방법 논문

형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)와 신선한 및 냉동 쥐 뇌 조직 FOS를 발현하는 신경 세포의 유전자 발현 분석

DOI:

10.3791/54358

⸱

2016년 8월 27일

 ,  ,  ,  , 
1Behavioral Neuroscience Research Branch, Intramural Research Program, NIDA, NIH, DHHS, 2Division of Rheumatology, School of Medicine, Johns Hopkins University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서 우리는 신선한 냉동 모두 뇌 조직에서 신경 앙상블 별점이 발현 분자 변화를 연구하는 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS) 프로토콜을 제안한다. 동결 조직의 사용은 유용한 동물 피험자의 사용을 최대화하기 위해 다수의 세션을 통해 많은 뇌 영역의 FACS 분리 할 수​​있다.

초록

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신경 가소성 및 학습 행동의 분자 변화의 연구는 협회를 알게을 중재 신경 앙상블라고 띄엄 띄엄 분산 활성화 된 뉴런의 특정 세트의 연구에 전체 뇌 영역의 연구로 전환된다. (FACS)을 정렬 형광 활성 세포는 최근 성인 쥐의 뇌 조직에 최적화 신경 마커 NeuN과에 Fos 단백질, 강력하게 활성화 된 신경 세포의 마커에 대한 항체를 사용하여 활성화 된 뉴런의 분리를 허용하고있다. 지금까지에 Fos 발현하는 신경 세포와 다른 세포 유형은 긴 처리 일 길고 복잡한 행동 절차 후 평가하기 위해 뇌 샘플을 허용 매우 제한된 숫자를 수반 신선한 조직에서 분리 하였다. 이십일일 - 여기에서 우리는 등쪽 선조체의 신경과에 Fos mRNA의 별점이 발현의 수익률이 3 -80 ºC에서 동결 갓 해부 조직과 조직 사이의 유사한 것으로 나타났다. 또, 표현형 확인냉동 조직은 또한의 FACS 분리에 사용할 수 있음을 나타냅니다 신경의 평가 유전자 발현 (NeuN), 성상 세포 (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) 및 microgial (Iba1) 마커에 의한 NeuN 양성 및 NeuN 음성 분류 세포의 아교 세포 유형. 전반적으로, 이는 수집 해부 복수 FACS 세션을위한 뇌 조직을 고정 할 수있다. 이것은 종종 길고 복잡한 행동 절차를 거친 유용한 동물 대상에서 획득 된 데이터의 양을 최대화한다.

서론

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학습하는 동안, 동물은 매우 구체적인 자극의 복잡한 세트 사이의 연결을 형성한다. 이것은 고해상도 정보 신경 앙상블이라 띄엄 띄엄 분산 된 뉴런의 특정 패턴 내의 변화에​​ 의해 인코딩 될 것으로 생각된다. 신경 앙상블은 최근 강하게 행동이나 큐 노출시 활성화 된 예에 Fos, 아크 및 Zif268 및 신경 세포에서의 단백질 제품으로 즉시 초기 유전자 (IEGs)의 유도에 의해 확인되었다. 특히 상황과 큐 - 특정 배운 행동 1-4에 인과 역할을하는 것으로 나타났다 신경을 FOS는 발현. 따라서, 이러한 활성화에 Fos 발현하는 신경 세포 내에서 고유 분자 neuroadaptations은 중독과 외상 후 스트레스 장애 (PTSD) 5 정상적으로 학습과 이상 학습 장애 동안 형성된 협회를 알게 인코딩 신경 메커니즘에 대한 상위 후보입니다.

