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방법 논문

경쟁 이식은 조혈 줄기 세포의 체력을 평가하는

15.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54345

⸱

2016년 8월 31일

 , 
1INRS-Institut Armand-Frappier, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 세포 분류에 의한 줄기세포의 사전 정제 없이 조혈 줄기세포/전구 세포 기능을 연구하기 위해 경쟁력 있는 마우스 골수 이식 실험을 설정하기 위한 단계별 지침을 제공합니다.

초록

조혈모세포(HSC)의 황금 표준 정의는 방사선 조사를 받은 수혜자에게 이식되었을 때 수혜자의 수명 동안 혈액 세포 생산을 재건할 수 있는 능력을 가진 세포입니다. 이 프로토콜은 두 가지 다른 유전자형을 가진 마우스의 골수와 같은 두 가지 다른 세포 집단의 HSC 용량을 비교하기 위해 기능적 분석을 설정하는 방법과 유세포 분석으로 수용 마우스를 분석하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 표준화를 위해 셀 정렬 대신 HSC에 해당하는 방법을 사용하고 두 접근 방식의 장점과 단점에 대해 설명합니다. 또한 연속 이식, 제한 희석 분석, 귀환 분석 및 비경쟁 이식을 포함한 기본 프로토콜에 대한 다양한 변형에 대해 논의하며, 이러한 다양한 접근 방식의 장점과 선호되는 용도에 대해서도 논의합니다. 이러한 분석은 HSC 기능 연구의 핵심이며 생물학의 기본적인 HSC 내재적 측면에 대한 조사뿐만 아니라 골수 이식 및 배양에서 HSC 확장을 위한 전임상 분석 개발에도 사용할 수 있습니다.

서론

조혈 부상 방사선 및 세포 사멸을 통해 손실 된 혈액 세포의 보충을 보장하는 재생 방법이다. 이 과정은 주로 성인 골수에있는 조혈 줄기 세포 (HSC)에 의해 보장된다. 또한, 조혈 줄기 세포는자가 면역 질환, 혈액 학적 악성 종양과 immunodeficiencies 1 치료 목적을 위해 사용될 수있다. 더 잘 증식 팽창 도달 이식 후 수신자 골수 생착 할 수있는 능력을 포함하여, HSC 기능을 조절하는 메카니즘을 이해하기위한 요구가있다. 최근의 연구는 전향 적으로 약 50 % 순도 2-4로 성인 조혈 모세포와 태아의 조혈 모세포를 풍부하게 할 수있는 SLAM의 가족 CD150과 CD48 등 여러 가지 세포 표면 마커를보고 있지만, 기능 조혈 모세포의 황금 표준 측정에 대한 생체 다시 채우기 분석 유지 혈액 C를 재 구축하는 능력을 결정조사 된 호스트 (5)의 엘 생산.

생체 내 클론을 다시 채우는 분석은 처음 틸과 맥 컬록 (6)에 의해 개발 된 이후 세련되고 확장되었습니다. 원래 정의 된 조혈 모세포는자가 재생과 분화를 통해 평생 혈액 세포의 생산을 보장합니다. 조사 된받는 사람에 조혈 모세포의 전송 따라서 우리가 평가할 수 있습니다 : 다른 혈액 세포 계통의 분석을 통해 (T 림프구, B 림프구, 과립구, 단구) 및 직렬 이식을 통해 자기 갱신 능력을 차별화 할 수있는 능력. 상기 분석은 일반적으로 조혈 두 집단의 기능 및 / 또는 양의 비교를 포함하는 것, 예를 들어, 치료 또는 조혈 모세포의 유지 또는 확장에 영향을 줄 수있는 다른 요인들과 미처리 된 다른 유전자형 또는 셀 개의 마우스로부터 오는 세포 문화입니다. 기증자 키메라, 또는 전송 기증자의 조혈 모세포의 t의 기여O 혈액 세포 생산 후 세포 표면 마커 또는 수신자 또는 호스트에서 공여 세포를 구별 할 다른 방법을 이용하여 말초 혈액의 유동 세포 계측법 분석 골수에 의해 결정될 수있다. 가장 널리 사용되는 마커는 확실히 우리가 아래의 예에 대해 선택한 유전자 Ptprc 또는 CD45 백혈구 항원 (7)의 두 대립 유전자이다.

