 층을 맞추고.
    13. 미세 유체 채널 셀에 다음의 두 중공 진공 챔버를 포함하는 완전한 규모 창자 - 온 - 칩 마이크로 유체 소자를 제작하기 위해 80 ° CO / N에서 건조 오븐에서 온 설정을 치료.
  2. 90 ° 굴곡 스테인레스 스틸 무딘 엔드 바늘을 통해 장 - 온 - 어 - 칩의 상부 또는 하부 마이크로 채널에 연결된 각 포트의 입구와 출구에 튜브를 연결합니다.
  3. 90 ° 절곡 스테인리스 평활 말단 바늘을 이용하여 상기 진공 챔버에 연결되는 구멍에 튜브를 연결한다.
  4. 일회용 주사기를 소독 1 ml에 사용 70 % (v / v)의 에탄올을 흐르는하여 마이크로 및 튜브를 소독.
  5. 60 ° C 건조 오븐 O / N에서 마이크로 및 튜브를 건조.

마이크로 엔진 2. 성장창자 - 온 - 어 - 칩 장치에 겹 장내 융모

  1. 창자 - 온 - 어 - 칩 마이크로 디바이스의 5,9에 씨앗 장내 상피 세포 (예 : 카코 2BBE).
    1. 70 %와 60 ℃ 건조 오븐 O에서 건조시켜 1 ㎖의 멸균 일회용 주사기를 사용하는 (V / V) 에탄올 (단계 1.4 참조) 장치를 소독 / N은 ​​표면 활성화하기 전에 (단계 150 참조).
    2. 창자 - 온 - 어 - 칩 마이크로 시스템의 전체 설정을 노출 (즉,의 몸 장 - 온 - 어 - 칩 튜브에 연결) 동시에 40 분 동안 자외선 (253.7 ㎚) 및 오존.
    3. 바이오 안전성 캐비닛 (BSC)에 UV 빛 아래 15 분 동안 실온에서 장치를 냉각.
    4. 일회용을 사용하여 두 상하 미세로 - I 콜라겐를 50㎍ / ㎖의 유형 및 혈청이없는 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)로 희석하고 300 μg의 / ml의 세포 외 기질 혼합물의 혼합 용액 - 전자 재료 피막의 100 μl를 소개 멸균 1 ML의 주사기.
    5. Incuba37 ° C에서 전체 셋업 테 1 시간 동안 5 % CO 2 인큐베이터 가습.
    6. 드가 예열 ​​된 (37 ℃)에서 완전 배양 배지 (DMEM, 20 % V / V, 소 태아 혈청 (FBS), 100 유닛 / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 50 ㎖, 3 ㎖의 분취 1 분 동안 BSC 50 ㎖의 여과 시스템 (기공 크기 0.45 μm의)을 이용하여 일회용 주사기).
      1. 여과 시스템을 통해 사전 예열 매체에 합격 한 분은 중간에있는 거품 또는 용해 가스를 제거하기위한 여과 매체에 부드럽게 누릅니다.
    7. 37 ° C에서 3 ㎖ 일회용 주사기에 탈기 완전한 매체의 나누어지는을 놓고 품어 1 시간 동안 5 % CO 2 배양기를 가습.
    8. 상부 및 하부 마이크로에,이 3 ㎖ 일회용 주사기가 탈기 함유 미리 예열 전체 문화 매체를 연결합니다.
    9. 체적에서 주사기 펌프를 사용하여 상부에 마이크로 탈기 전체 세포 배양 배지 흐름37 ° C에서 (0.02 다인 / ㎠의 전단 응력에 상당) 30 μL / hr의 유량은 O / N, 5 % CO 2 인큐베이터 가습.
  2. 창자 - 온 - 어 - 칩 Microengineered 카코 2 융모의 형성.
    1. 50과 65 사이의 통로 번호 카코 2BBE 세포를 사용합니다.
    2. 37 ° C에서 완전 배양 배지를 함유하는 T75 플라스크에 카코 -2 세포 성장이 완전히 융합 세포를 수득 4-5 일 동안 5 % CO 2 인큐베이터 가습.
    3. 완전히 T75 플라스크에 성장 합류 카코 2 셀, 다음, 세포를 씻어 PBS를 대기음하는 PBS - 무료 2 + 칼슘과 마그네슘의 10 ML을 추가합니다. 두 번이 단계를 반복합니다.
    4. 37 ° C에서 0.05 % 트립신 / EDTA 용액 1 ㎖를 추가하고 품어 5 분 동안 5 % CO 2 배양기를 가습.
