신장 면역 세포를 분리하기 위해 신뢰할 수 있고 효율적인 기술이 다운스트림 응용 프로그램에 필요합니다. 이를 위해서는 소수의 신장 면역 세포에 대한 표면 항체 라벨링이 필요합니다. 여기에서는 이 목표를 달성하는 것처럼 보이는 신장 면역 세포를 분리하는 간결한 방법을 설명합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
면역 체계 활성화는 여러 신장 질환 및 병태 생리학적 과정에서 발생합니다. 면역 체계는 적응 및 선천성 구성 요소와 여러 세포 유형으로 구성됩니다. 때때로, 관심 세포 유형은 신장에서 분리된 많은 수의 전체 세포 중에서 매우 적은 수로 존재합니다. 따라서 신장 단핵 세포 집단의 안정적이고 효율적인 분리는 신장 질환과 관련된 면역학적 문제를 연구하는 데 중요합니다. 전통적으로 신장 단핵 세포의 조직 분리는 다양한 수와 강도의 콜라겐 분해 효소/DNA를 사용하여 다양한 수의 생존 가능한 면역 세포를 생성하는 효소 분해를 통해 수행되었습니다. 최근에는 단일 세포 분리를 위한 기계적 조직 교란 물질이 개발됨에 따라 콜라겐분해 효소 분해 단계는 피하고 마우스에서 추출한 후 신장의 단순한 기계적 파괴로 대체되었습니다. 여기에서는 매일 면역 세포를 추출하기 위해 신장 단핵 세포를 분리하는 간단하면서도 효율적인 방법을 보여줍니다. 또한 신장 내 면역 세포의 하위 집합 분석의 예를 보여줍니다. 중요한 것은 이 기술이 간 및 뇌와 같은 다른 연조직 및 비섬유성 조직에 적용할 수 있다는 것입니다.
서론
면역 시스템의 활성화는 여러 신장 질환 및 병태 생리 학적 과정 6,10,11,13에서 발생합니다. 활발한 연구 발생할 수있는 영역은 면역계의 활성화를위한 다양한 트리거들을 포함, 다양한 세포 유형과 관련된 특정 질환 속에서 사이토킨 / 케 모킨 패턴 등 특정 약물에 의한 상기 프로세스의 모두의 조절은 국소 빈혈 - 재관류에 예증 상해 (급성 신부전에 대한 모델), (6 주 이상) 5 수리 또는 섬유증의 기간을 통해 유지된다 몇 시간 내에 조혈 세포 또는 CD45 + 세포 유래 면역 세포 또는 골수의 증가가,가, 12. 이들 면역 세포가 복구 5,12- 과정을 조율하는 염증성 및 항 염증성 사이토 카인 및 케모카인을 분비 모두. 현재, 단일 세포 현탁액으로 세포 집단 라벨을 동시에 다수의 형광체를 사용할 수있는 능력은 광고와 증가4 ~ 5 레이저와 기계 계측법 현대적인 흐름을 배출. 이것은 실질적으로 자신의 기능 상태 3,7에 따라 세포 집단을 구별하는 기능을 추가했습니다. F4 / 80 로우는 CD11b 고 Ly6b 높은 CD206 낮은 적어도 3 개의 형광체는 생균, CD45 + (백혈구) 및....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
수행 모든 프로토콜 단계 검토와 미주리 동물 관리 및 사용위원회의 대학 (ACUC)에 의해 승인되었다. 모든 연령에서 이론적으로 모든 설치류 실험에 사용할 수 있지만,이 프로토콜의 경우, 15주 세 남성 C57BL / 6 마우스를 사용 하였다. 이 비 생존 수술 때문에 안락사 방혈 및 양자 기흉에 의해 달성된다.
신장의 1 관류
참고 : 심장, 간, 신장 등 장기의 관류 데이터의 해석을 방해 할 수 혈액을 제거합니다. 가능하면 따라서, 우리는 항상 장기를 관류.
- 그것은 움직이지 될 때까지 (3 ml / 분) 유도 챔버 이소 플루 란에 마우스를 놓습니다. 다음으로, 챔버에서 마우스를 제거 해부 테이블에 등쪽를 놓고 마우스 코의 이소 플루 란 콘을 배치하고 조절을 통해 1.5 ml / 분의 속도로 이소 플루 란을 누릅니다.
- 발가락 핀치 응 답을 확인동물 마취의 수술 비행기를 달성 한 경우 핀셋 전자는 평가합니다. 식염수 복부 복부를 청소하고 가위로 복부를 열고 잘라 마우스의 왼쪽에 (수술 분야 중) 복부 장기를 밀어 넣습니다.