클론 다시 채우기 분석은 경쟁 또는 비 경쟁이 될 수 있습니다. 비경쟁 설정에서, 제어 및 테스트 조혈 별도받는 마우스에 전달되고, 각각의 셀 유형의 결과는 서로 독립적 일 ​​것이다. 경쟁 설정에서 테스트 및 제어 모두 조혈 모세포의 기능은 경쟁 조혈 모세포의 인구에 대해 측정된다. 여기에 설명 된 프로토콜 경쟁 설정을 사용뿐만 아니라 비경쟁 상황에 적응 될 수있다. 두 방법은 자신의 장점과 한계를 가지고, 우리는에서 자세히를 비교합니다토론. 우리는 또한 이식 된 조혈 모세포의 수의 주식을 보장하기 위해 다른 방법을 설명, 희석 분석 (LDA)을 제한함으로써 조혈 모세포의 정량 분석​​을 적용, 결과의 해석에 대한 성공 및 실패 이식 모두의 예제를 제공하는 방법에 대해 설명합니다.

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프로토콜

이 프로토콜에 설명 된 모든 절차는 기관의 동물 윤리위원회의 승인 및 동물 관리 지침에 캐나다 협의회를 수행하고있다.

주 : 멸균 / 무균 하우징 상태를 유지하기 위해 생물학적 안전 캐비넷 또는 층류 후드 안쪽 살아있는 쥐의 직접 처리를 포함하는 모든 절차를 수행. 청소 또는 소독 케이지, 억제 장치, 주택 자재, 적절하게 동물에 제공 차우와 물. 주사를위한 혈액 채취에 대해서만 멸균, 일회용 바늘을 사용합니다. 무균 기법 그래프트의 제조시 매우 중요하다.

받는 사람 마우스 1. 준비

  1. 시간이 지남에 말초 혈액 및 골수 재구성의 개별 추시 수 있도록 귀 노치 (또는 지역 동물 윤리위원회 (8)에 의해 승인 된 다른 방법)와받는 사람 마우스를 식별합니다. 이식 후 추적 관찰을 위해 마우스의 무게를. 우리(이하 25g) 7 내지 12 주 오래 된 전자받는 사람 마우스.
    참고 : 제공된 예에서, CD45.1 + CD45.2 +받는 사람 마우스 congenic B6.SJL 마우스와 C57BL / 6 마우스를 건너 집에서 사육 하였다.
  2. 조혈 활동을 파괴하는 450 방사선의 두 가지 용량으로받는 사람 쥐를 조사. 첫 번째 투여 량을 이식 전날과 이식 전에 두 번째 1-2 시간을 제공합니다.
    주 : X 선 또는 감마선 모두 해당 시설의 이용에 따라 이용 될 수있다.