    5. 로 pipetting 의해 3~5 배 하 (FBS)와 예열 된 전체 세포 배양 배지 10 mL로 해리 된 세포를 재현 탁.
    6. C로 세포 현탁액을 스핀5 분 500 XG에 entrifugation 후 상등액을 제거합니다.
    7. 다시 1 ml의 장치에서 ~ 1.5 × 10 5 세포 / cm 2의 세포 밀도를 조정하는 완전 배지를 미리 예열을 Resuspend. 세포 밀도를 추정 혈구를 사용한다.
    8. 상부에 연결된 마이크로 튜브의 출구에 25 G5 / 8 바늘에 부착 된 1 ㎖의 일회용 주사기를 위치시킴으로써 상부 마이크로 (내강 측)에 재현 탁하고, 카코 -2 세포 100 μl를 주입.
    9. 바인더 클립을 사용하여 상부 및 하부 마이크로 채널에 연결된 모든 입구와 튜브의 출구를 조인다.
    10. 1 시간 동안 37 ° C, 가습 5 % CO 2 배양기에서 전체 설치를 품어 다공성 막 표면에 부착 카코 2 세포를 해리 허용합니다.
    11. 클램프를 제거하고 세포를 24-36 시간 동안 온전한 단일 층을 형성 할 때까지 주사기 펌프를 사용하여 30 μL / 시간 상부 마이크로에 배양액의 흐름을 재개. 위상 콘트라을 사용하여t 또는 미분 간섭 대비 (DIC) 현미경은 세포 단층의 세포 - 세포 접합을 확인합니다.
    12. 세포 단일 층을 형성 할 때, 30 μL / hr의 동일한 유량의 두 상부 (루멘)로 배지 낮은 모세관을 미세 관류.
    13. 연동 운동과 같은 운동 5,9을 흉내 낸 기계적인 변형의 응용 프로그램입니다.
      1. 인장 장비를 갖춘 진공 펌프를 켭니다.
      2. 스테인레스 스틸 튜브 커넥터를 통해 진공 컨트롤러에 진공 챔버를 연결한다.
      3. 진공 제어 소프트웨어에 대한주기적인 사인 함수 모드 0.15 Hz의 주파수에서 10 %의 평균 세포주의 스트레칭 운동을 설정 한 다음 "시작"을 클릭합니다.
    14. ~ 100 시간 동안 기계적 변형 하에서 합류 카코 -2 단층을 모두 상단 및 하단의 마이크로 배양액의 일정한 흐름 (30 μL / 시간) (10 %, 0.15 Hz로)를 유지한다.
      참고 : 카코 2 세포가 spontaneously 상피 마이크로 5,8-10의 루멘으로 확장 파상 3D 돌기 융모 형태 형성을 겪는다.
  3. , 창자 - 온 - 어 - 칩 (10)의 루멘 - 모세관 조직 인터페이스 살아있는 인간의 소장의 기관 수준의 기능을 모방 한 바와 같이 단계를 수행하십시오.
    1. 2.1에서 2.2 단계를 반복하여 microengineered 카코 2 융모 성장.
    2. 미리 예열 공동 배양액의 흐름 (완전한 카코 -2 세포 배양 배지 전체 HMVECs 배지의 혼합물을 1 : 1 v / v)의 30 μL / 시간 상하 마이크로한다.
    3. 해리 정상적인 인간의 모세 혈관의 미세 혈관 내피 세포 100 ㎕ 소개 (HMVECs, 최종 셀 밀도를 ~ 5.0 × 10 5 세포 / cm 2) 2.2.3에서 2.2.9로 단계에 설명 된 동일한 방법으로 낮은 마이크로에.
    4. 경화 직사각형 PDMS 조각을 배치 (0.5 cm × 1 cm × 1 cm, 폭 X 길이 x 높이; 15 : 1, w/ 엘라스토머 W : 경화제) 창자 온 칩 디바이스 위에 후 거꾸로 전체 장치 설치 플립 () 즉, 상부 마이크로이 아래쪽에 대향하고, 상기 하부 마이크로은 위쪽에 직면한다.
    5. 해리 HMVECs 하부 미세 다공질 막의 표면에 부착 할 수 있도록, 1 시간 동안 37 ° C, 가습 된 5 % CO 2 인큐베이터에서 인큐베이션 설정.
    6. 이산화탄소 배양기에서 전체 설치를 꺼내, 다시 통해 설정을 뒤집습니다.
    7. 기계적 스트레칭 운동에 30 μL / 시간 모두 상하 미세으로 ((1 V / V 한 완전한 카코 -2 세포 배양 배지 전체 HMVECs 배지의 혼합물) 예열 된 공동 배양 배지 흐름 적어도 3 일 동안 10 %, 0.15 Hz로)는 내피 세포의 단층 세포 연접을 형성한다.