Fluore에서 scence 활성화 된 셀 정렬 (FACS)는 최근에 Fos 발현하는 신경 세포 내에서 고유 분자 neuroadaptations의 분석을 허용했다. 유세포 셀은 광 산란 특성에 따라 면역 세포를 특성화하고 분리 1960 -6,7- 개발되었다 정렬 및 긴 면역학 및 암 연구에 사용되었다. 그러나 유동 세포 계측법 및 FACS는 성인 뇌 조직에서 얻기 어려운 해리 하나의 세포가 필요합니다. FACS는 제 8,9 항체 표지가 필요하지 않은 트랜스 제닉 마우스로부터의 선조체 뉴런 발현 분리하고 (GFP)에 녹색 형광 단백질을 분석하는데 사용 하였다. 우리는 분리 및 야생형 동물 11-15에서 약물 및 / 또는 단서에 의해 활성화 된 뉴런에 Fos가 발현 분자 변화를 평가하는 항체 기반 FACS 방법 (10)을 개발했다. 강하게 신경 세포를 활성화하는 동안이 방법에서는, 신경 세포는 일반적으로 신경 세포 마커 NeuN에 대한 항체로 표시되어 있습니다에 Fos에 대한 항체로 표시되어 있습니다. 우리의 초기 방법은 신선한 조직 샘플 당 최대 10 쥐의 풀링을 요구하지만, 프로토콜의 이후의 변경은 단일 쥐 13-15에서 분리 된 뇌 영역에 Fos 발현 뉴런과 정량적 중합 효소 연쇄 반응을 (qPCR에) 분석 FACS 분리 허용 . 전반적으로, 독특한 분자 변경은 중독 연구 12,14,15의적인 상황과 큐 활성화 행동의 다양한 동안 활성화 뉴런에 Fos가 발현에서 발견되었다.

신선한 조직에 FACS를 수행와 주요 물류 문제는 FACS에 의해 조직 및 프로세스를 해리 하나 하루 종일 걸리는 것입니다. 또한, 약 4 개의 샘플은 하루에 처리 될 수있다. 이것은 일반적으로 하나의 뇌 영역마다 뇌에서 평가 될 수 있고, 나머지 뇌 영역을 폐기해야하는 것을 의미한다. 이것은 자기 관리 및 멸종 TRAI 낮은 처리량 행동 절차에 대한 주요 문제수술과 집중적 인 훈련의 많은 주를 필요로 닝. 또, 시험 당일에 길고 복잡한 행동 절차 어려운 당일 FACS를 수행 할 수있다. 이것은 중요한 이점을 즉시 행동 시험 후 동물로부터 뇌를 고정 할 수있을하고 조사자 선택한 다른 시간에 하나 이상의 뇌 영역 FOS를 발현하는 신경 세포를 분리한다.

여기서 우리는 FACS 프로토콜 신선한 냉동 모두 뇌 조직 FOS를 발현하는 신경 세포 (및 다른 유형의 세포)를 분리하기 위해 사용될 수 있음을 보여준다. 예를 들어, 우리는 급성 필로폰 주사 후 주사 (제어 조건)없이 순진한 쥐에서 쥐 선조체의 신경 세포에 Fos가 발현입니다. 그러나이 프로토콜은 FACS 어떤 행동 또는 약물 치료 다음 사용될 수있다. 우리의 샘플의 후속의 qPCR 분석은 이들 세포 타입에서 유전자의 발현이 미으로 평가 될 수 있다고 지적신선한 냉동 모두 조직에서 LAR 효율.

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프로토콜

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모든 실험은 실험 동물 (16)의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 따라 수행 하였다.

참고 : 달리 명시되지 않는 한 얼음에 보관 된 사용 낮은 결합 원심 분리기 튜브 아래의 모든 단계.

조직 컬렉션 전에 1. 준비

  1. 4 O C.에 원심 분리기를 설정
  2. 화재 폴란드어 감소 약 1.3의 직경, 0.8, 각 샘플에 대한 0.4 mm와 3 개의 유리 파스퇴르 피펫 세트.
  3. 감기 버퍼 1 ml에 포함 된 표시 1.7 ml의 튜브를 준비하고 얼음에 튜브를 유지.
  4. 매트릭스, 주걱과 절개를 수행 할 유리판 (또는 반전 유리 페트리 접시)를 슬라이스 뇌를 포함하는 얼음 트레이를 준비합니다. t을 눌러 모든 악기를 건조 유리 접시와 사용 조직 종이에 사전 진정 두 개 이상의 면도날발행물.
  5. 조직 수집 전에, 30 분 동안 실온 (RT)에서의 효소 용액을 해동.

