의료 기기에 대한 박테리아의 높은 처리량 식별 구충제 폴리머

요약

의료 기기에서 박테리아 표면 결합을 감소시키는 폴리머를 식별하기 위한 고처리량 마이크로어레이 방법에 대해 설명합니다.

초록

의료 기기는 종종 병원 감염과 관련이 있으며, 이는 환자와 의료 시스템에 엄청난 부담을 줄 뿐만 아니라 항생제 내성에 기여합니다. 기기 관련 감염을 줄일 수 있는 한 가지 방법은 이러한 기기에 대한 박테리아 방지 폴리머 코팅을 식별하는 것이며, 이는 초기 부착 단계에서 박테리아 결합을 방지합니다. 마이크로어레이를 사용하여 수백 개의 중합체의 병렬 스크리닝에 기초한 이러한 반발성 중합체의 식별을 위한 방법이 여기에 설명된다. 이 고처리량 방법을 통해 임상적으로 관련된 다양한 박테리아 종의 결합에 저항하는 다양한 유망한 폴리머를 개별적으로 그리고 다중 종 군집으로도 식별할 수 있었습니다. 하나의 폴리머인 PA13(폴리(메틸메타크릴레이트-코디메틸아크릴아미드))은 시판되는 두 개의 중심정맥 카테터에 코팅되었을 때 여러 병원 분리물의 부착을 현저히 감소시켰습니다. 설명된 방법은 박테리아 부착의 변형이 중요한 광범위한 응용 분야를 위한 폴리머를 식별하는 데 적용될 수 있습니다.

서론

고분자 마이크로 어레이는 최대 7,000 폴리머 ⁽¹⁾ 원핵 또는 진핵 세포 ² 병렬 분석을 위해 유리 슬라이드에 인쇄하는 높은 처리량 플랫폼을 소형화하고 있습니다. 여기에 제시된 방법은 우리가 처음 2010 ^3에 기술 된 것을 바탕으로.이 검사 시스템은 인간의 간세포 ^4, 줄기 세포 ^5, 신 세뇨관 상피 세포 ^2, 박테리아 ^3,6 및 원생 동물 병원균 ⁽⁷⁾ 등 다양한 세포 유형에 적용되었습니다. 각각의 경우에, 촉진 또는 연구중인 세포의 결합을 레지스트 중합체 ^8을 확인 하였다. 합성 다양 이온 중합체와 DNA의 복합체는 유전자 형질 전환 후보 ^(9)의 하이 스루풋 스크리닝하기위한 마이크로 어레이 형태로 사용되어왔다. 뿐만 아니라, 세포 기질 상호 작용에 대한 스크리닝으로, 중합체 마이크로 어레이는 재료의 특성 ^(10)을 평가하기 위해 사용되었다.

"> 표면에 박테리아의 부착을 조절하는 합성 중합체의 능력은 잘 ^{3,6,11 설립된다.} 발견 생체 재료의 박테리아 결합. 종래의 방법에 영향을 미치는 것으로 공지되어 전하, 소수성 고분자 표면의 표면 거칠기 등 다양한 요인 즉, 순차적으로 박테리아의 결합 또는 실험적 설계 및 한번에 하나의 재료를 테스트 레지스트 노동 집약적이고 비용이 많이 들고 시간 소모적 인 프로세스이다. 폴리머 마이크로 어레이는 이러한 한계를 회피에 대한 매력적인 대안을 제공한다.