3. 굿 - 온 - 어 - 칩 마이크로 디바이스의 마이크로 바이 옴 공동 문화를 호스트 굿

  1. O를 사전 문화를 수행F 박테리아 세포를 microengineered 장 융모에하는 공동 문화 공생 장내 마이크로 바이 옴을 다음과 같이.
    1. 멸균 유산균 MRS 국물 강화 중간의 클로스 트리 디움 (1, V / V 1)의 혼합물 10ml에 동결 건조 생균제 세균 분말 혼합물을 재현 탁.
    2. 10 ㎖의 일회용 멸균 튜브에 분취 한 후, 균체 현탁액의 3 ㎖를 매체의 적당량을 첨가하여 (600 nm에서) 약 0.2 광학 밀도 단위로 최종 세포 밀도를 조정한다.
    3. 장소 관은 혐기성 용기에 미생물 세포를 재현 탁 함유. 컨테이너에서 혐기성 가스 발생 향 주머니의 두 팩을 추가합니다. 37 ° C에서 흔들림없이 컨테이너 설치를 단단히 용기 뚜껑을 닫고 품어 5 % CO 2 인큐베이터 O / N를 가습.
  2. 장내 상피 세포 5, 10과 마이크로 바이 옴과 공동 문화의 접종.
    1. 탈기 antibioti를 포함하는 3 ㎖ 일회용 주사기를 준비합니다C 무 세포 배양 배지 (예, 20 % FBS를 가진 DMEM). 문화 매체의 탈 절차 2.1.6를 참조하십시오.
    2. 이산화탄소 배양기에서 microengineered 융모를 포함하는 장 - 온 - 어 - 칩 디바이스의 전체 설정을 가지고, 다음 바이오 안전성 캐비닛로 이동합니다.
    3. 상부 및 하부 마이크로 채널에 연결 튜빙에 연결된 주사기를 제거합니다. 다음 이전 마이크로 바이 옴의 파종에 12 시간 동안이 항생제없는 배지 흐름, 다시 CO 2 배양기에 가져, 장치에 3.2.1에서 제조 된 주사기를 연결합니다.
    4. 5 분 동안 10,000 XG에서 미리 배양 바이오 틱 박테리아 혼합물 세포​​ (3.1 단계 참조) 스핀 다운. 진공을 이용하여 상등액 대기음 후 (~ 최종 세포 밀도가 1.0 × 107 CFU / ㎖) 항생제가없는 DMEM 배지에 재현 탁.
    5. 25에 부착 된 1 ㎖의 일회용 주사기를 사용하여 "무균"장내 융모를 함유하는 마이크로 채널의 내강 측에 세포 현탁액을 주입G5 / 8 바늘. 의 장 융모의 혀끝의 표면에 미생물 세포의 부착을 허용 ~ 모든 튜브 끝으로 클램핑하여 흐름없이 1.5 시간.
    6. 40 μL / 환상 리듬 변형과 시간 (10 %, 0.15 Hz로) 모두에서 상하로 미세 예열 항생제가없는 배지를 관류.
    7. 녹색 형광 단백질의 공 배양 (GFP)을 표지 된 E.를 들어 콜라이 (E. coli에 GFP 비 - 병원성 DH5 알파 E. 콜라이 숙주) microengineered 융모와 10,11 세포 사전 배양 GFP E. 12 시간 동안 상태 (200 RPM)를 진탕하에 37 ℃에서 멸균 LB 배지에서 대장균 세포. E. GFP의 공존 배양을 수행 3.2.5에서 3.2.6에 절차를 반복 microengineered 융모와 대장균 세포.
  3. 이미지 셀 5,8-10
    1. 미생물 및 상피 형태 5,8,10를 기록 DIC, 표면 형광 또는 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 수행합니다.
      1. DIC 이미징 들어, CO 2 배양기에서 장 - 온 - 어 - 칩 마이크로 시스템의 설정을 가지고 현미경의 무대 장치 설치를 배치 한 다음 세포 형태를 기록합니다.
      2. 융모 상피 형광 이미징의 경우, 10 분 동안 100 μL / 시간 세포를 PBS 세척을 흐른다.
        1. 4 % 15 분 (w / v)의 파라 포름 알데히드와 융모를 수정합니다. 그런 다음 10 분 동안 100 μL / 시간 세포를 PBS 세척을 흐른다.
        2. 0.3 %과 융모를 Permeabilize 하시려면 (v / v) 트리톤 X-100의 PBS 10 분간 소 혈청 알부민 (BSA) (/ V W) 2 %를 함유하는 희석. 그런 다음 10 분 동안 100 μL / 시간 세포를 PBS 세척을 흐른다.
        3. 2 %와 블록 세포를 1 시간 동안 PBS에서 BSA 용액 (/ V w). 그런 다음 10 분 동안 100 μL / 시간 세포를 PBS 세척을 흐른다.
        4. 4 300 nM의 '빛의 보호 아래 핵 염색을 위해 PBS에 희석, 6-diamidino-2-페닐 인돌 디 하이드로 클로라이드 (DAPI) 솔루션을 추가합니다.
        5. 형광 팔로이 딘의 25 단위 / ㎖ 추가빛 보호 아래 F - 굴지 염색을 위해 PBS에 용해 (Phalloidin의-CF647 접합체).
        6. 레이저 스캐닝 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 형광 염색 된 세포의 이미지를 기록.
          참고 : 25X 목적은 공 초점 현미경 동안 적절한 광학 줌으로 적용되었다. 도 3b에서, 약 525X의 배율을 사용 하였다.