도너와 경쟁 골수 세포의 제조 2

  1. 기증자 (테스트 및 제어, CD45.2의 +) 안락사와 경쟁 (CD45.1 +; B6.SJL) 자궁 경부 전위 또는 로컬 동물 윤리위원회의 승인 방법을 사용하여 다음 CO 2 질식하여 마우스.
  2. 빈 페트리 접시 또는 멸균 거즈에 활짝 열려 그 뒤로, 다리에 마우스를 놓고 난 (청소 작업 표면을 유지)생물 안전 캐비닛을 nside. 70 % 에탄올 / 30 % H와 모피 젖은 2 O (v / v)로.
  3. 수술 날 또는 날카로운 가위로 발을 잘라. 다리를 따라 피부를 열고 톱니 모양의 집게를 사용하여 피부를 멀리 당겨 잘라. 여분의 근육을 버려야.
  4. 다리 뼈 당기고 반력와 골반 뼈에 대해 가위의 블레이드를 이용하여 대퇴골 탈구. 경골을 분리하고, 슬개골에서 대퇴골과 근육과 힘줄의 나머지 비트를 제거합니다. 6 웰 조직 배양 플레이트에 2-3 ml의 무균 인산염 완충 식염수 (PBS)에 뼈를 놓는다.
  5. 멸균 PBS 5 mL로 세척하여 뼈 골수 세포를 수집한다.
    1. 집게로 부드럽게 뼈를 잡고 뼈의 한쪽 끝으로 채워진 1 ML의 주사기에 부착 된 25 G 바늘을 삽입합니다. 플런저를 누르고 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 수집합니다. 뼈의 중심이 흰색이 될 때까지 필요에 따라 반복합니다.
  6. 바늘로 통과 반복하여 세포를 해리단일 세포 현탁액을 얻었다. 거품과 과잉 힘을 피하십시오. 참고 :이 단계에서 세포 생존을 개선하기 위해 약간 더 큰 바늘 (22 G)를 사용합니다.
  7. 균일 한 세포 현탁액을 보장하고 파편과 덩어리를 제거하기 위해 70 μm의 나일론 스트레이너를 통해 세포를 전달합니다.
  8. 혈구를 사용하여 세포 계수에 대한 나누어지는을 제거합니다. 4 ℃에서 5 분 동안 200 XG에서 나머지 세포 현탁액을 원심 분리기. 멸균 PBS (108 세포 / ml)에 필요한 세포 밀도를 재조정. 얼음에 세포를 유지합니다.

3. 기증자 세포 HSC의 등가물 구축

  1. 염색 유동 세포 계측법에 대한 바닥 폴리스티렌 튜브 라운드 5 ml의에 3 × 10 6 세포 (30 μL)의 등가을 전송합니다. (2.5 μg / ML의 최종 농도를 위해 (PBS, 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA) 및 1 mM의 EDTA로 보충) 염색 완충액에 희석), 비특이적 염색을 차단 CD16 / CD32에 대해 표지 된 항체의 동일 부피를 추가한다. RT에서 5 분을 품어.
  2. 염색 버퍼에 준비 90 μL의 형광 색소 - 복합 항체 마스터 믹스를 추가 바이오틴 리니지 칵테일 (B220, CD3e, CD11b를, GR1, Ter119), SCA1, CD117, CD135, CD150. 빛으로부터 보호 된 30 분 동안 빙상에서 인큐베이션.
    참고 : 적절한 희석 항체의 각 로트에 대해 결정해야한다. 본 연구에 사용 된 희석에 대한 재료의 표를 참조하십시오.
  3. 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 4 ° C에서 5 분 동안 200 XG에서 세포, 소용돌이와 원심 분리기에 2 ml의 얼룩 버퍼를 추가합니다. 쓸어 넘겨 뜨는에 resuspend 펠렛을 가만히 따르다.
  4. 염색 버퍼에 희석하여 10 μL의 형광 색소 접합 된 스트렙 타비 딘 추가 (재료 표 참조). 빛으로부터 보호 된 20 분 동안 빙상에서 인큐베이션. 언 바운드 스트렙 타비 딘을 제거하는 단계 3.3로 씻으십시오.
  5. 적어도 6 검출기 (9) 플로우 사이토 미터를 이용하여 세포 샘플을 수집. 린의 주파수를 결정 - SCA1 + CD117 + CD135 - CD150 + 세포 (조혈 모세포 추정) 그림 2와 같이 이전에 10, 11를보고했다.
    참고 : 그 인구 내에서 기능 조혈 모세포의 주파수가 1/3과 1/5 2,12 사이에서 추정 할 수있다.
  6. (일반적으로,이 예에서 경쟁, B6.SJL CD45.1 +) 기준으로 아래의 그림 2에 설명 된대로 하나의 샘플을 사용하여, 모든 샘플 (11)에 대해 추정 HSC 등가물을 설정합니다.
    1. 다음 식을 사용하여 필요한 세포의 수를 계산한다 :
      #transplanted 조혈 모세포 /받는 사람 = 5 × 10 5 세포의 X 추정 HSC 주파수 (기준 샘플의 결정에 따라,이 수는 야생형 C57BL / 6 마우스에 대해 일반적으로 75 내지 125이다) 10-12.
      참고 :도 2에서, 샘플 A의 결과는 조혈 모세포 (139)이다.
      (다른 샘플도 2의 예를 들어 샘플 B) 총 # 이식 된 세포 = # 트랜스심은 조혈 모세포 / HSC 주파수.
      참고 :도 2에서의 샘플 B에 대해, 결과는 197,826 (또는 대략 2 × 10 5) 전체 골수 세포이다.
  7. 상기에서 얻어진 결과를 사용하여 각 시료에 대하여 그래프트 수신자 당 필요한 세포의 총 수를 계산한다.
    참고 :이 숫자는 기준 시료 (경쟁) 5 × 10 5해야한다.
    1. 받는 사람 마우스의 숫자로 단계 3.7에서 얻은 수를 곱과 주사기에 죽은 볼륨을 보상하기 위해 적어도 두 개의 추가 마우스에 대한 충분한 세포를 추가합니다.
  8. 단계 3.6에서 계산 및 멸균 PBS를 사용하여 주입 당 200 μL의 최종 볼륨을 조정으로 1 HSC 동등한 비율 (예를 들어, CD45.1 +) 선수와 1 시험 셀 (CD45.2의 +)를 섞는다.
    주 : 다섯받는 마우스의 그룹 제안 볼륨 따라서 3.5 × 106 경쟁 골수 세포를 포함하는 적어도 1.4 ㎖, 수 (또는 것이기도 2의 973 샘플 A)에 대한 추정 된 조혈 모세포 및 시험 셀의 등가 수는 (도 2에서의 샘플 B에 대한 당량) 197826 365 = 1,384,782 골수 세포 일 것이다.