2. 조직 수집 및 해부

  1. 조직 수집하기 전에 행동이나 약물 치료 90 분을 시작합니다.
    참고 : 여기에 표시된 결과를 위해, 새로운 환경 (테스트 조건)과 순진한 쥐 쥐 5 ㎎ / ㎏ 메스 암페타민의 급성 복강 내 주사는 자신의 홈 케이지 (제어 조건)에 보관을 시행 하였다.
  2. 포화 이소 플루 란과 유리 데시 케이 터 항아리에 배치하여 쥐를 마취와 쥐 (30) 목을 벨 - 60 초 후에 단두대를 사용.
    머리의 피부와 근육을 제거하고 두개골을 노출 가위를 사용합니다. 두개골을 잘라 난원 매그넘을 열고 두개골의 뒤쪽 부분을 제거하는 rongeurs을 사용합니다. 뇌를 노출 두개골의 상단 가장자리를 따라 잘라 rongeurs을 사용합니다. 뇌 손상되지 않도록주의하십시오. 부드럽게 언더 퍼 위해 작은 주걱을 사용하여뇌를 상승 거라고. 뇌를 올리고 뇌가 17 될 때까지 신경을 잘라.
  3. 면도날을 사용하여 조직의 해부.
    참고 : 다음 방법 중 하나를 사용하여 조직 샘플을 얻습니다 (2.3.1) 갓 해부 조직을; 절개 후 (2.3.2) 냉동 조직; 또는 (2.3.3) 냉동 조직을 냉동 전체 뇌 해부. 해부를 통해 뇌 슬라이스 매트릭스, 면도날과 유리 접시를 건조하게 유지하고 응축 물과 같은 프로세스를 닦지하는 것은 세포의 저장성 용균 될 수 있습니다. 정확한 해부을 보장하기 위해 돋보기 안경을 사용합니다.
    1. 갓 해부 조직의 경우, 얼음에 냉각 된 뇌 슬라이스 매트릭스 (1mm 간격으로 면도날 슬롯이있는 쥐의 뇌 모양의 금형)에 갓 추출 된 뇌를 놓습니다. 관심있는 뇌 영역 (들)을 포함 코로나 조각을 잘라 슬롯에 두 개 이상의 사전 냉장 면도날을 삽입합니다. 냉장 유리 접시에 잘라 슬라이스를 놓습니다.
      참고 : 뇌 레지오을 해부하다냉장 유리 접시에 관심 NS.
    2. 절개 후 동결 조직 들어 2.3.1에서 상술 된 것과 유사한 새롭게 추출 뇌 조각에서 관심있는 뇌 영역 (들)을 해부. 마이크로 튜브로 해부 조직을 놓고 빠른 속도로 20 초 동안 -40 ºC의 이소 펜탄에서 마이크로 튜브를 침지하여 조직을 동결. 추가 처리까지 -80 ºC의 냉장고에 항상 냉동 해부 조직을 유지합니다.
    3. 냉동 조직의 경우, 즉시 최대 6 개월 -80 ºC에서 밀폐 된 가방 -40 ºC의 이소 펜탄 및 저장소에 갓 추출 된 두뇌를 동결.
      1. 해부의 날, 약 설정 저온 유지 장치에 고정 된 뇌를 배치 -20 ºC (더 따뜻한 -18보다 ºC)를 약 2 시간 동안 온도를 평형.
        참고 훨씬 낮은 온도 안전하게 절단 뇌 너무 취성 만드는 동안 뇌는이 온도에서 용이하게 절단 할 수있다.
      2. 의 2mm 관상 조각 - 1을 잘라 면도날을 사용하여그라 이오 스탯에 얼어 붙은 두뇌. 동결 조건이 조각에서 티슈 펀치를 얻기 위해 평활화 12 16 게이지 바늘을 사용한다. 추가 처리 할 때까지 항상 냉동 해부 조직을 유지합니다.
  4. 닦지 전에 해부 조직을 충당하기 위해 버퍼 (A)의 2 방울 - 1을 추가합니다. 분쇄 공정의 나머지 동안 뉴런의 손실을 방지하기 위해 두 개의 면도날을 사용하여 조직으로부터 백색 물질의 대부분을 제거한다. 냉동 된 조직으로 시작하는 경우, 조직의 버퍼에게 솔루션을 적용하기 전에 더 이상 1 분 동안 차가운 유리판 위에 해동 할 수있다.
  5. 냉장 유리 접시에 면도날로 조직 각 직교 방향으로 100 번을 말하다. 닦지 때 유리판에 수직 면도날 잡아.
    주 : 철저한 닦지 모든 프로토콜 단계에 중요합니다.
  6. Ke에 5 회 - 튜브 3을 전환 냉 버퍼 A. 1 ㎖를 함유하는 마이크로 원심 튜브에 다진 조직을 전송 면도날을 사용하여용액 모든 다진 조직 EP.