복잡한 인구는 바이오 필름을 지칭로 표면 관련된 박테리아 성장 - 같은 바이오 필름이 많은 환경 스트레스와 항생제에 높은 내성. ^{이는도 12} (단백질, 다당류 및 핵산으로 구성된)들이 고밀도 세포 외 기질에 부분적으로 기인 생물막 ¹³ 강력한 "persistor"세포의 증가의 존재에 부분적으로있다. Altho^{16 -} 우 표면 연관 이후 바이오 필름 형성의 정확한 메커니즘을 특성화하기 어려운, 일반적으로 성장 표면 ^(14)의 세 가지 단계가 있다고 생각된다. 초기 가역 첨부 세포 강한 접착 뒤에, 세포 외 단백질의 생산 및 다당류 매트릭스 및 세포 증식에 ​​의한 바이오 필름의 확립. 마지막으로, 성숙한 생물막 릴리스는 다른 새로운 감염을 시작할 수 있습니다 플랑크톤 세포를 자유롭게 살고. 박테리아의 초기 부착을 방지하고, 따라서 생물막 형성의 초기 단계를 방지 폴리머 세균이 격퇴, 잠재적으로 감염을 최소화하기위한 우수한 솔루션을 나타냅니다. 항생제 내성의 상승을 감안 (및 관련 박테리아 표면 ^(12)의 본질적으로 큰 저항), 감염을 감소 항생제가없는 수단은 특히 중요하다. 병원 환경에서, 중합체를 박테리아는 격퇴코팅은 일반적으로 주위에 이식 장치 ^(17)를 형성 원내 감염의 감소에 직접적인 의료 응용 프로그램을 사용할 수 있습니다.

여기서, 히트 검증 및 후속 코팅 및 중앙 정맥 카테터 재료의 분석에 선행 원내 감염과 관련된 병원균의 범위에 대해 반발 활동 381 중합체의 스크리닝을위한 높은 처리량의 방법은 (도 1)를 설명한다. 간략하게, 중합체는 건조 및 살균 한 후, 소형화 배열은 임상 적으로 중요한 세균 배양으로 배양, 연락처를 인쇄하여 아가 로스 코팅 된 유리 슬라이드에 발견 하였다. 배양 한 후, 마이크로 어레이를 부드럽게 세척하고 부착 세균 세포는 형광 염색에 의해 가시화 하였다. 이어서, 결합 세균 억제 중합체는 유리 커버 슬립 위에 코팅하여 대규모로 조사하여 전자 현미경에 의해 가시화 하였다. 선정 반발빌려준 중합체는 상업적 카테터 상에 도포하고, 거의 100 배의 박테리아 부착을 감소시키기 위해 도시되었다.

프로토콜

아가로 오스 코팅 슬라이드 1. 준비

주 : 중합체 마이크로 어레이를 제조하기 전에, 아미노 알킬 - 코팅 유리 슬라이드가 비특이적 백그라운드를 최소화하고 결합 또는 박테리아 ^{6 반발} 중합체의 평가를 허용하는 아가 IB로 코팅된다. 실란 코팅은 슬라이드로 오스의 결합을 용이하게한다.

1. 2 %를 차지하는 250 ml의 병에 증류수에 아가로 오스 IB의 용액 (/ V w).
2. 용해 될 때까지 느슨하게 병 캐핑 후 30 초 기간에 전자 레인지의 현탁액을 가열한다. 뚜껑이 단단히 잠재적 인 압력 축적을 방지하기 위해 폐쇄되지 않았는지 확인합니다. 정기적으로 병을 제거하고 부드럽게 소용돌이 친다.
3. 고체가 용해 된 것을 확인한 후, 용액을 알 수있다. 액체 용액을 유지하기 위해 65 ℃의 수욕이 아가 100㎖의 비이커에 용액과 장소를 붓는다.
4. 상기 아가로 오스 용액에 실란 - 코팅 슬라이드를 담근 균일 한 코팅을 보장 및 Wi조직 종이 슬라이드의 뒷면 퍼가기.
5. (찬장 안에, 예를 들어, 또는 후드를 연기) 먼지가없는 환경에서, 코팅 된면을 위로하여, 슬라이드를 건조 24 시간의 최소.
6. 육안 검사에 의해 균일 한 코팅을 확인합니다. 축합 코팅 영역을 형성하는 것 - 코팅이 용이하게 슬라이드에 호흡에 의해 평가 될 수있다. 전체적으로 균일하게 코팅 만 슬라이드는 마이크로 어레이 인쇄에 사용되어야한다.