4. 골수 이식

  1. 혈관의 팽창을 보장하고 측면 꼬리 정맥 자세히 볼 수 있도록 적색 가열 램프와 단계 1.2 조사받는 마우스 워밍업.
  2. 27 G 바늘 (이하)가 장착 된 1 ML의 투베르쿨린 주사기를 준비합니다. 대기음 (3받는 마우스 대) 준비한 세포 현탁액 750 μL. 주사기에 기포가 없는지 확인합니다.
  3. 금지 장치에 마우스를 넣습니다. 꼬리를 검사하고 꼬리의 양쪽에 명확하게 볼 수 있어야 측면 꼬리 정맥을 찾습니다. 에탄올 주사 부위를 닦아주십시오. 최대 베벨 바늘을 삽입 피부에 평행 부드럽게 플런저를 누릅니다. 주입이 용이해야한다. 힘 재이면quired는, 바늘이 혈관에 있지 않습니다.
    참고 : 이전 마우스는 정맥을 더욱 어렵게 발견 할 수 있습니다 두꺼운 피부를 가지고있다. 바늘이 혈관에없는 경우, 초기 주입 부위에 바늘을 다시 삽입 근위.
  4. 바늘을 제거하고 출혈을 멈추게하기 위해 몇 초간 멸균 거즈로 주사 부위를 누르십시오. 깨끗한 케이지에 마우스를 전송합니다.
    참고 : 바늘이 너무 무딘 될 수있는 후 3 주사, 동일한 주사기와 바늘을 사용합니다.
  5. 이식 후 후속 처리를 위해, 제 5 일 동안 마우스를 재수 멸균 PBS 1 ml를 피하 주사. (; 옵션 필요한 경우) 감염을 방지하기 위해 마시는 물에 항생제를 추가합니다. 제 3 주 동안 매 2 ~ 3 일 마우스 체중 이상 15~20% 그들의 미리 이식 체중 손실 (또는 로컬 동물 윤리위원회에 의해 결정) 한 마우스를 안락사.