3. 세포 해리

참고 : 다음 단계의 모든 혼합 끝 이상을 사용하여 부드러운 끝. 볼텍스 혼합기를 사용하여 세포 손상의 원인이 기포를 방지하지 않는다.

  1. 4 ºC에서 2 분 동안 110 XG에서 샘플 튜브를 원심 분리기. 폐기 뜨는. 천천히 마이크로 튜브의 내벽 다운 냉간 신선하게 해동 된 효소 용액 (단백질 분해 효소의 조합을 포함) 1 ㎖를 추가한다. 즉시 다진 조직 펠렛을 분산 적당히 큰 팁 직경 피펫 만 4 번을 피펫과 아래로 부드럽게 전체 펠렛을 빨아합니다.
  2. 바닥에 달라 붙는 펠렛을 방지하고 4 오 ℃에서 30 분 동안 엔드 오버 엔드 혼합과 샘플을 부화 즉시 마이크로 튜브를 반전
  3. 효소 조직 소화 한 후, 원심 분리기 4 ºC에서 2 분 동안 960 XG에 튜브. 상층 액을 제거하고 차가운 버퍼 A. Immediatel 0.6 ml에 추가Y 버퍼를 추가 한 후, 아래로 5 회 전체 펠릿을 흡입하여 펠렛을 분산하기 위해 동일한 피펫 팁을 사용하여 부드럽게 피펫합니다.
  4. 기계적 소화 조직을 씹다하고 다음 단계를 사용하여 15 ml의 튜브에 수집합니다. 각 샘플에 대해, 라텍스 전구에 부착 약 1.3, 0.8 및 0.4 mm의 직경을 내림차순로 3 화재 - 광택 유리 파스퇴르 피펫의 별도의 세트를 사용합니다.
    1. 조심스럽게 각 시료를 1.3 mm의 유리 피펫 10 번 씹다. 샘플 (바닥에 정착 할 파편과 해리되지 않은 세포) 얼음에 2 분 동안 정착하자. 15 ml의 원추형 튜브에 상청 (~ 0.6 ml) 및 전송 부담 (튜브 # 1).
    2. 나머지 펠릿에 대한 해결책 버퍼 ㎖로 0.6를 추가합니다. 샘플을 0.8 mm의 유리 피펫 10 번 씹다. 샘플을 얼음에 2 분 동안 정착하자. 동일한 15 ml의 상층 액 (~ 0.6 ml) 및 전사 수집 원뿔 튜브 # 1.
    3. 나머지 PELLE에 대한 해결책 버퍼 ㎖로 0.6 추가티. 샘플을 0.4 mm의 유리 피펫 10 번 씹다. 샘플을 얼음에 2 분 동안 정착하자. (비 - 해리 세포 펠렛을 건드리지 않고 ~ 0.6 ㎖)과 같은 15 ML 원뿔 튜브 # 1로 전송 뜨는를 수집합니다.
      참고 : 다음 분쇄 단계의 튜브 # 1에서 0.4 mm 직경의 피펫을 유지합니다.
    4. 단계를 반복 3.4.3 별도의 15 ML 원뿔 튜브에 3 개의 작은 유리 피펫 (~ 0.4 mm 직경)를 사용하여 시간 및 상층 액을 수집 (튜브 # 2).
    5. 0.4 mm 유리 피펫을 사용하여 10 회 이상에 대한 튜브 # 1과 # 2의 수집 세포 현탁액을 씹다과 얼음에 보관하십시오.

4. 셀 고정 및 Permeabilization

  1. 100 % 차가운 에탄올 800 μl를 추가하여 (튜브 # 2에서 셀 관 # 1에서 셀이 모세관과 2 개) 샘플 당 4 모세관을 준비 각각의 튜브에 (사용 전에 -20 ℃로 저장) 및 얼음에 보관하십시오 . 참고 : 최종 에탄올농도가 50 % 일 것이다.
  2. 피펫 ~ 800 냉 에탄올을 함유하는 튜브를 4 각으로 (튜브 # 1, # 2 튜브)에서 세포 현탁액 μL와 샘플을 혼합하여 튜브를 반전한다.
  3. 튜브를 5 분마다 반전하면서 15 분 동안 얼음에서 인큐베이션 튜브.
  4. 고정 / permeabilization 후, 4 ºC에서 4 분 동안 1,700 XG에서 튜브를 원심 분리하고 상층 액을 버린다. 세포의 손실을 방지하기 위해 용액 50 μl를 떠난다.
    참고 :이 단계에서 펠렛은 흰색이며, permeabilization 이전보다 튜브의 벽에 덜 스틱. 그러므로, 펠릿이없는 곳 마이크로 튜브의 벽을 터치하여 조심스럽게 상층 액을 제거하고 천천히 마이크로 피펫을 이용하여 상층 액을 그립니다.