인쇄를위한 폴리머 솔루션의 2. 준비

1. 용액 준비 (/ w 1 % V)을 유리 바이알에 N 메틸 피 롤리 돈 (NMP)의 폴리 아크릴 레이트, 폴리 아크릴 아미드 및 폴리 우레탄으로 구성된 예비 형성된 중합체의 선택. (폴리머 각각 1 ㎖를 제조). 중합체까지 소용돌이를 완전히 용해시킨다. 고분자의 합성은 다른 곳에서 ⁶ 설명한다.
2. 마이크로 피펫을 사용하여 어떠한 크로스 접점이 없다는 것을 보장 25 μL 중합체 용액 384 마이크로 웰 플레이트의 각 웰을 채워mination 및 각 웰은 고유 한 폴리머가 포함되어 있습니다. 2 개 이상의 우물에서 부정적인 컨트롤로 NMP를 사용합니다. 잘 플레이트 템플릿 또는 스프레드 시트 파일에 각 웰에 고분자 용액의 ID를 기록합니다.

3. 인쇄 폴리머 마이크로 어레이 연락처 프린터 사용

주 : 마이크로 어레이 인쇄 접촉 프린터를 사용하여 수행 하였다. 고분자 마이크로 어레이 인쇄에 대한 구체적인 지시 사항은 다음과 같습니다. 프린터 및 안전 권고를 사용하는 방법에 대한 일반적인 지침은 제조업체의 사용 설명서를 따르십시오. 우리는 접촉 프린터를 사용할 수 있지만, 적합한 설명서 스탬핑 장치도 사용될 수있다.

1. 프린터 사용자 매뉴얼에 권고 된 바와 같이, (8 행과 4 열로 배열) 32 핀 microarraying 헤드를 사용, quadruplicates에서 384 액체 (고분자 용액 또는 NMP)의 인쇄를 할 수있는 루틴 (단계 3.3 참조)를 작성합니다.
2. 48 행 32 열로 배열 된 1,536 명소를 인쇄합니다. 12 절에 인쇄 루틴을 프로그램그래서 S, 즉. 한번에 32 솔루션은 프린터 핀 세정 수 있도록 각 부분을 인쇄 후 정지 될 수있다.
3. 인쇄 루틴을 만들려면 :
   1. 소프트웨어를 열고 사용 가능한 옵션 선택에서 '새 루틴 만들기'. 실험의 입력 정보에 대한 '설명'탭을 선택합니다. '머리'탭을 선택하고 '32 -PIN microarraying 머리 '를 선택합니다.
   2. '소스'탭을 선택하고 판 홀더 (소스 플레이트 홀더 (× 5)), 판 타입 (X 6,000 판 (384)), 전체 판을 선택 (1)과 (열로) 소스 순서.
   3. 탭 '슬라이드 디자인'에서 '3 ×', '슬라이드 선택'에 의해으로 배열 선택 '필드 번호'. 그런 다음 '들을 배열 패턴'를 선택합니다. 입력 '레이아웃'과 '행 수'로 '패턴 치수'로 '스팟보기'(6), '열 카운트'(8), '행 피치'(750)와 '열 피치'(560). 전나무를 인쇄 한 부분을 선택티.
   4. '슬라이드 레이아웃'탭 입력에서 슬라이드의 수는 인쇄에 사용. 입력 (잉크 당 우표의 수 : 1, 지점 당 우표 번호 : 시간 스탬프 5 : 200 밀리 초, 시간을 잉킹 : 100 밀리 초)을 인쇄 매개 변수를 '인쇄'탭을 선택합니다.
      참고 : 루틴이 지금 (8 행과 4 열로 배열) 32 핀 microarraying 헤드를 사용, quadruplicates에 384 액체 (고분자 용액 또는 NMP)을 인쇄하기 위해 만들어집니다. 총 루틴은 48 행과 750 μm의 행 피치와 560 μm의의 열 피치 (32) 열로 배열 된 1,536 점을 인쇄해야합니다.
4. 플랫폼에 아가로 오스 코팅 된 슬라이드를 놓고 위치에 슬라이드를 유지하는 좋은 진공 밀봉을 보장합니다.
5. 모든 핀은 같은 높이에있다 그래서 프린트 헤드를 조정합니다. 수동으로 유리 슬라이드에 머리를 낮추고 핀이 동시에 이동하는 것이 확인하여이 옵션을 선택합니다. 높이와 불일치가있는 경우 sleev를 사용하여 조정핀 위 또는 아래에 전자.
6. 올바른 방향으로 판 홀더, 예. 잘 A1 홀더의 상단 오른쪽에에 잘 판을 놓고 웰 플레이트에 단단히 고정되어 있는지 확인합니다.
7. 높이 조절기를 사용하여, 판 홀더의 높이가 고분자 용액을 픽업 할 때, 핀은 웰의 바닥에 접촉하지 않도록인지 확인.
   참고 :이하여 교차 오염을 일으키는 원인이 인접 우물에 고분자 용액의 유출되지 않도록 또한 균일 한 고분자 안보에 대한 중요하고 있습니다.
8. '시작'탭을 선택하고 '정상'과 '실행 형'을 선택합니다. '실행'을 클릭하고 해당 슬라이드, 웰 플레이트를 확인, 등, 메시지가 표시되면 위치에 있습니다.
9. 섹션 사이의 핀 청소 수, 시간 (12 절 한 번에 32 솔루션)에서 1 섹션을 인쇄 할 수 있습니다. 핀이 완전히 건조하기 위해 건조 티슈 페이퍼 다음에 철저히 종이 타월과 아세톤에 담근 핀을 청소합니다.
10. 마이크로 어레이의 인쇄가 완료되면 슬라이드 홀더에 배치 오븐 폴리머 지점에서 NMP를 제거하기 위해 45 ° C로 설정 진공에서 하룻밤을 건조. 30 분 동안 자외선으로 살균 한 후, 마이크로 어레이는 박테리아의 접종에 대한 준비가되어 있습니다.
11. (섹션 5에 설명 된대로) 박테리아 슬라이드를 접종하기 전에 배경 형광의 측정을. 세균 바인딩의 계산이 측정을 사용합니다.