주변 혈액 5. 분석

  1. 혈액 한 방울을 수집 (Approx. EDTA 튜브에 50 ~ 100 μL).
    1. 하악 정맥에서 혈액을 수집하려면, 턱뼈 아래에있는 털이 지점 근처에 얼굴 피부를 관통하고 피 (13)의 드롭을받을 수집 관을 배치 란셋 또는 22 G 바늘을 사용합니다. 멀티 혈통의 재구성을 따라 이식 후 4, 8, 12, 16 주에 혈액을 수집합니다.
  2. 단계 5.1.1에서 수집 된 혈액의 드롭에 1 ml의 갓 준비 RT 적혈구 용해 버퍼 (9 부 0.16 M NH 4 CL + 1 일부 0.17 M 트리스 - 염산의 pH 7.65)를 추가합니다. 5 ml의 유동 세포 계측법에 적합한 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브를 혼합 및 전송 샘플. 실온에서 4 분 동안 서 보자.
  3. 얼음처럼 차가운 PBS의 4 볼륨을 추가합니다. 엔드 - 투 - 엔드를 돌려 혼합하고 얼음에 즉시 전송합니다. 4 ° C에서 200 XG에 원심 분리기 10 분.
  4. 쓸어 넘겨 뜨는에 resuspend 펠렛을 가만히 따르다. 상층 액을 명확하고 빨간색이어야한다. 간단히 버퍼와 소용돌이를 염색 2 ML을 추가합니다. 200 XGA 원심 분리기 5 분t 4 ° C를.
  5. 쓸어 넘겨 뜨는에 resuspend 펠렛을 가만히 따르다.
  6. CD45.1, CD45.2, CD3e, CD19, GR1 : 단계 3.3-3.1에 ​​설명 된 일반 프로토콜을 사용하여 염색 유동 세포 계측법 다음과 같은 마스터 믹스에 대한 항체를 진행합니다.
  7. 적어도 6 검출기 (9) 플로우 사이토 미터를 이용하여 세포 샘플을 수집. 그림 3에서 제공하는 분석 템플릿을 사용하여 각 샘플의 각 계통 (CD19 + B 림프구, CD3e + T 림프구, GR1 밝은 과립구) 및 10, 11을 발표 같은 기증자 유래 세포의 주파수를 결정합니다.

골수에서 재구성 6. 분석

  1. 섹션 2. 얼룩의 마스터 믹스 단계 3.3-3.1에 ​​설명 된 일반 프로토콜을 사용하여 유동 세포 계측법 분석을위한 세포 다음과 같은 항체를 설명하는대로 골수 세포를 수집 리니지 칵테일, SCA1, CD117, CD135, CD150, CD45.1 , CD45.2. 린 감지단계 3.4에 기술 된 바와 같이, 형광 접합 된 스트렙 타비 딘을 사용하여 eage 칵테일 항체.
  2. 적어도 8 검출기 (9) 플로우 사이토 미터를 이용하여 세포 샘플을 수집. 여섯 명 밖에 사용할 수있는 경우 CD135 + 세포가 제외되는 바와 같이, 혈통 패널과 동일한 채널에 CD135을 추가합니다. 기증자 파생 린의 주파수를 결정 - SCA1 + CD117 + CD135 - 그림 4와 10을 발표 제공 분석 템플릿을 사용하여 각 샘플에서 CD150 + 조혈 모세포.

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결과

(이하에서 논의 됨) 이차 이식을 포함하는 경쟁 이식 환경의 일반적인 설명은도 1에서 볼 수있다. 이식 전 골수 조혈하는 대표적인 분석은도 2에서 확인할 수있다.보다 상세한 정보를 이중선의 배제와 죽은 세포는 다른 9 찾을 수있다.

도 3 및도 4는 각각의 말초 혈액 및 골수 분석 유세포 템플릿의 예를 제공하는 도면. 이는 일부 호스트 T 림프구를 검출하는 정상 (모든 T 세포의 20 %까지,도 3b), T 세포가 다수의 무선 내성 같다. 경쟁자 유래 세포는 세 가지 계통에 존재해야한다. 검출 한계는 분석 취득한 총 셀의 개수에 많...