- 과 하대 정맥에서 혈액을 수집 25 게이지 1 cc의 주사기에 바늘 고정 0.5M EDTA의 10 μl를....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
실행될 수있는 패널들의 수를 확실하게 신장에서 추출 될 수 면역 세포의 수에 의존한다. 여기서, 우리는이 패널, T 림프구 용 및 대 식세포 / 수지상 세포를 실행할 수있는 능력을 입증한다. T 림프구 패널에서, 우리는 먼저 앞으로 분산 형 (FSC)와 사이드 분산 형 (SSC) 패턴을보고 그림 1 (왼쪽 상단 도트 플롯)과 같이 관심의 인구를 묘사. 다음에, 생존 마커,이 경우에는 정착 생존 얼룩 (FVS510)의 분석 (도 1, 탑 중간 도트 플롯)에서 죽은 세포를 배제하기 위해 사용된다. CD45 골수 유래 조혈 세포 마커는 일반적으로 신장의 면역 세포를 묘사하기 위해 사용되며, 이들은 일반적으로 나이, 성별, 변형에 따라 전체 신장 면역 세포 2-18 %에서 다양 마우스 염증성 상태 (도 1, 오른쪽 상단 도트 플롯). CD45의 +에서 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
우리는 여기에서 안정적이고 효율적으로 신장에서의 면역 세포를 얻을 수있는 방법을 제시 하였다. 널리 사용되는 콜라겐 분해 공정 (조직의 기계적인 파괴)에 대한 주요 변경은 약 30 분 동안 저장하고, 가능한 면역 세포의 다수의 분리 4 신장 샘플 하에서 2 시간 걸린다. 또한, 연구의 질문에 따라, 우리는 이제 하나의 신장을 사용하는 우리의 면역 세포 분리를위한 (다른 신장은 웨스턴 블랏, PCR에 의한 면역 조직 화학 및 mRNA의 분석에 의한 단백질의 분석을 위해 사용될 수 있음) 일상적 ~ 2 × 106 세포를 얻을 격리 당. 우리는 간, 심장에서 면역 세포의 대량 분리하는이 방법을 사용했다 (기계 파괴와 함께 심장에 멀티 효소 소화, 데이터는 도시하지 않음)하지만 기계적인 파괴가 같은 다른 비 섬유 조직에 적용 할 수 있다고 확신 뇌 16.
모든 프로토콜과 마찬가지로입니다하기세부 사항을 준수하는 것은 성공을 위해 중요하다, 조직에.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 아무것도 없어.
감사의 글
이 연구는 Dialysis Clinics Inc.와 University of Missouri Research Board Grant의 연구 보조금으로 지원됩니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Stomacher 80 Biomaster 실험실 시스템 | Seward | ||
| Stomacher 80 클래식 가방 | Seward | BA6040/STR | |
| Sorvall Legend XFR 원심분리기 | Thermo Scientific | 또는 동등한 장비 | |
| 헤모사이토미터 | 전자 현미경 과학 | 63514-11 | |
| 분석 플로우 사이토미터 | BD LSR-X20 Fortessa | ||
| Percoll | 시그마 | P1644 | |
| 둘베코 s 인산염 완충 식염수 1x (DPBS) | Gibco, Life Technologies | 14190-250 | |
| 폴리프로필렌 튜브, 캡 없음 | Becton Dickinson | 352002 | |
| 고정 가능한 생존력 스테인 | BD Biosciences | FVS510, 564406 | |
| Anti-CD16/32 (클론: 93) | EBioscience | 14-0161 | |
| anti-CD45 (클론: 30-F11) BV421 | BD Pharmingen | 103133/4 | |
| Anti-Foxp3 (클론: FJK-16s) APC | EBioscience | 17-5773 | |
| Anti-CD127 (클론: A7R34) PE/Cy7 | Biolegend | 135013/4 | |
| anti-CD44 (클론: IM7) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 103031/2 | |
| anti-CD4 (클론: RM4-5) APC-Cy7 | Biolegend | 100413/4 | |
| anti-CD8 (클론: 53-6.7) BV785 | Biolegend | 100749/50 | |
| Anti-Ly6G (클론: 1A8) FITC | Biolegend | 127605/6 | |
| Anti-CD11b (클론: M1/70) PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 101227/8 | |
| Anti-F4/80 (클론: BM8) APC | Biolegend | 123115/6 | |
| Anti-CD11c (클론: N418) BV785 | Biolegend | 117335/6 | |
| Anti-CD301 (클론: LOM-14) PE-Cy7 | Biolegend | 145705/6 | |
| Anti-CD26 (클론 : H194-112) PE | Biolegend | 137803/4 | |
| 100 μ M 필터 | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Fisherbrand 튜브 50ml | Fisher | 또는 이와 동등한 장비 | |
| Fisherbrand 튜브 15 ml | Fisher | 또는 동등한 장비 | |
| 설탕 | 피셔 화학물질 | S5-3 | |
| 전송 피펫 세밀한 팁 | Samco Scientific | 232 | 또는 동등한 장비 |
| 플로우 사이토메터리 염색 버퍼 용액 | EBioscience | 00-4222-26 | 또는 동등한 장비 |
| 1x RBC 용해 버퍼 | EBioscience | 00-4333-57 | 또는 동등한 장비 |
참고문헌
- Ascon, D. B., et al. Phenotypic and functional characterization of kidney-infiltrating lymphocytes in renal ischemia reperfusion injury. J. Immunol. 177 (5), 3380-3387 (2006).
- Ascon, M., et al.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