박테리아와 고분자 마이크로 어레이 4. 예방 접종

주 : 좋은 무균 기술을 확인합니다. 문화의 모든 처리는 무균 환경에서 수행해야합니다 분젠 버너를 사용하거나 흐름 후드에서 중. 배양 각 종의 요구로 조정 산소 가용성 성장 배지 및 온도에서 성장한다.

1. 5 ml의 루리아 - 베르 타니 액체 배지 (LB 접종하여 하룻밤 문화를 준비 : 10g의 L ^-1 박토 - 트립 톤, 5g L ^-1의 NaCl, 및 10g의 L를 ^{-1 접시에서 식민지 효모 추출물). 200 rpm으로 떨고, 37 ° C에서 밤새 품어.}
2. 글리세롤 (10 % 농도 전체)을 첨가하여 하룻밤 문화의 냉동 주식을 준비하고 -80 ° C에서 주식을 저장합니다.
3. 해동 된 박테리아 보유 샘플에서 세포 수를 결정하기 위하여, 각 주식의 연속 희석을 수행하고, 고체 배지에서 밤새 박테리아 성장. 주식에서 세포 수의 정확한 결정은 각 종 ^6의 적절한 접종을 보장합니다.
4. 마이크로 어레이에 대한 접종을 준비합니다. 단일 종 문화는 위의 성장과 마이크로 어레이에 직접 적용됩니다. BacMix-1 폐렴 간균 (K. pneumoniae에), 포도상 saprophyticus (S.의 saprophyticus)과 황색 포도상 구균 (S. aureus에)의 세균 혼합물이다. BacMix-2는 스트렙토 코커스 뮤 탄스 (S. mutans에) 구성된 박테리아 혼합물 인, 에스. 구균 , K. 폐렴 및 엔테로 코커스 패 칼리스 (E. 칼리스).
5. 하나의 혼합 문화를 생산하기 위해 동일한 볼륨 (3 ㎖ 각)에 overnights을 혼합하고 신선한 LB와 (약 50 ml의 최종 볼륨) 네 번 희석.
6. 직사각형의 4 웰 플레이트에 UV 살균 고분자 마이크로 어레이를 놓고 5 일 동안 교반과 (30 RPM)와 37 ° C에서 혼합 세균 배양의 6 ㎖로 그들을 품어.
7. (10 mM의 나트륨 ₂ HPO _4, 1.8 mM의 KH ₂ PO ₄ 137 mM의 염화나트륨, 2.7 mM의 KCl을, PBS) 및 1 μg의 용액의 용액 부화 ^-1 (4)의 인큐베이션 후, 조심스럽게 인산 완충 식염수로 두 번 마이크로 어레이 린스 30 분 동안 PBS에서 ', 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI) 염색.
8. 한 번 PBS를 변경, PBS로 덮고 부드럽게 소용돌이에 의해 신선한 웰 플레이트에서 스테인드 마이크로 어레이 슬라이드를 씻으십시오. 공기의 흐름 하에서 건조. 접착제 대신에 마이크로 어레이 슬라이드와 실에 유리 커버 슬립을 적용합니다. D 일단RY 70 % (v / v) 에탄올로 외면 살균.
9. 안전하게 봉쇄 레벨에 따라 문화 폐기하십시오.

