신 재생 바이오 연료 및 생물 생산에 대한 자유로운 효모의 유전 공학

Ai-Qun Yu; Nina Pratomo; Tee-Kheang Ng; Hua Ling; Han-Saem Cho; Susanna Su Jan Leong; Matthew Wook Chang

doi:10.3791/54371

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방법 논문

신 재생 바이오 연료 및 생물 생산에 대한 자유로운 효모의 유전 공학

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DOI:

10.3791/54371

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2016년 9월 20일

Ai-Qun Yu¹^,² , Nina Pratomo¹^,² , Tee-Kheang Ng¹^,² , Hua Ling¹^,² , Han-Saem Cho¹^,² , Susanna Su Jan Leong¹^,²^,³ , Matthew Wook Chang¹^,²

¹Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, ²NUS Synthetic Biology for Clinical and Technological Innovation (SynCTI), Life Sciences Institute, National University of Singapore, ³Food Science and Chemical Engineering, Singapore Institute of Technology

이 논문에서

요약

우리는 유전자 결실 효율 향상을 위한 Yarrowia lipolytica Po1g 균주의 분자 유전자 조작에 대한 방법을 보고합니다. 그 결과 엔지니어링된 Y. lipolytica 균주는 바이오 연료 및 생화학 생산에 잠재적으로 응용될 수 있습니다.

초록

Yarrowia의 lipolytica는 비 병원성 동종 이형 엄격 호기성 효모 종입니다. 독특한 생리 기능과 신진 대사 특성으로 인해,이 틀에 얽매이지 않는 효모뿐만 아니라 곰팡이 차별화의 기본 성격의 연구를위한 좋은 모델뿐만 아니라 생화학 적 생산과 광범위한 유전자 조작을 필요로 다양한 생명 공학 응용을위한 유망한 미생물 플랫폼입니다. Y.의 그러나, 유전자 조작 lipolytica 인해 주로 KU70 유전자에 기인 할 수있는, 효율적이고 안정적으로 유전자 형질 전환 시스템의 부족뿐만 아니라 비 - 상 동성 재조합의 매우 높은 속도로 제한되었다. 여기, 우리는 효율적인 유전자 변환에와 Y 유전자 삭제 쉽고 빠른 프로토콜을보고 lipolytica PO1G. Y.로 외래 DNA의 효율적인 변환을위한 우선, 프로토콜 lipolytica PO1G가 설립되었다. 세코ND, 표적 유전자의 추가적인 삭제 향상된 이중 교차 상동 재조합 율을 달성하기 위해 유전자는 KU70 1킬로바이트 동성 암 반송 파쇄 카세트 바뀌는 삭제 하였다. 셋째, KU70 유전자의 삭제 후 향상된 유전자 결실 효율을 입증하기 위해, 우리는 개별적 KU70 녹아웃 플랫폼 균주에서 동일한 절차를 사용하여 알코올 탈수소 효소, 알코올 산화 효소를 코딩하는 11 표적 유전자를 삭제. 이것은 정확한 상동 재조합 속도가 삭제 0.5 % 미만에서 실질적으로 증가하는 것이 관찰 PO1G KU70 Δ 11에서 표적 유전자의 단일 유전자 결실에 대한 33 % -71 %의 PO1G에서 KU70 유전자. 하이 그로 마이신 B 내성 마커와 Cre 호텔 /에 loxP 시스템을 운반하는 복제 성 플라스미드를 구축하고, 효모 녹아웃 균주의 선별 마커 유전자는 결국 타지 여러 발사를 용이 Cre 호텔 재조합 효소의 발현에 의해 제거테드 유전자 조작. 그 결과 단일 유전자 삭제 돌연변이 생물 연료 및 생화학 생산에 응용 가능성이 있습니다.

서론

사카로 마이 세스 세레 비지에, Yarrowia의 lipolytica, 비 전통적인 효모와는 달리, 환경 조건의 ^{1, 2의} 변화에 대응하여 효모 또는 균사의 형태로 증가 할 수 있습니다. 따라서,이 동종 이형 누룩 곰팡이 분화, 형태 형성 및 분류 ^3,4,5- 연구를위한 좋은 모델로서 사용될 수있다. 이것은 일반적으로 널리 유기산, 폴리 알콜, 아로마 화합물, 유화제 및 계면 활성제로 ^-6,7,8,9- 식품 첨가물의 종류를 생성하기 위해 사용되는 안전한 (GRAS) 효모 종으로 간주된다. 이는 최대 ¹⁰ 세포 건조 중량의 70 %를하기 위해, 의무적의 aerobe 자연스럽게 다량으로 지질을 축적 할 수있는 공지의 유성 효모, 즉이다. 또한 영양소 ^11,12,13 같은 폐 자원 잔기의 종류를 포함한 성장 탄소원의 넓은 스펙트럼을 이용할 수있다. 이러한 독특한 기능은 모두 Y.을 매우 매력적인 lipolytica다양한 생명 공학 응용 프로그램.

Y.의 전체 게놈 서열 비록 lipolytica가 ^{14, 15을} 게시되었....