세포 - 세포 연락이없는 두 세포 유형의 삽입 공동 배양 시스템 개발

요약

다세포 유기체에서 분비된 용해성 인자는 부분비 신호의 결과로 다른 세포 유형으로부터 반응을 이끌어냅니다. Insert co-culture 시스템은 세포-세포 접촉이 없을 때 분비된 용해성 인자에 의해 매개되는 변화를 평가하는 간단한 방법을 제공합니다.

초록

세포 반응의 변형에서 분비된 용해성 인자의 역할은 모든 조직과 시스템에 대한 연구에서 반복되는 주제입니다. 다세포 유기체를 구성하는 여러 세포 아형 간의 매우 복잡한 관계를 간단하게 하기 위한 시도로, 연구자들이 단일 세포 집단에 대한 자세한 이해를 얻을 수 있도록 체외 기술이 개발되었습니다. 이러한 기술 중 하나는 분비된 용해성 인자를 확산시킬 수 있는 투과성 멤브레인이 있는 삽입물을 사용하는 것입니다. 따라서, 삽입물에서 성장한 세포 집단은 세포-세포 접촉이 없는 상태에서 부분비 신호전달에 따른 세포 변화를 평가하기 위해 다른 세포 유형을 포함하는 웰 또는 접시에서 공동 배양할 수 있습니다. 이러한 인서트 공동 배양 시스템은 다른 공동 배양 기술에 비해 양방향 신호전달, 보존된 세포 극성 및 세포 변화의 집단별 검출과 같은 다양한 이점을 제공합니다. 염증, 암, 혈관 신생 및 분화 분야에서 활용되는 것 외에도 이러한 공동 배양 시스템은 특히 신경 염증의 맥락에서 중추 신경계에 존재하는 다양한 세포 아형 사이에 존재하는 복잡한 관계를 연구하는 데 가장 중요합니다. 이 논문은 삽입 공동 배양 시스템을 사용하여 분비된 용해성 인자에 의해 매개되는 세포 변화를 평가하기 위한 실험을 설정하기 위한 일반적인 방법론적 지침을 제공합니다. 또한, 리포다당류 활성화 N9 미세아교세포가 뉴런 PC12 세포에 미치는 사이토카인의 신경염증 효과를 측정하기 위한 구체적인 프로토콜에 대해 자세히 설명하여 삽입 공동 배양 방법론에 대한 구체적인 이해를 제공합니다.

서론

시험관 내에서 조직, 기관 또는 시스템의 연구는 다세포 유기체를 포함하는 여러 세포 아형 사이에 존재하는 매우 복잡한 관계를 단순화하기위한 시도이다. 실제로, 시험 관내 연구는 가능한 하나의 세포 집단에 대한 자세한 이해를 취득 할 수 있습니다. 1) 쉽게 휴대 환경을 조작 할 수 2) 능력 세포 상호 작용을 감소하고, : 시험 관내 실험에서 수행의 두 가지 장점이 있습니다. 따라서, 이러한 두 가지 장점이 허용 한 연구진은 전체 유기체 외부 영향의 결과를 조절하는 능력에 이르는, 생체 내에서 특정한 유형의 세포의 행동을 예측한다. 그런 의미에서, 체외 세포 배양은 종종 기초 및 응용 생명 과학을 연결하는 다리로 작동합니다. 그럼에도 불구하고, 시험 관내에서 작동하는 여러 단점도 있는데, 가장 중요한 특정 예약 생리적으로 거하여되는 것을관찰 된 표현형의 알 관련성. 실제로, 하나의 세포 유형은 용기에서 배양하면, 배양은 다양한 범위까지 상실, 다른 세포 유형, 조직과 기원의 유기체 및 앵커 내에서 체액 환경에 기여와의 세포 간 연결 이를 활성화 조직 세포 기능에 중요한 때로 특정 입체 구조를 유지한다.