5. 마이크로 어레이 이미징 및 분석

1. 시야 및 DAPI (예 / 엠 = 358 ㎚ / 361 ㎚) 채널에서 각 폴리머 지점에 대한 하나의 이미지를 캡처합니다. 20 배 대물 렌즈가 장착 된 형광 현미경 (이미지 수집 소프트웨어에 의해 제어되는 XYZ 스테이지) 자동 형광 현미경을 사용하여 수동으로이 작업을 수행합니다.
   주 : 소프트웨어를 작동 및 시야 및 DAPI 채널을 이용하여 영상을 획득하기 위해 현미경을 조정하기위한 설명서 ^(18)를 참조. 모든 마이크로 어레이에 대한 이미지 캡처에 대한 이득과 노출 시간이 동일한 지 확인합니다.
2. 스폿 영역을 선택하고, 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 형광을 정량하여 DAPI 채널의 각 스팟의 평균 형광 강도를 얻었다.
3. 각각의 스폿의 배경 형광 들어 obta복제 마이크로 어레이에 폴리머 관광 명소의 이미지 만 더 박테리아와 미디어 배양 하였다. 박테리아에서 형광을 얻기 위해 스폿의 강도로부터 배경 형광 공제.
4. 다양한 폴리머 ^(6)의 결합 박테리아를 비교하기 위해 사용 된 각각의 고분자를 대표하는 네 개의 지점에서 평균 정규화 된 값을 계산합니다.
5. '히트'폴리머 ^(6)으로 가장 세균 바인딩 (가장 낮은 형광)을 나타내는 고분자를 식별합니다.

'히트'검증을위한 커버 전표 6. 코팅

1. 폴리머와 코트 coverslips를받는 사람 :
   1. '히트'폴리머 솔루션을 준비합니다 (~ 2 % / V w)의 테트라 히드로 푸란 (THF), 또는 다른 적당한 용매.
   2. 10 초 동안 2000 rpm에서 스핀 코터를 사용하여 중합체 용액으로 적당한 크기의 스핀 코팅 원형 유리 커버 슬립.
      주 : 스핀 코터의 부재에서, 커버 슬립 또는 기타 자료는 스핀 비록 딥 코팅 될 수있다코팅은보다 균일 한 표면을 생성합니다.
   3. 밤새 40 ℃에서 대류 오븐에서 코팅 된 커버 슬립을 건조 전에 접종 균을 30 분 동안 UV 광을 이용하여 살균.
2. 음성 대조군에 대한 아가로 오스와 코트 coverslips를받는 사람 :
   1. 어느 하나의 플라즈마 처리에 의해 청소 된 커버를 10 분 동안 또는 4 시간 동안 1 M NaOH를 침지.
   2. 밤새 1 % (3- 아미노 프로필) 트리에 톡시 실란을 함유하는 아세토 니트릴의 커버 슬립을 담근다. 아세톤으로 3 회 된 커버를 청소하고 1 시간 동안 오븐 (100 ° C)에 넣어.
   3. 딥 코트하여 60 ℃에서 수욕에서 유지 1 % 아가 로스 수용액 말린 커버 슬립. 24 시간 동안 먼지가없는 환경 조건에 평평한 표면에 아가로 오스 코팅 된 커버를 놓고 이전에 접종 균을 30 분 동안 자외선을 사용하여 살균.