5. 셀 여과

  1. 다음과 같이 차가운 PBS와 단계 4.4에서 펠렛을 다시 일시 :
    1. 튜브 # 1에서 나오는 두 개의 모세관 중 하나에 차가운 PBS 550 μl를 추가하고, 적당히 큰 직경의 파이를 사용pette 팁은 부드럽게 세포 현탁액의 상하 5 회 피펫합니다. 하나의 마이크로 튜브는 튜브 # 2에서 오는 동일한를 반복합니다.
    2. 동일한 피펫을 사용하여 튜브 # 1 셀, 제 2 펠릿 제 세포 현탁액을 전송. 부드럽게 결합 된 세포 현탁액의 상하 5 회 피펫 팅하여 두 번째 펠렛을 재현 탁.
    3. 튜브 2로부터 셀, 재현 탁 및 5.1.2에 기술 된 바와 같이 펠렛 (즉, 세 번째와 네 번째 모세관)를 결합한다.
  2. 별도로 셀 스트레이너의 두 개의 서로 다른 쌍 (100 μm의 40 μm의 기공 크기) 다음을 사용하여 단계 5.1.2과 5.1.3에서 두 세포 현탁액을 필터링 :
    1. 스트레이너의 내부에 PBS를 첨가하여 예비 습윤 각 셀 스트레이너. 스트레이너의 외부에서 과량의 PBS를 제거하기 위해 피펫을 사용합니다.
    2. 균일하게 100 μm의 세공 크기를 갖는 제 1 셀 스트레이너로 단계 5.1.2에서 세포 현탁액을 피펫. 얼음에 50 ㎖ 튜브에 관류 수집. 파이를 사용하여셀 스트레이너의 외측 저면에 부착 통해 pette는 플로우 기반을 수집한다.
    3. 40 μm의 셀 스트레이너로 100 μm의 셀 스트레이너에서 관류를 전송하는 동일한 피펫을 사용한다. 얼음 다른 50 ML 튜브에서이 흐름을 통해 수집합니다. 40 μm의 셀 스트레이너에서를 통해 흐름을 전송하는 경우, 100 μm의 셀 스트레이너에서 오염을 방지하기 위해 새로운 피펫 팁을 변경합니다.
    4. 필터의 새로운 세트를 사용하여 단계 5.1.3에서 세포 현탁액에 대해 이러한 단계를 반복합니다.
  3. 샘플 당 약 1 ml의 최종 용적은 각 시료로부터 두 관류 수확기.

항체 6. 배양

참고 : 이전에 주요 샘플을 실행에 설정 사이토 적절한 흐름을 설정하기위한 다수의 제어 샘플을 준비하는 뇌 세포 현탁액의 작은 분취 량을 사용합니다. 각 항체에 표지의 경우, 항체 만 자체를 포함하지 대조 시료를 준비다음 condary 항체 (또는 다른 형광 라벨), 두 일차 및 이차 항체 (또는 다른 형광 표지). 유동 세포 계수기의 비특이적 라벨링 대 특정 분리 문을 설정하는 이러한 컨트롤을 사용합니다. 가능하면 보상을 필요로하지 않는 형광 색소를 사용합니다. 이전에 일차 항체를 추가로 PBS를 첨가하여 700 ㎕의 최종 부피로 게이팅 대조 시료의 최종 부피를 증가시킨다.