세포 간 관계의 문제가 혼합 된 배양 기술의 개발에 의해 해결되었다. 이 방법에서, 두 개 이상 세포 집단은 동일한 배양 용기에서 함께 성장시킨다. 그러나 이러한 혼합 문화는 중요한 불편을 부담. 한편, 일부 세포 아형 물리적 기원 조직으로 서로 상호 작용하지 않는 분비 가용성 인자 수용체 근처로 유지 분비 통신에만 의존. 이것은 근위 사이토 카인 신호에 따라 여러 가지 염증 과정의 경우입니다. 혼합 C에서ultures 물리적 상호 작용을 피할 수 있고 불가능 변경된 결과를 얻을 수있는 세포 - 세포 접촉의 부재 분비 통신 연구를 만든다. 한편, 혼합 집단 내에서 세포의 특정 해석을 달성하기 위해서는 상당히 결과에 미치는 영향을 거친 분리 기술의 사용없이 실행할 수 없게된다.

이러한 중요한 문제를 해결하기 위해, 조정 배지를 사용 실형 문화 분비 신호 전달 연구를 허용하는 기술이 개발되고있다. 이 방법은 세포의 다른 집단을 함유 한 웰 세포 유형, 따라서 에어컨 명명 된 배지 상등액의 전송을 요구한다. 그러나 중요한 단점은 단명 한 분자가 셀의 두번째 집단의 웰에 전송되는 조정 된 배지에서 충분히 생존하지 않는다는 것이다. 심지어 수명이 긴 분자는 크게 인해 확산에 시간이 지남에 희석됩니다. 또한, 두 세포인구는 단방향 통신 분비보다는 활성 쌍방향 통신에 참여한다. 이것은 그들이 체내에 존재하는 정확한 다세포 관계를 재현에서 중요한 피드백 신호의 부재로 이끈다.

결과적으로 더 나은 관내 셀룰러 환경에서의 생체 내 조건에서 일본어를 시뮬레이션 할 필요성에 의해 구동 세포 배양 기술의 여러 발전은 수년 동안 실현되어왔다. 가장 중요한 발전 중 하나는 1953 년 Grobstein 의해 처음 사용 된 세포 배양을 구획화를위한 미세 다공성 막과 투과성 지지체의 사용이었다 ^1. 이러한 투과성 지지체는 다수의 세포 유형을 수용하고 사용하기 년간 맞추어왔다 여러 가지 응용 프로그램입니다. 현재, 이러한 지원은 멀티 웰 조직 배양 접시에서 또는 새로운 Circu에 우물에서 휴식을 설계 속이 빈 삽입 존재LAR 요리. 공동 배양 시스템에서, 삽입이 잘 반면, 하나의 셀 유형을 포함하거나 요리는 체액 환경 (그림 1)에 세포의 서로 다른 두 집단의 기여를 연구 할 수 있도록, 다른 세포 인구를 포함한다. 그 결과, (혀끝의 분비 또는 신호 수신 대 기저) 세포 극성 따라서 혼합 문화와 에어컨 매체 기술을 통해 삽입 공동 문화 시스템에게 중요한 이점을 부여, 보존됩니다. 멤브레인 재료의 몇 가지 유형이 사용할 수있는 가장 일반적인 것 인 폴리 에스테르 (PET), 폴리 카보네이트 (PC) 또는 콜라겐 코팅 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE)가 0.4 μm의 12.0 ㎛의 범위의 상이한 기공 크기에 존재. 재료 및 기공 크기의이 품종에 한정되지 사용하는 다음에 대해 서로 다른 수준에서 그들을 실용적 광학 특성, 막 두께 및 세포 부착과 관련된 변수 기능을 발휘 삽입의 스펙트럼을 제공합니다 :
-studying세포 분화, 배아 발달, 종양 전이 및 투과 막을 통해 chemotaxic 분석에 의해 상처 수리;
상피 또는 내피 단일 층을 통해 전송을 평가하여 약물의 침투를 -evaluating은 투과성 지원에 배양하고;
-performing 세포 공동 배양은 세포 - 세포 접촉이없는 수용성 분비 인자에 의해 유도 된 세포 변조 동작을 분석한다.