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결과

시험 관내에서 인간의 장내 호스트 마이크로 바이 생태계를 에뮬레이트하기 위해, 인 필요는 연동 운동과 같은 역학과 유체 흐름과 같은 생리 학적 조건에서 장내 세균과 인간의 장내 상피 세포의 안정적인 장기 협력 문화를 재구성하는 실험 프로토콜을 개발. 여기서, 우리는 생체 모방 창자 - 온 - 칩 마이크로 디바이스를 이용 (그림 1A)를 체외에서 일주일의 기간 이상 인간 융모 생활과 직접 접촉하는 미생물 세포 생활 문화 공동합니다. 장 상피 세포는 자연적으로도 분화 융모를 형성 할 때 중요한 생리 유체 유동 및 고리 기계적 변형 (5)의 존재하에 2 채널 미세 유동 장치의 한 채널에서 다공성 ECM 피복 막의 한쪽에 배양 하였다. microengineered 융모는 인간의 소장 융모 포함 formati의 구조와 기능을 복제혀끝의 브러시 테두리로 줄 지...

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토론

호스트 마이크로 바이 옴의 상호 작용을 이해하는 것은 의학의 발전을 위해 중요하다; 균체 주로 시험 관내에서 포유 동물 세포를 자라다 때문에 플라스틱 접시 또는 정적 웰 플레이트에서 수행 기존의 세포 배양 모델 이상 1-2일 위해 장내 미생물 살아있는 인간의 장 세포의 안정적 공 배양을 지원하지 않는다. overgrowing 미생물 개체군 빠르게 연속적 심각 장 장벽 기능을 손상시키고 장내 상피 세포 사멸을 야기 대사성 폐기물 (예를 들면, 유기산)의 과잉 생산, 산소 및 영양분을 소비한다. 따라서, 영양소의 고갈을 일으키는 세균 과증식 미생물 노폐물의 축적을 방지하는 공동 배양에 미세 (주 일간) 장기간 가능한 호스트 마이크로 바이 공존 유지에 매우 중요하다.