  1. 1.7 ml의 마이크로 튜브로 여과 셀 100 μL 샘플을 전송함으로써 광산란 및 DAPI 제어 샘플을 준비한다. 핵 염색 1 μg의 / ㎖ DAPI와 차가운 PBS 600 μl를 추가합니다. 엔드 오버 엔드 혼합 10 분 동안 품어하고 (단계 6.4.5에 6.4.2에 표시된대로) 흐름 cytometer를 통과하기 전에 세척.
    참고 :이 샘플 만 FACS 기계에 남아있는 세포를 정렬하기 전에 셀 / 핵 게이트를 설정하는 데 사용됩니다.
  2. 100 & #을 전송하여 하나의 immunolabeled 제어 샘플을 준비(181), 1.7 ml의 마이크로 튜브에 필터링 된 세포의 리터. (예를 들어, NeuN 항체) 한 항체와 차가운 PBS 600 μl를 추가합니다. 다른 항체 (예를 들어,에 Fos 항체)와 마이크로 튜브에 차가운 PBS 600 μl를 추가합니다. 이 직접 접합 된 일차 항체가 아닌 경우, 해당 이차 항체를 추가한다.
    주 : 이들 샘플은 적절한 광전자 증 배관 (PMT) 전압을 결정하고, 필요하다면 두 개의 형광 신호의 중첩을 평가하기 위해 사용된다. 항체 농도는 모든 채널에서 최고의 신호 - 대 - 잡음 비율을 달성하기 위해 적정한다. 중복 형광 신호는 사이토 플로우 내의 상이한 형광 채널 내부 캘리브레이션에 의해 보상 될 수있다.
  3. 1.7 ml의 마이크로 튜브에 필터링 된 세포를 100 μl를 전송하여 이중 형광 표지 된 음성 대조군 샘플을 준비합니다. 혼자 차 항체 IgG를 직접 복합 일차 항체와 차가운 PBS 600 μl를 추가합니다.
    참고 : 티S 컨트롤 샘플은 각 형광의 배경 형광을 결정하기 전에 정렬 될 때마다 사용될 수있다.
  4. 주요 샘플을 준비하는 분류합니다.
    1. 1.7 ml의 마이크로 튜브로 필터링 된 세포를 700 μl를 전송합니다. 주 NeuN 항체의 피코 에리 트린 (안티 NeuN-PE)에 직접 결합 : 알렉사 플 루어 647 (항에 Fos-AF647) 1.4 μL (500 1)에 직접 결합 차에 Fos 항체 : 7 μL (100 일)를 추가합니다. 엔드 오버 엔드 혼합 4 ºC에서 30 분 동안 튜브를 품어.
    2. 인큐베이션의 끝에, 메인 시료 및 대조 시료를 포함하여 각 마이크로 튜브에 차가운 PBS 800 μl를 추가하고, 반전하여 혼합한다.
    3. 원심 분리기 모세관 4 ºC에서 3 분 동안 1,300 XG에. 세포 손실을 방지하기 위해 50 μl의 상층 액을 떠나, 상층 액을 버린다.
    4. 적당히 큰 팁 직경과 피펫을 사용하여 펠렛과에 resuspend 세포에 차가운 PBS 1 ML을 추가합니다.
    5. 4 ºC에서 3 분 동안 1,300 XG에 원심 분리기. 디뜨는을 iscard.
    6. 다시 정지 500 μL의 펠렛 차가운 PBS를 (최종 부피 펠렛의 크기를 따라 조정).
    7. 전송 및 셀 스트레이너 캡 (40 μm의)와 함께 둥근 바닥 FACS 샘플 튜브에 현탁액을 필터링 할 수 있습니다. 얼음에 immunolabeled 세포를 유지하고 즉시 FACS를 수행합니다. 참고 : 필터링의 경우, 스트레이너 캡에 수직으로 피펫 팁을 터치하고 그것을 통해 세포 현탁액을 누릅니다.
  5. 제어 샘플을 사용하여 게이트 사이토 설정 흐름.
    1. 전체 이벤트 및 세포 파편에서 신경 세포 인구를 식별하기 위해 광산란 및 DAPI 제어 샘플을 사용합니다.
      참고 : - 총 이벤트 (나머지는 파편과 깨진 세포 과정이다)의 2 %이 준비 세포 기관은 1입니다. DAPI 형광 신호 (표시 핵) 및 전달 산란 (셀의 크기)에 근거은 뒤로 앞으로 및 측면에 따라 세포 기관 및 게이트를 찾을 수의 속성을 광 산란셀 (도 1 A, B 참조).
    2. PMT를 전압 설정을 확인하고, 다른 필터 / 채널 (예를 들어, 알렉사 플 루어 488 / FITC 또는 Phycoerythrine)에 하나의 특정 형광 색소에서 배출의 유출을 분석 한 immunolabeled 제어 샘플을 사용합니다. 형광 신호가 겹치는 경우에는 수동으로 보정 레벨을 조정하여 중첩을 수정한다.
    3. 긍정적 인 인구에 대한 임계 값을 설정하는 이중 형광 표지 된 음성 대조군을 사용합니다.
      주 :이 샘플에서 나오는 신호는 양성으로 간주 될 수있는 자동 형광이 임계 값 위에있는 주요 시료의 세포에 의한 것으로 생각된다. 일반적으로, 정렬을위한 임계 파라미터는 더 엄격한 약 음성 대조군 상기 표지 셀의 상부 2/3 실제로 분류되어있다.
  6. 1.7 ML의 마이크로 튜브에 FACS에 의해 메인 샘플에서 정렬 뉴런. RNA의 50 μL로 세포를 수집추출 버퍼입니다. 정렬 와류 원심 분리 튜브 및 상기 튜브의 벽에 모든 정렬 균체를 회수 아래로 10 번을 피펫 팅에 의해 현탁 혼합 후.
  7. 모든 세포가 RNA 추출 이전에 용해되어 있는지 확인하고 4 ºC에서 2 분 동안 2,800 XG에 원심 분리기 30 분 동안 42 ºC에서 정렬 된 세포 현탁액을 품어.
  8. 13-15 앞서 설명한 바와 같이, RNA 분리, cDNA 합성, 표적 유전자 사전 증폭 qPCR에 대한 샘플을 처리 즉시 -80 ºC 장기 보존 용의 RNase가없는 튜브로 상청액을 전송하거나.