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토론

여기에 설명 된 프로토콜은 알려진 경쟁 조혈 모세포에 대한 기증자 (테스트) 조혈 모세포의 상대적 적합성을 평가하기 위해 설계되었습니다. 경쟁 상황 (줄기 세포 니스 완만 저하를 검출 할 가능성) 분석의 상대 감도를 높이고 조사 주입의 효능에 대한 내부 기술적 인 제어를 제공한다. 그러나, HSC 적당의 절대 측정으로서 사용되어서는 안된다; 경쟁 재구성 감소 자동 조혈 경쟁의 부재 하에서도 수행하지 않을 것을 의미하는 것은 아니다. 이 경쟁 설정 나은 시작점 참가자 세포 생존 할 결함 HSC 기능 및 모든 수신자 마우스 구출 같이,라고 주장 될 수 있지만, 하나는 결과의 해석에주의해야한다. 비 경쟁 환경에서 결과를 확인하는 것은 결론을 공고히 할 것이다.

여기에 제시된 실험 설계는 HSC 상당의 한때를 사용전체 골수 세포의 antities 대신 -sorted 조혈 유세포 순수한 집단. 다른 기증자 사이의 변동성을 제거하고 표현형 HSC 주파수의 변화가 HSC 기능 (...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

우리는 절차의 그림 디자인 및 데모와 지원을 Roxann Hétu - 아버에 감사하고 있습니다. 실험실에서 연구가 콜 재단에서 전환 수상에 의해 지원되었다, 검색없이 부여합니다. 자연 과학 및 캐나다 (NSERC)의 공학 연구 협의회 및 혁신에 대한 캐나다 재단 (CFI 지도자 기금 없음. 31377 부여) 419226-2012. 상테 (FRQS) - KMH는 퐁 드 공들인 뒤 퀘벡에 대한 Chercheur - Boursier 주니어입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
K2EDTABD Biosciences365974
20 G 바늘BD 주사기하악 정맥에서 혈액 샘플링을 위한
LabQuake Shaker 로티세리Thermo  과학C415110
정제 안티 마우스 CD16 / CD32 (클론 2.4G2, Fc 블록)BD Biosciences5531422.50 μ g/ml
Pe-Cy7-conjugated anti-mouse CD3e (클론 145-2C11)eBioscience25-00310.25 μ g/ml
PE 결합 안티 마우스 CD19 (클론 1D3)eBioscience12-01930.25 μ g/ml
APC-eFluor780 (APC-Cy7 등가물)-공액 안티-마우스 GR1 (클론 RB6-8C5)eBioscience47-59310.25 μ g/ml
FITC-conjugate anti-mouse CD45.1 (클론 A20)eBioscience11-04532.50 μ g/ml
eFluor450-conjugated anti-mouse CD45.2 (클론 104)eBioscience48-04541.00 μ g/ml
비오틴화 항인간/마우스 CD45R (B220) (클론 RA3-6B2)eBioscience13-04521.25 μ g/ml
바이오틴화 안티-마우스 CD3e (클론 145-2C11)eBioscience13-00311.25 μ g/ml
비오틴화 안티-마우스 CD11b (클론 M1/70)eBioscience13-01121.25 μ g/ml
비오틴화 안티-마우스 GR1 (클론 RB6-8C5)eBioscience13-59311.25 μ g/ml
비오틴화 안티 마우스 TER119 (클론 TER119)eBioscience13-59210.625 μ g/ml
V500 스트렙타비딘BD 생명과학561490.5 & g/ml
PE 활용 안티 마우스 CD117 (클론 2B8)BD Biosciences5533550.25 μ g/ml
PE-Cy7-conjugated anti-mouse Ly6A/E (Sca1) (클론 D7)BD Biosciences5581620.25 μ g/ml
PerCP-eFluor710-conjugated anti-mouse CD135 (클론 A2F10)eBioscience46-13510.5 μ g/ml
Alexa fluor 647-conjugated anti-mouse CD150 (클론 TC15-12F12.2)Biolegend115918 0.625 μ g/ml BD Biosciences 및 eBioscience는 동일한 클론
1 ml 투베르쿨린 주사기와 27 G 바늘BD 주사기309623
1 ml 투베르쿨린 주사기와 25 G 바늘BD 주사기309626
70 μ m 셀 여과기BD 팔콘352350
가 포함된 마이크로테이너 튜브

참고문헌

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