이 문서의 목적은 삽입 공 배양 시스템을 이용한 세포 - 세포 접촉이없는 분비 가용성 인자에 의해 매개되는 세포 변화를 평가하는 상술 한 제 기능을 수행하기 위해 일반적인 방법론 지침을 설명하는 것이다. 연구의 여러 다른 필드는 세포 집단에서 분비 된 가용성 인자의 영향에 관련된 질문에 대답하기 위해 삽입 공 배양 시스템을 사용한다. 다양한 수준에서 세포 행동을 조절 실제로 분비 신호는 모든 조직에서 관련입니다및 삽입 공 배양 시스템을 만드는 시스템은이 분야의 발전을 위해 불가결. 반대로, 그 신호 전달을 확인할 수있는 인서트의 사용은 직접 세포 - 세포 접촉이 아닌 분비 요인이다. 인서트의 가장 중요한 용도 중 하나는 분비 된 사이토 카인의 효과는 다양한 면역 세포에서 평가되는 플레이어 염증 연구 ^2-14이다. 특히, 중추 신경계 (CNS) 염증의 연구는 더 크게 신경 염증 ^{15-21 구동} 뉴런 및 미세 아교 세포의 분비 독특한 역할을 정의 할 수있는 삽입 공 배양 과정에서 이익이있다. 이러한 시스템은 또한 감소 시키거나 염증성 인자 ^22-26의 분비를 억제하는 능력에 의존하여 분자의 항 염증 가능성을 연구하기 위해 고안되었다. 연구 메커니즘, 특히 암 ^27-31 관련된 혈관 ^32-34과 inflammati의 기초종양의 ^35-42에, 또한 삽입 공동 문화 시스템에서 도움이됩니다. 또한, 수용성 요소는 분화와 여러 연구가 특정 필드 ^43-50에서 질문에 답 삽입을 사용한 구동 과정에서 가장 중요하다. 중추 신경계에서 신경 조직으로 보는 것은 매우 제한된 갱신 전위 neurotrophism 연구를 가지며, 신경은 근본적인 널리 공존 배양 시스템 ^51-56 줄기 세포의 사용에 의해 확보되어왔다. 또한, 삽입은 신장 ^{57, 58,} 내피 상호 작용과 혈관 신생 ^59-62, 세포 사멸 비만과 대사 증후군 ^{22,23,66-67에 63 ~ 65,} 염증 신호, 내이 머리 세포 보호 등 다양한 분야에 활용된다 ^68,69, 심지어 곰팡이 독성 ^{(70, 71)} 및 기생충학 ^{72, 73입니다.}

이 문서에서는 experim을 설정하기 위해 일반적인 방법 론적 지침을 제공합니다삽입 공 배양 시스템을 사용하여 분비 된 가용성 인자에 의해 매개되는 세포 변화를 평가보기 이비인후과. 특히, 우리는 신경 세포의 공동 문화와 신경 염증성 과정을 공부하고 자신의 용도에 우리의 관심을 초점을 맞출 것이다. 파일럿을 가능하게 삽입 실험의 매우 넓은 스펙트럼을 감안할 때,이 세포 배양 기술의 모든 측면을 다루 견딜 수있다. 예를 들어, 특정 프로토콜은 삽입 공 배양 방법의 구체적인 이해를 제공하는 상세하게 설명 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)에 의해 분비되는 사이토 카인의 효과 PC12 신경 세포에 대한 N9의 미세 아교 세포를 부활 측정.