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결과

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급성 필로폰 주사 후 한 쥐에서 신선한 냉동 등쪽 선조체 조직 FOS를 양성과에 Fos 음이 신경 세포를 정렬.

위에서 설명한 프로토콜은 필로폰 (5 ㎎ / ㎏)의 복강 내 주사 후 한 쥐의 등쪽 선조체 90 분 FOS를 양성과에 Fos 음이 신경 세포를 정렬하기 위해 사용되었다. 자신의 홈 케이지에서 순진한 쥐를 대조군으로 사용 하였다. 지느러미 선조체 조직이 처리 된 중 즉시 모음 (신선한 조직) 또는 냉동 및 1, 7, 21 일 -80 ºC에 저장 후 처리 후. 이러한 동결 시점의 결과는 서로 차이가 없었다 때문에 데이터 모았다.

악기에 정렬 조건을 설정하려면, 하나 홈 케이지 제어 또는 methampheta에서 (전술) 제어 샘플내 주입 그룹이...

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토론

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FACS는 어느 신선하거나 냉동 성인 뇌 조직의 신경 세포 및 다른 세포 유형을 정렬하기 위해 사용될 수있다. 서론에서 언급 한 바와 같이, 냉동 조직을 사용하는 능력은 중독 연구에 자기 관리 및 재발 연구 등 복잡하고 연장 된 행동 절차를받은 동물에서 샘플의 최적 활용을 할 수 있습니다. 2 시간 이상, 모든 동물이 필요합니다 - 이러한 행동 절차는 보통 1 소요됩니다 - 같은 날 13,18 테스트 할 (10 ~ 20 총). 그것은 뇌 해부, 세포 분리, permeabilization 및 immunolabeling를 포함 4 갓 해부 뇌 조직 샘플을 처리하기 위해 ~ 4 시간이 걸립니다. 30 분 - 처리 후, FACS에 의해 각각의 샘플을 분류하면 (20) 사이에 걸립니다. 용해 버퍼에 정렬 된 셀을 가열하고 최종 단계는 추가로 30 분을 필요로한다. 총 ~ 7 시간은 최종 RNA 함유 세포 용해 액 단계로 뇌 해부에서 필요합니다. 그러나, 전체 꼰 로프를 고정 할 수있게되었습니다NS 또는 갓 즉시 테스...

