우리는 인간의 장 - 온 - 어 - 칩 microphysiological 시스템을 사용하여 확장 된 기간 동안 체외 프로토콜 공동 문화 장내 마이크로 바이 옴과 장 융모에 대해 설명합니다.
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방법 논문
에 Microengineered 인간의 장내 융모와 생활 마이크로 바이 옴의 공동 문화 창자 - 온 - 어 - 칩 미세 유체 장치
이 논문에서
요약
초록
여기서는 인간 소화관 온 칩 microphysiological 장치 microengineered 장내 융모와 멀티 종 장기적 공 배양 인간 소화관 마이크로 바이을 수행하는 프로토콜을 기술한다. 우리는 생리 기계적 변형 및 유체 전단 흐름이 지속적으로 연동 운동을 모방 적용되는 미세 유체 장치에서 장 루멘 - 모세관 조직 인터페이스를 요점을 되풀이. 루멘 마이크로 채널에서, 인간의 장내 상피 카코이 세포는 '무균'융모 상피 세포를 형성하고 소장 융모를 재생하는 배양. 전 배양 된 미생물 세포 호스트 미생물 생태계를 확립 내강 측에 접종한다. 미생물 세포가 융모의 선 단면에 부착 한 후, 유체 유동 및 기계적 변형은 정상 상태의 신선한 배지 끊임없이 공급되는 미세 언 바운드 박테리아 (뿐만 아니라 박테리아 폐기물) 연속 제거를 생성 재개된다. 확장 공 배양 후 F주에 ROM 일 여러 microcolonies 임의로 융모 사이에 위치한 것으로 밝혀졌다, 미생물 및 상피 세포 모두 배양 최소 1 주일 동안 생존과 기능을 유지. 더불어 배양 프로토콜은 건강과 질환 조율 인간 마이크로 바이 역할의 시험 관내 연구를 용이하게 할 수있다 각종 인간 장기에서 발견 될 수있는 다른 호스트 마이크로 바이 생태계에 대한 다목적 플랫폼을 제공하도록 구성 될 수있다.
서론
인간의 장내 미생물 종의 놀랄만큼 다양한 배열 (<1,000 종)과 엄청난 미생물 세포의 수 (인간 숙주 세포보다 10 배 이상) 유전자 (인간 게놈보다 100 배 이상) 1 항구. 이러한 인간 microbiomes은 영양소 및 대사 생체 이물질 면역 반응을 조절하고, 2 장 항상성 유지에 중요한 역할을한다. 당연히 이러한 다양한 기능 제공, 공생 장내 마이크로 바이 옴은 광범위하게 건강과 질병 (3)을 변조한다. 따라서, 장내 마이크로 바이 옴 및 호스트 - 미생물 상호 작용의 역할을 이해하는 위장관 (GI) 건강 증진 및 장 질환 4에 대한 새로운 치료제를 탐험하기 위해 매우 중요하다. 그러나, 시험 관내 장 모델 (예, 정적 인 배양)에 존재하는 시간의 짧은 기간 (<1 일) 균체 자라다 장내 장벽을 손상하기 때문에 호스트 마이크로 바이에 공 배양을 제한기능 5. 대리 동물 모델 (예를 들어, 무균 6 유전자 조작 생쥐 7)도 일반적으로 식민지와 인간의 장내 마이크로 바이 옴의 안정 유지가 어렵 기 때문에 호스트 장내 마이크로 바이 옴 크로스 토크를 연구하는 데 사용....
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프로토콜
창자 - 온 - 어 - 칩 장치 1. 마이크로
주 : 창자 - 온 - 칩은 플렉시블 의해 분리 된 두 개의 평행 한 미소 유로 (1mm 폭 × 150 μm의 높이 X 1cm 길이)를 포함하는 투명 가스 투과성 실리콘 중합체 (폴리 디메틸 실록산, PDMS)로 이루어지는 미세 유체 소자이며 기공 (세공 직경 10 ㎛의 간격, 공극 25 μm의 세공을 위해) 막을 PDMS 5,9. 제공되는 단계에 따라 창자 - 온 - 어 - 칩 (왼쪽 그림 1A)를 제작.
- 창자 - 온 - 어 - 칩 5,9의 미세 절차.
- PDMS의 예비 중합체와 경화제를 혼합하여 경화되지 탈기 PDMS 준비 (15 w / w 1), 30 분 동안 진공 건조기에 배치.
- 30g 각각 SU-8 위의 기반 미세 패턴과 장 - 온 - 어 - 칩의 낮은 마이크로있는 각 실리콘 몰드 상에 미 경화, 탈기 PDMS의 3g을 따르십시오. 이어서 L에 대한 건조 오븐에서 60 ℃에서 경화동쪽 4 시간.
- 수술 용 메스를 이용하여 주변 에지 절단에 의해 각 실리콘 주형으로부터 상하부 PDMS 층 탈형. 조직 검사 구멍을 뚫는 (구멍 직경 2.0 mm)를 사용....