프로토콜

NB는 : 포유류 세포 배양에 필요한 다음 각 단계를 층류 후드에서 멸균 조건 하에서 수행되어야한다. 또한, 최적의 무균 세포 배양에 대한 일반적인 가이드 라인, 적용 예., 팁 언제든지 그들이 교차 오염을 초래할 시각 세포의 양을 줄일 수있다 폐기 적절 전체 미디어 변경을 수행하지만 부드럽게 교반 할 때, 공기에 노출 될 세포 현탁액은 또한, 삽입 특수 처리가 필요 plasticware의 친절 등 자신의 균일 한 피펫을 보장합니다. 인서트를 조작 할 때마다 먼저, 쉽게 눈물 때문에 실험을 위태롭게 할 수있는 깨지기 쉬운 멤브레인을 만지지 마십시오. 멤브레인을 관통하거나 부착 세포를 해리 위험이 있으므로 또한, 상기 세포 배양 배지의 진공 흡인을 수행하기에 적합하지 않다. 다음으로, 삽입 따라서,주의 때 모 이용해야는 멀티 웰 조직 배양 판에 느슨하게 걸고plasticware을 ving 또는 부착 세포를 해리 피하기 위해 피펫 팅 할 때. 큰 기공 크기를 갖는 인서트를 사용할 때, 세포 배양 배지 따라서, 빈번하게 액체의 레벨을 모니터하는 것이 중요하다 멤브레인을 통해 스며 가능성이있다. 마지막으로, 다음과 같은 프로토콜이 부착 세포에 대한 설계 및 서스펜션 세포에 적합하기 위해 약간의 수정을 요구된다는 점에 유의.