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 작업은 NIDA 교내 연구 프로그램(Bruce T. Hope, Yavin Shaham)의 지원을 받았습니다.F.J.R.은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)이 후원하고 오크리지 과학교육연구소(Oak Ridge Institute for Science and Education)가 관리하는 NIDA 연구 참여 프로그램(Research Participation Program)에 임명되어 지원을 받았으며, CONICYT 및 Universidad de los Andes가 관리하는 Becas-Chile 장학금으로부터 추가 재정 지원을 받았습니다. 칠레 산티아고. 존스 홉킨스 FACS 핵심 시설은 미국 국립보건원(National Institute of Health)의 국립 관절염 및 근골격 및 피부 질환 연구소(National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases)로부터 P30AR053503 수상의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
브레인 매트릭스CellPoint Scientific69-2160-1관상 뇌 절편을 얻기 위해
Hibernate A 저형광Brain BitsHA-lfBuffer A는 프로토콜의 해리에서 고정 단계까지 조직과 세포를 처리하는 데 사용됩니다
프로토콜의 AccutaseMilliporeSCR005효소 용액은 trituration
전에 조직의 효소 분해에 사용됩니다.Protein LoBind Tube 1.5 ml, 프로토콜중 세포 손실 방지를 위한PCR clean Eppendorf22431081
Cell Strainer, 40 µ mBD Falcon352340- 세포 현탁액
Cell Strainer, 100 µ mBD Falcon352360세포 현탁액을 필터링하기
Falcon 5 ml 라운드 바닥 폴리스티렌 시험관 세포 여과기 스냅 캡BD Bioscience352235통과하기 전에 세포 현탁액을 필터링하기 위해
, 유리NIH 공급6640-00-782-6008조직 분쇄
Milli-Mark Anti-NeuN-PE, 클론 A60 (마우스 단클론) 항체EMD MilliporeFCMAB317PE뉴런을 감지하는 항체
Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate) 세포 신호 전달 기술 Fos 발현 세포를 검출하는8677
DAPISigmaD8417은 핵
PicoPure RNA 분리 키트Applied BiosystemsKIT0204이 키트에는 6.14단계를 위한 RNA 추출 버퍼가 포함되어 있습니다. RNA
에서 cDNA를 합성하기 위해Superscript III 첫 번째 가닥 cDNA 합성 시스템Invitrogen18080-051
.cDNA
TaqMan Advance Fast Master응용 바이오시스템.TaqMan 프로브를 사용하여 PCR을 수행하는4444963
Fos TaqMan 프로브Applied Biosystems.Rn00487426_g1TaqMan 프로브/primers
NeuN TaqMan 프로브Applied Biosystems.CACTCCAACAGCGTGAC뉴클레오티드 서열
NeuN Forward primerApplied Biosystems.신경 유전자 마커에 대한GGCCCCTGGCAGAAAGTAG
NeuN 리버스 프라이머응용 바이오시스템.TTCCCCCTGGTCCTTCTGA뉴클레오티드 서열
Gfap TaqMan 프로브응용 바이오시스템.Rn00566603_m1 astrocityc 유전자 마커용 TaqMan 프로브/프라이머
iba-1 TaqMan 프로브응용 바이오시스템.Rn00574125_g1 마이크로글리아 유전자 마커용 TaqMan 프로브/프라이머
Gapdh TaqMan 프로브Applied Biosystems.참조/하우스키핑을 위한CTCATGACCACAGTCCA
Gapdh Forward primerApplied Biosystems.참조/하우스키핑을 위한GACAACTTTGGCATCGTGGAA
Gapdh Reverse primerApplied Biosystems.참조/하우스키핑을 위한CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA
Oligo2 TaqMan 프로브Applied Biosystems.Rn01767116_m1 희소돌기아교세포 유전자 마커를 위한 TaqMan 프로브/프라이머
P1000 피펫터Rainin17014382경증 조직 분쇄의 경우 3.1 및 3.3 단계, 세포 재현탁을 위한 6.7 단계에서 팁 직경이 큰 피펫으로 언급됩니다
7500 Fast Real-time PCR 시스템Applied Biosystems.정량 PCR
FACSAria I 세포 분류기BD BiosciencesFACS 분류를 위한
은 위해 유세포 분석기 파스퇴르 피펫을 항체를 라벨링합니다. TaqMan PreAmp Master Mix Applied Biosystems분류된 세포을 수집하는 데 사용됩니다에서 표적 사전 증폭을 수행하는 4391128 방법 신경 유전자 마커에 대한 뉴클레오티드 서열신경 유전자 마커에 대한 뉴클레오티드 서열 뉴클레오티드 서열 뉴클레오티드 서열. 446985

참고문헌

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