7. 첨부 파일 및 스캐닝 전자 현미경을 사용하여 커버 슬립의 분석 (SEM)

1. 후30 분 동안 자외선 살균은 표준 12 웰 플레이트 (커버 슬립의 크기에 따라) 24 웰 플레이트에 커버 슬립 (중합체 / 아가, 코팅되거나 코팅 글라스)을 배치하고 박테리아 부화 절에 설명 된대로 4.
2. 박테리아 배양 한 후, 0.1 M cacodylate 완충액 (pH 7.4)로 두 번 코팅 및 코팅 된 커버를 세척 한 후 2 시간 동안 2.5 %, 0.1 M cacodylate 버퍼에 글루 타르 알데히드 (/ V w) (PH 7.4)로 고정한다.
3. 1 %, 실온에서 1 시간 동안 (w / v)의 산화 오스뮴 30 분마다 50, 70, 90 및 100 % (V / V)로 순차적으로 세척 에탄올 탈수와 포스트 픽스 샘플.
4. 표준 프로토콜 ^(19)에 따라 CO _2에서 건조 샘플. 건조 시간은 샘플의 특성에 따라 달라질 것이다.
5. 0.75 토르에서 30mA의 전류 및 진공 스퍼터 코터를 사용하여 금 / 팔라듐 합금 (40분의 60 %)에 코팅 된 샘플. 표준 프로토콜 ^(20)에 따라 전자 현미경으로 검사합니다.
   참고 : ENS그것은 매우 독성로 URE 적절한 안전주의 사항, 보관, 처리 및 산화 오스뮴의 처분으로 인한 위험을 관리 할 수 ​​있습니다.
6. 육안으로 코팅 된 커버의 이미지를 비교하고 아가로 오스 또는 '히트'고분자로 코팅 된 사람들은 고분자의 세균 바인딩 / 격퇴 능력을 확인합니다.
   참고 : 첨부 파일의 저항이 존재 세포의 감소 쉽게 볼 수 있어야합니다.
7. 가장 유망한 의료 기기 (예를 들어, 중심 정맥 카테터) ⁶ 코팅 연구에 대한 비 결합 중합체를 '히트'를 선택합니다.

코팅 카테터에 대한 용매 8. 선택

1. 카테터의 내주 부분과의 호환성뿐만 아니라 '히트'폴리머를 용해하는 능력을위한 다양한 용매를 평가합니다. 길이 5mm 카스-1의 원통형 조각으로 부품을 잘라, 디지털 버니어 캘리퍼스로 측정한다.
2. 이러한 아세트 등 다양한 용매 평가IC의 산, 암모니아, 아세톤, 아세토 니트릴, 디 에틸 에테르, 테트라 히드로 푸란 (THF), 디메틸 포름 아미드 (DMF), N의 메틸 -2- 피 롤리 돈 (NMP), 에탄올, 메탄올, 에틸렌 글리콜, 톨루엔, 크실렌. 12 시간 동안 용매에 카테터 조각을 담그고 카테터 및 용매의 명확성의 무결성을 시각적으로 평가한다.
   참고 : 카테터가 팽창 또는 분해 또는 혼탁 용매를 입을하지 않는 용매를 선택합니다. 용매는 '히트'중합체를 용해한다.