하는 microphysiological을 이러한 문제를 극복하기 위해창자 온 - 칩 디바이스 5,8- 완전히 분화 ​​된 인간의 장내 융모를 형성하고 시험 관...

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공개 사항

Donald E. Ingber는 Emulate Inc.의 창립자이며 회사의 지분을 보유하고 있으며 과학 자문 위원회 의장을 맡고 있습니다. 다른 저자는 재무 공개가 없습니다.

감사의 글

GFP 표지된 대장균 균주를 제공해 주신 Sri Kosuri(하버드 대학교 Wyss Institute)에게 감사드립니다. 이 작업은 협력 계약 번호 W911NF-12-2-0036에 따라 국방고등연구계획국(Defense Advanced Research Projects Agency), 계약 #HHSF223201310079C에 따른 식품의약국(Food and Drug Administration), 하버드 대학의 Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering의 지원을 받았습니다. 이 문서에 포함된 견해와 결론은 저자의 견해이며 육군 연구소, 육군 연구소, 식품의약국 또는 미국 정부의 명시적이든 묵시적이든 공식 정책을 나타내는 것으로 해석되어서는 안 됩니다. 미국 정부는 본 문서에 저작권이 명시되어 있음에도 불구하고 정부 목적을 위해 재인쇄물을 복제하고 배포할 수 있는 권한이 있습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
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25 mM 포도당 및 25 mM HEPESGibco10564-01137 °C에서 예열; C 수조에서.
Difco Lactobacilli MRS 국물BD288120121 °에서 오토클레이브 실행; C 15분 동안
Poly(dimethylsiloxane)Dow Corning3097358-100415:1 (w/w), PDMS : 치료제
Caco-2BBE 인간 대장암 라인하버드 소화기 질환 센터인간 대장암 선암종 
열 비활성화 FBSGibco10082-14720%(v/v)
DMEM
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochlorideMolecular ProbesD1306핵 염색
Phalloidin-CF647 접합체(25 units/ml)비오튬00041F-액틴 염색
Flexcell FX-5000 장력 시스템Flexcell International CorporationFX5K, 연동 유사 스트레칭 모션(10% 세포 변형, 0.15Hz 주파수)
도립 형광 현미경ZeissAxio Observer Z1Imaging, DIC
스캐닝, 컨포칼 현미경LeicaDMI6000Imaging, 형광
UVO 클리너Jelight Company Inc342장 칩
유형 I 콜라겐의 표면 활성화 GibcoA10483-01칩으로 세포 배양을 위한 세포 외 매트릭스 구성 요소
MatrigelBD354234칩으로 세포 배양을 위한 세포 외 매트릭스 구성 요소
1 ml 일회용 주사기BD309628세포 및 배지 주입 재료
25 G 5/8 바늘BD329651세포 및 배지 주입 재료
사기 펌프Braintree Scientific 주식회사BS-8000칩에 주입 장비
VSL#3Sigma-Tau Pharmaceuticals7-45749-01782-68가지 다른 공생 미생물의 공식
강화 Clostridial MediumBD218081혐기성 세균 배양 매체
GasPak EZ Anaerobe 컨테이너 시스템 지시자BD260001혐기성 가스 생성 주머니 
4 % 파라 포름 알데히드전자 현미경 과학157-4-100염색을위한 세포 고정
Triton X-100Sigma-AldrichT8787세포 투과
혈청 알부민Sigma-AldrichA7030세포 염색을위한 차단제
Corona treaterElectro-Technic ProductsBD-20AC칩 제조용 플라즈마 발생기
스테리플립 MilliporeSE1M003M00완전한 배양 배지 가스 제거
수동 세포 계수용일회용 혈구계iNCYTODHC-N01
을 함유 한 Dulbecco의 DMEM (Modified Eagle Medium) DMEM 페니실린-스트렙토마이신-글루타민 Gibco 10378-016 1/100 희석에서 , , , , , 주화 소

참고문헌

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