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결과
시험 관내에서 인간의 장내 호스트 마이크로 바이 생태계를 에뮬레이트하기 위해, 인 필요는 연동 운동과 같은 역학과 유체 흐름과 같은 생리 학적 조건에서 장내 세균과 인간의 장내 상피 세포의 안정적인 장기 협력 문화를 재구성하는 실험 프로토콜을 개발. 여기서, 우리는 생체 모방 창자 - 온 - 칩 마이크로 디바이스를 이용 (그림 1A)를 체외에서 일주일의 기간 이상 인간 융모 생활과 직접 접촉하는 미생물 세포 생활 문화 공동합니다. 장 상피 세포는 자연적으로도 분화 융모를 형성 할 때 중요한 생리 유체 유동 및 고리 기계적 변형 (5)의 존재하에 2 채널 미세 유동 장치의 한 채널에서 다공성 ECM 피복 막의 한쪽에 배양 하였다. microengineered 융모는 인간의 소장 융모 포함 formati의 구조와 기능을 복제혀끝의 브러시 테두리로 줄 지.......
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토론
호스트 마이크로 바이 옴의 상호 작용을 이해하는 것은 의학의 발전을 위해 중요하다; 균체 주로 시험 관내에서 포유 동물 세포를 자라다 때문에 플라스틱 접시 또는 정적 웰 플레이트에서 수행 기존의 세포 배양 모델 이상 1-2일 위해 장내 미생물 살아있는 인간의 장 세포의 안정적 공 배양을 지원하지 않는다. overgrowing 미생물 개체군 빠르게 연속적 심각 장 장벽 기능을 손상시키고 장내 상피 세포 사멸을 야기 대사성 폐기물 (예를 들면, 유기산)의 과잉 생산, 산소 및 영양분을 소비한다. 따라서, 영양소의 고갈을 일으키는 세균 과증식 미생물 노폐물의 축적을 방지하는 공동 배양에 미세 (주 일간) 장기간 가능한 호스트 마이크로 바이 공존 유지에 매우 중요하다.
하는 microphysiological을 이러한 문제를 극복하기 위해창자 온 - 칩 디바이스 5,8- 완전히 분화 된 인간의 장내 융모를 형성하고 시험 관.......
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공개 사항
Donald E. Ingber는 Emulate Inc.의 창립자이며 회사의 지분을 보유하고 있으며 과학 자문 위원회 의장을 맡고 있습니다. 다른 저자는 재무 공개가 없습니다.
감사의 글
GFP 표지된 대장균 균주를 제공해 주신 Sri Kosuri(하버드 대학교 Wyss Institute)에게 감사드립니다. 이 작업은 협력 계약 번호 W911NF-12-2-0036에 따라 국방고등연구계획국(Defense Advanced Research Projects Agency), 계약 #HHSF223201310079C에 따른 식품의약국(Food and Drug Administration), 하버드 대학의 Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering의 지원을 받았습니다. 이 문서에 포함된 견해와 결론은 저자의 견해이며 육군 연구소, 육군 연구소, 식품의약국 또는 미국 정부의 명시적이든 묵시적이든 공식 정책을 나타내는 것으로 해석되어서는 안 됩니다. 미국 정부는 본 문서에 저작권이 명시되어 있음에도 불구하고 정부 목적을 위해 재인쇄물을 복제하고 배포할 수 있는 권한이 있습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 25 mM 포도당 및 25 mM HEPES | Gibco | 10564-011 | 37 °C에서 예열; C 수조에서. |
| Difco Lactobacilli MRS 국물 | BD | 288120 | 121 °에서 오토클레이브 실행; C 15분 동안 |
| Poly(dimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | 15:1 (w/w), PDMS : 치료제 |
| Caco-2BBE 인간 대장암 라인 | 하버드 소화기 질환 센터 | 인간 대장암 선암종 | |
| 열 비활성화 FBS | Gibco | 10082-147 | 20%(v/v) |
| DMEM | |||
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Molecular Probes | D1306 | 핵 염색 |
| Phalloidin-CF647 접합체(25 units/ml) | 비오튬 | 00041 | F-액틴 염색 |
| Flexcell FX-5000 장력 시스템 | Flexcell International Corporation | FX5K | , 연동 유사 스트레칭 모션(10% 세포 변형, 0.15Hz 주파수) |
| 도립 형광 현미경 | Zeiss | Axio Observer Z1 | Imaging, DIC |
| 스캐닝, 컨포칼 현미경 | Leica | DMI6000 | Imaging, 형광 |
| UVO 클리너 | Jelight Company Inc | 342 | 장 칩 |
| 유형 I 콜라겐의 표면 활성화 | Gibco | A10483-01 | 칩으로 세포 배양을 위한 세포 외 매트릭스 구성 요소 |
| Matrigel | BD | 354234 | 칩으로 세포 배양을 위한 세포 외 매트릭스 구성 요소 |
| 1 ml 일회용 주사기 | BD | 309628 | 세포 및 배지 주입 재료 |
| 25 G 5/8 바늘 | BD | 329651 | 세포 및 배지 주입 재료 |
| 사기 펌프 | Braintree Scientific 주식회사 | BS-8000 | 칩에 주입 장비 |
| VSL#3 | Sigma-Tau Pharmaceuticals | 7-45749-01782-6 | 8가지 다른 공생 미생물의 공식 |
| 강화 Clostridial Medium | BD | 218081 | 혐기성 세균 배양 매체 |
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| 수동 세포 계수용 | 일회용 혈구계 | iNCYTO | DHC-N01 |
참고문헌
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
- Tremaroli, V., Backhed, F. Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism. Nature. 489
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재인쇄 및 허가