삽입 공동 배양 실험을 실시 1. 일반 지침

1. 삽입에 시드 셀 타입 # 1
   1. 자신의 포장에서 삽입을 풀다.
   2. 적절한 크기의 빈 멀티 웰 조직 배양 플레이트에 삽입을 배치합니다. 핀셋을 사용하여 삽입물의 맨 가장자리, 그래서 그립을 수행합니다.
   3. 부착을 개선하고 부착 세포의 확산, 파종 전에 세포 배양 배지로 삽입 상태로. 이를 위해, 세포 배양 mediu과 멤브레인의 전체 표면을 덮마이크로 피펫을 사용하고 있습니다.
      참고 : 필요한만큼의 삽입에 대해이 작업을 수행합니다.
   4. 접시에 뚜껑을 교체하고 동일한 조건에서 적어도 1 시간 또는 O / N 부화 (일반적으로 37 ° C, 5 ~ 10 %의 CO _2).
   5. 삽입물이 조절 될 때, 마이크로 피펫을 사용하여 세포 배양 배지를 모두 제거한다. 사용 된 매체를 폐기하십시오.
   6. 멀티 웰 플레이트와 같은 방법으로 새​​로운 세포 배양 배지에서 종자 세포 유형 # 1. 이를 위해 마이크로 피펫으로 세포 현탁액의 적절한 양을 그리고 인서트 내의 액체를 분배.
      참고 : 필요한만큼 삽입을 준비합니다.
   7. 모든 인서트를 파종 한 후, 부드럽게 고르게 세포를 분산시키기 위해 앞뒤로 좌우 판 바위. 이것은 셀 인서트의 중심에 증가 할 수있는 바와 같이, 원형 운동을 피한다.
   8. 접시에 뚜껑을 놓고 셀룰러 요구 사항 (일반적으로 37 ° C 당, 5 ~ 10 %의 CO에 의해 지정된 품다 _2).
2. 멀티 웰 조직 배양 플레이트에 파종 세포 유형 # 2
   1. 제 1 항에있어서, 새로운 세포 배양 배지에서 종자 세포 유형 # 2.
   2. 인서트의 개수에 필요한만큼의 웰을 준비한다. 세포가 균일하게 우물에 분산되어 있는지 확인하는 단계 1.1.7에서와 같이 플레이트를) 바위.
   3. 접시에 뚜껑을 놓고 동일한 조건에서 배양 (일반적으로 37 ° C, 5 ~ 10 %의 CO _2).
3. 삽입에서 새로 고침 매체
   1. 마이크로 피펫을 사용하여, 세포 유형 # 1을 포함하는 인서트의 일부 또는 세포 배양 배지를 모두 제거한다. 사용 된 매체를 폐기하십시오.
   2. 새로운 세포 배양 배지의 적당한 양을 그린다. 부드럽게 삽입 체의 내벽에 팁 나머지 서서히 세포 배양 배지를 분배.
   3. 접시에 뚜껑을 놓고 단계 1.1.4에 따라 품어.
4. 멀티 웰 조직 배양 플레이트에서 새로 고침 매체
   1. micropi를 사용하여pette는 일부 또는 세포 유형 # 2를 포함하는 웰의 세포 배양 배지를 모두 제거한다. 사용 된 매체를 폐기하십시오.
   2. 새로운 세포 배양 배지의 적당한 양을 그린다. 웰의 내벽에 팁을 나머지 서서히 세포 배양 배지를 분배.
   3. 접시에 뚜껑을 배치 이전에 확립 된 세포 배양 프로토콜에 따라 배양한다.
5. 세포 유형 # 2을 포함하는 멀티 웰 조직 배양 플레이트에 세포 유형 # 1을 포함한 전송 인서트.
   참고 : 두 종류의 세포가 적절한 성장 단계에 도달 한 경우이 단계를 수행합니다.
   1. 이전 단계 1.3) 1.4에 설명 된대로 우물에 삽입을 전송하기 전에), 필요한 매체를 변경합니다.
      참고 :이 시점에서,이 삽입 제조업체의 지침에 의해 지정된 두 구획 미디어의 적절한 볼륨을 분배하는 것이 중요하다.
   2. 그립 셀 t를 포함하는 삽입 체의 최상부 에지를 핀셋을 사용하여# 1 타 입 조심스럽게이 해당 잘 포함하는 세포 유형 번호에 넣습니다.
   3. 모든 인서트를 전송 한 후, 인서트 막 아래에 기포의 존재를 확인한다.
      주 : 기포가 인서트의 막을 가로 지르는 모든 교환을 방지하고, 전체 실험을 위태롭게 할 수있다.
   4. 기포가 존재하는 경우, 아주 부드럽게 웰로부터 핀셋 삽입물을 들어 올리고 다시 세포 배양 배지 급락. 거품이 사라집니다. 그들은 여전히​​ 존재한다면, 비스듬히 위로 세포 배양 배지에 침지 부드럽게 삽입 시도.
      참고 : 노크 또는 부착 세포를 해리 방지하기 위해 삽입을 저어하지 마십시오.
   5. 모든 기포를 제거하고 양쪽 구획 미디어의 볼륨, 접시에 뚜껑을 배치하고 부화 것을 확인한 후.
6. 공동 배양 시스템에서 새로 고침 미디어
   참고 : 막 쉽게 삽입 사이에 미디어 교류를 할 수 있지만 잘, 매체를 새로 고침하는 것은 이루어집니다형 확산에 의해 상부 및 하부 구획실에 평형에 도달하는데 필요한 시간을 보낸 두 구획은 매우 길어질 수있다.
   1. 세포 유형 # 1을 포함하는 인서트 상쾌 중간 단계 1.3)와 동일하게 수행된다.
   2. 세포 유형 # 2를 포함하는 우물에서 매체를 새로 고치려면 부드럽게 피펫 팁을 수용하기에 충분히 넓은 공간을 만들기 위해 측면에 삽입물을 밀어 넣습니다. ) 단계 1.4에서와 같이 매체를 새로 고칩니다.
   3. ) 기포의 존재를 확인하고 1.5.5 단계의 1.5.3에 따라 볼륨)를 확인합니다.

예 2 : PC12 신경 세포에 LPS 활성화 N9의 미세 아교 세포에 의해 분비 된 시토 킨의 효과를 측정

참고 : 다음 단계가 아니라 특정 플라스크와 접시 크기를 위해 설계되었습니다. 그러나, 프로토콜은 plasticware 치수에 맞게 사용자 정의 할 수 있습니다. 미디어 및 구성에 대한 자료 표를 참조하십시오.