공 초점 현미경에 의하여 카테터에 세균 부착 9. 분석

1. 2.5 %를 준비 (w / v)의 아세톤, 또는 다른 적합한 용매에서 고분자 용액의 작은 유리 바이알 (5 mL)에 섹션 8. 5mm 카테터 조각 결정 2 분간 중합체 용액 1 ㎖ 그들을 젖어로서 . 과량의 중합체 용액을 제거하고 40 ℃ 진공 오븐에서 밤새 카테터 조각을 건조.
2. 해동 박테리아 성을 혼합하여 접종을 준비ocks 50 ㎖의 LB ⁶ 각 종의 약 ¹⁰⁶ 개 세포를 얻었다.
3. 30 분 동안 UV 광에 코팅 된 코팅 카테터 조각 소독 교반과 ^6, 3 일간 37 ℃에서 24 웰 플레이트에 접종 한 LB ㎖로 배양한다.
4. 배양 후, PBS (2 × 2 ml)으로 카테터 세척을 30 분 동안 PBS 중 10 % 파라 포름 알데히드로 세균을 고정하고 PBS (1 ml)로 세척 하였다. DAPI와 카테터 조각에 박테리아 (1 μg의 ml로 ^{- 1)} 얼룩이 20 분 및 PBS (1 ml)로 세척한다.
5. - Airy1, 이미지 크기 - 1,024 × 1,024 픽셀, 복셀 폭 - 105.2 nm의, 0.5μ 분 간격 Z-스택이 405nm 블루 다이오드 레이저, 검출기 범위 (414) 내지 (502), 핀 구멍 : 다음 설정을 사용하여 카테터 조각 공 촛점 이미지를 얻 배율 - 40X 1.25.
6. 카테터의 100 μm의 길이에 걸쳐 Z-스태킹 (50) 이미지가 공 촛점 이미지를 완료합니다.
7. suitab를 사용하여 이미지를 분석제작 분석 소프트웨어 : 카테터 피스의 단일 이미지를 생성하는 필드의 깊이를 확장 함수를 사용하여 Z 평면에서 Z-적층 된 이미지를 병합.
   주 :이 이미지 후 '배경 평탄화'기능을 이용하여 배경 보정 후, 세균에 의해 덮여 카테터의 영역을 획득하기 위해 분석되어야한다.

SEM에 의해 카테터에 세균 부착 10. 분석

1. 10 %를 아세톤 (V / w) 고분자 용액을 준비합니다.
2. 피펫 팁을 눌러 카테터의 절단 된 부분의 중간 부분에 (200 ㎕를 마이크로 피펫 용)를 보유하고 약 30 초 동안 고분자 용액의 조각을 찍어. 30 분 동안 주변 조건에 코팅 된 부분을 건조시킵니다. 주위 조건에서 중합체 용액으로 밤새 건조 다시 침지하여 제 2 코팅을 적용한다.
3. 박테리아 UV 처리 및 배양 후 (N = 3)과 PBS (2 × 1 mL) 및 1을 포함하는 48 웰 플레이트로 전송할 조각 씻어30 분 동안 PBS에서 0 % 포름 알데히드. 정착 후, PBS (1 ㎖)을 실온에서 밤새 건조하여 조각을 세척 도전성 카본 디스크와 스터브에 마운트하고, 스퍼터 코터를 사용하여 금 코트 (단계 7.5 참조).
4. 주 사형 전자 현미경 ^(6)을 이용하여 화상을 얻었다.

결과

도 2는 마이크로 어레이 분석에 의해 결정되는 중합체의 수에 세균 부착 (표준화 된 형광 강도)을 나타낸다. 아가로 오스가 강하게 ^{6 바인딩} 세균에 저항으로 폴리머없이 인쇄 명소 (NMP 만 해당), 음성 대조군 있습니다 - 기록 된 형광은 매우 낮습니다. 표시되는 고분자는 모든 낮은 결합되어 대부분의 경우, 고분자의 발수 특성 시험 세균 종 사이 크게 다르지만. 이것은 다른 종에 걸쳐 부착 메커니즘 사이의 다양한 차이를 반영한다. 적절한 중합체의 선택은 응용 프로그램에 따라서 의존하지만, 저 - 결합 중합체는 쉽게 오스와 비교함으로써 식별된다. 하이 - 결합 중합체는 배열에서 식별 될 가능성이 있으며, 후속 실험에서 양성 대조군으로 사용할 수있다. DAPI 채널에 자동 형광을 표시하지 않습니다 중합체를 들어, 질적 공동(도 3에 도시 된 바와 같이 하나의 대표 높은 결합 성 중합체 및 세 예컨대 저 - 결합 중합체를 강조) 스폿 이미지 mparison 시각적으로 이루어질 수있다. 이러한 비교는, 통계 분석보다 적은 정보를 제공하는 한편, 계산 된 강도 값의 유용한 시각 확인 할 수있다.