1. 시드 및 복수의 PC12 세포 분화잘 조직 배양 플레이트
   1. 따뜻한 루틴 PC12 세포 배양액, 37 ° C의 수욕 PC12 분화 배지와 트립신 EDTA.
   2. 75 ^㎠로 플라스크에서 60~80%의 합류에 PC12 세포를 사용합니다.
   3. 15mm의 파스퇴르 피펫, 플라스크의 전체 세포 배양 배지의 진공 흡입을 수행한다.
   4. 부드럽게 멸균 인산 완충 생리 식염수 5 ㎖의 세포 단층을 씻어 파스퇴르 피펫으로 액체를 제거합니다. 이 단계에서 세포를 떼어 놓다하지 않도록주의하십시오.
   5. 트립신 EDTA 3 ㎖와 세포 단층을 덮고 37 ℃에서 2 ~ 3 분 동안 품어.
   6. 모든 세포는 현미경으로 분리되어 있는지 확인합니다. 소수의 세포가 떠있는 경우 5 분의 최대 장기간 배양한다.
   7. 트립신 - EDTA를 비활성화하기 위해 루틴 PC12 세포 배양액 10 ㎖를 추가한다.
   8. 대부분의 세포는 O를 바닥에서 해리되어 있는지 확인하는 동안 10 ml를 피펫으로 부드럽게 씹다플라스크 바. 세포 현탁액에 공기 방울을 생성하지 마십시오.
   9. 동일한 10 ㎖ 피펫, 50 mL의 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 전송.
   10. 3,200 XG에서 1 분 동안 원심 분리기
   11. 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서 파스퇴르 피펫으로 상층 액을 버린다.
   12. 10 ml의 피펫 루틴 PC12 세포 배양액 10 ㎖를 추가한다.
       참고 : 펠렛이 비정상적으로 작거나 큰 경우이 볼륨을 조정할 수 있습니다.
   13. 펠렛을 균질화 같은 10 ㎖ 피펫 씹다. PC12 세포는 자주 피펫 팅 적어도 20 있도록 함께 덩어리 필요 downare.
       주 : 격렬한 분쇄하여 필요하지만, 세포 현탁액에 기포를 생성하지 않도록.
   14. 1.5 ㎖의 튜브에 트리 판 블루 세포 현탁액의 적절한 희석액을 준비한다. 이전에 설정된 프로토콜 ^(74)에 따라 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다.
   15. 별도의 50 ㎖ 튜브에 세포 현탁액을 분할PC12 분화 배지로 24 웰 플레이트에서 (30,000 ¢ / cm ^2, 잘 제조사의 프로토콜에 따라 당 0.6 ml)에 우물을 시드의 희석 세포 현탁액의 적절한을 얻었다.
       주 : 미리 설정된 프로토콜 ^(75)에 의해 규정 된 24 웰 플레이트는 이전 콜라겐으로 코팅되어야한다.
   16. 웰 마이크로 피펫 당 세포 현탁액 0.6 mL를 배포.
   17. 모든 우물이 시드되면) 단계 1.1.7에서와 같이 판 바위.
   18. PC12 세포의 적절한 분화 공동 배양 실험을 수행하기 전에 PC12 분화 배지 ^{(15, 16)의} 5 % CO ₂ 습한 대기 중에서 37 ℃에서 7-9일 대한 24 웰 플레이트를 부화 허용한다.
   19. 액의 절반을 제거하고 신선한 PC12 분화 배지 동일 부피로 교체하여 매일 매체 변화를 수행한다.
2. 인서트에 N9 미세 아교 세포를 파종 및 LPS로 처리
   1. 하루 공동 배양 실험을 수행하기 전에, 1.1.4 내지 1.1.1 단계)에 따라 세포 접착 성을 최적화 루틴 N9 세포 배양 배지와 PTFE 0.4 μm의 세공 삽입 전 처리)
   2. 37 ° C의 물 중탕에서 따뜻한 루틴 N9 세포 배양 배지와 트립신 EDTA.
   3. 한편, 나중에 사용하기 위해 1.5 ㎖의 튜브에 LPS의 약 10 mg의 무게.
      참고 : LPS는 강력한 염증성 독소이며, 특히 안전주의 사항, 안경, 장갑을 필요로하고, 미립자 인공 호흡기를 적극 권장하고 있기 때문에.
   4. 75 ^㎠로 플라스크에서 80-90%의 합류에 N9 세포를 사용합니다.
   5. ) 2.1.14 스텝 2.1.3)을 따릅니다. 항상 루틴 N9 세포 배양액 대신 루틴 PC12 세포 배양 배지를 사용한다. 또한) N9의 미세 아교 세포가 많은 PC12 세포처럼 함께 그렇게 적은 피펫을 응집하지 않고 아래 단계 2.1.13에서해야 할 수도 있습니다.
   6. 별도의 50 mL의 튜브, N9 세포 배양 배지에서 세포 현탁액 O로 분할24 웰 플레이트에 개최하도록 설계 삽입 (60,000 ¢ / cm ^2, 제조사의 프로토콜에 따라 삽입 당 0.05 ㎖를, 막 표면 영역에 대한 제조업체의 정보를 참조) 시드에 적합한 희석 세포 현탁액 btain.
      참고 :이 삽입은 이미 제조 업체 콜라겐으로 코팅하고, 세포 부착에 최적화되어 있습니다.
   7. 마이크로 피펫을 사용하여 인서트 당 세포 현탁액 0.05 mL를 배포.
   8. 모든 삽입이 시드되면) 단계 1.1.7에서와 같이 판 바위.
   9. 4 μg의 2 μg의 / ㎖ / ㎖, 1 μg의가 / ㎖ 작업 용액을 얻었다 N9 처리 매체를 이용하여 LPS의 연속 희석을 수행한다.
   10. 피펫 0.05 μg의 2 / ㎖의 최종 희석액을 수득하기 위해 하나의 인서트의 세트 내의 4 μg의 / ㎖ 작업 용액의 용액.
   11. 다른 세트 인서트의 다른 두 작업 솔루션을위한 단계를 반복 2.2.10), / ㎖ 및 0.5 μg의 / 각각 ml로 1 μg의 최종 희석을 얻었다.
   12. 에서공동 배양 실험을 수행하기 전에 LPS와 N9의 미세 아교 세포의 활성화를 허용하기 위해 5 % CO ₂ 습한 분위기에서 37 ° C에서 24 시간 동안 삽입물을 함유하는 판을 cubate.
3. 공동 배양 된 미세 아교 세포로 N9 PC12 신경 세포
   1. PC12 세포를 분화 7-9일에서 37 ° C의 물을 욕조에 따뜻한 N9 처리 매체와 PC12 처리 매체에 의해 LPS와 배양 24 시간 후 N9의 미세 아교 세포를 활성화합니다.
   2. N9 처리 매체의 0.1 ml로 전체 사용되는 매체를 교체, 단계 1.3)에서와 같이 N9의 미세 아교 세포에 대한 총 매체 변경을 수행합니다. 모든 insert.This에 대해이 작업을 수행하면 삽입 만 활성화 N9의 미세 아교 세포를 떠나, LPS의 모든 흔적을 제거 할 필요가있다.
   3. ) 단계 1.4에서와 같이 신경 PC12 세포에 대한 총 매체 변경을 수행합니다. 5 % CO ₂ 습한 분위기에서 37 ℃에서 24 시간 또는 48 시간에 대한 N9-PC12 공동 배양)을 150 단계에서와 같이 24 웰 플레이트에 삽입물을 전송 .Incubate.
   4. 24 후시간이나 48 시간이 뜨는 및 / 또는 세포 독성, 효소 면역 분석법을위한 세포 (ELISA), 웨스턴 블롯, 또는 기타 분석 수확.

결과

삽입 공 배양 시스템의 사용은 CNS의 다른 세포 분비 플레이어 사이의 관계를 보여주는 신경 염증성 과정의 연구에 특히 적절하다. 중추 신경계에서 면역은 휴식 분지의 상태 (그림 2A)에서 자신의 환경을 모니터링하고 감지 방해 할 수있는 미세 아교 세포라는 거주자 세포에 의해 주로 수행되는 수 문제가 적절한 신경 기능 ^76-78에 필요한 매우 귀중한 항상성. 아메바 모양 (그림 2B)와 세포 인구의 곱셈의 채용 특징 소교 활성화, 같은 사이토 카인과 같은 염증성 매개 물질의 방출 다음 microgliosis (그림 3)라고 신경 염증 ^(79)의 주요 부분을 구성한다 . 사이토 카인의 방출은 유해한 공격에 대해 신경 세포를 보호하는 고귀한 목적을 제공하고 클입니다엘리 모니터링. 신경 염증이 엄격한 제어를 탈출 때, 그것은 파괴적인 성격을 채택...

토론

모든 삽입 공동 문화 시스템 실험의 가장 중요한 단계는 실제로 사용하기에 적합한 인서트를 선택하는 거. 공극 크기 및 막 재료 시드 될 세포 형태 및 실험 목적을 고려 잊지 않고 철저한 고려되어야한다. 예를 들어, chemotaxic 분석은 세포 - 세포 접촉이없는 수용성 분비 인자에 의해 유도 된 세포 행동 변조를 분석하는 세포 공동 배양보다 공막의 동일한 유형을 사용할 수있다. 세포의 이동 및 세포 - 세포 접촉을 배제하기 위해, 세포 이동을 허용하기 이전에 대한 더 큰 것, 그리고 후자 작은 것 : 그러나, 실험의 두 종류의 서로 다른 기공 크기를 필요로한다. 세포 - 세포 접촉이없는 분비 가용성 인자에 의해 매개되는 세포 변화의 평가를 들어, 0.4 ㎛의 3 ㎛, 크기는 통과하지만 고에서 가장 세포를 방지하기 위해 그들이 단백질과 같은 큰 분자를 허용로서 보통 적절한 기공 그래서. 막재료는 주로 세포의 종류에 따라 상기 기술은 세포 배양 프로토콜의 마지막에 사용된다. 그들은 명확하지만 콜라겐 지지체가 처리 될 필요 부착...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
RPMI-1640 미디엄	시그마	R8755	웜 37 ° Dulbecco를 사용하기 전에 C 수조
를 사용하십시오. 의 변형된 독수리' s 매체/영양 혼합물 F-12 햄	시그마	D6421	37°C에서 따뜻하게; 사용 전에 C 수조는 0.365 gm/L L-글루타민
호스 세럼	ATCC	30-2040	Warm in 37 °로 보충해야 합니다. C 사용 전 수욕
Fetal bovine serum	MultiCell	80350	Warm in 37 ° 사용 전 C 수욕
Nerve Growth Factor-7S 쥐 하악선에서 추출	Sigma	N0513	0.1&ndash를 포함하는 완충된 식염수 또는 조직 배양 매체의 용액에서 동결건조된 분말을 재구성하십시오; 1.0% 소 혈청 알부민 또는 1-10% 혈청
트립신-EDTA 용액	시그마	T3924 37	에서 따뜻함; C 사용 전 수조
지방 다당류  대장균  055 : B5	Sigma	L2880
24 웰 플레이트와 함께 사용하기위한 독성 세포 배양 인서트	BD Falcon	353095	0.4 μ m 모공
24웰 플레이트	TrueLine	TR5002	사용 전 콜라겐 코팅
루틴 PC12 세포 배양 배지			루틴 N9 세포 배양 배지
nbsp;           85% RPMI 중간			-            90% DMEM-F12 중간
-            10% 열 비활성화 말 혈청			-            10% 열 비활성화 말 혈청
-            5% 열 비활성화 소 태아 혈청
PC12 분화 매체			N9 처리 매체
-              99% RPMI 중간			-            99% DMEM-F12 중간
-              1% 열 비활성화 소 태아 혈청			-            1% 열 비활성화 소 태아 혈청
-              50 ng/mL 신경 성장 인자
PC12 치료 배지
-              99% RPMI 중간
-              1% 열 비활성화 소 태아 혈청