22 적절한 고분자 마이크로 어레이를 사용하여 식별로, 스케일 업 실험은 더 큰 표면을 코팅에 사용하면 자신의 박테리아 발수 특성을 확인하기 위해 수행된다. (SEM 분석 (그림 4, 5)) 코팅 유리 커버 전표 및 카테터 조각 (공 초점 현미경 (그림 6)와 SEM 분석 (그림 7))에 사용되는 최고 성능의 예는,있는 바와 같다. 모두 미시적 방법 명확한 데이터를 제공하는 표면 상에 직접적으로 세포 수를 허용하는 장점을 가지고, 세포 부착의 감소는 visibl 쉽게입니다이자형. 최고의뿐만 아니라 대규모 코팅 기술에 의무로서, 스케일 업에 자신의 발수 특성을 유지 그 코팅, 추가로 조사 하였다. 표시된 결과는 각 단계에서 최상의 성능 폴리머을 보여줍니다.

그림 1 :. 생물 의학 응용 프로그램에 대한 고분자 마이크로 어레이를 통해 박테리아 구충제 폴리머의 식별에 관련된 단계 SEM = 주사 전자 현미경.

그림 2 :. 세균은 마이크로 어레이 분석에 의해 결정 폴리머의 일련의 결합 낮은 폴리 아크릴 레이트 / 아크릴 아미드 (PA) 및 폴리 우레탄 (PU)의 수를 볼 수 바인딩 세균. 고분자 마이크로 어레이 결과는 여러 세균들과 프로브 pecies (C. jejuni와, C. 디피, C. 퍼프 린 젠스, S. mutans에, 2 개의 컨소시엄, BacMix-1과 BacMix-2) 표시됩니다. 배경은 평균 DAPI 형광 강도 (정규화를) 수정으로 세균이 표현 바인딩. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 참조 ^6에서 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3 :. 대표 폴리머에 세균 부착을 보여주는 BacMix-2의 고분자 지점의 예 이미지 형광 (DAPI) 및 시야 현미경 이미지. 강하게 결합 폴리머는 여러 구속력 폴리머 (PU-20, PA-336 및 PU-179)에 비해 포함되어 있습니다. 스케일 바 = 100 μm의. 참조 ^6에서 적응.: //www.jove.com/files/ftp_upload/54382/54382fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4 : '히트'폴리머 (표 1에서 선택 예)로 코팅 된 코팅 유리 및 유리에 세균 부착을 보여주는 스케일 업 유리 커버 전표 실험 SEM 이미지.. 스케일 바는 20 μm의 =.

도 5 :. 가장 '히트'중합체 코팅 표면의 단위 면적당 부착 세포의 세균은 SEM 이미지에서 세포 수로 정량 바인딩 비교. 아가로 오스는 제어 바인딩 표면 유리와 같은, 제어 '비 결합'표면으로 사용 하였다. 오차 막대 대표표준 편차.

그림 6 : 코팅 및 코팅 카테터 조각에 세균 바인딩의 비교 BacMix-2 배양 후 PA13 (B)로 코팅 처리되지 않은 카테터 (카스-1) (A)와 카테터를 비교 공 촛점 이미지.. 40 배 목표 (스케일 바 = 20 μm의)와 함께 찍은 사진. 참조 ^6에서 적응.

그림 7 :. 코팅 및 코팅 카테터 조각에 세균 바인딩의 비교 SEM 이미지는 세균 칵테일 BacMix-2로 구성된으로 배양 한 후 PA13 (B)로 코팅 처리되지 않은 카테터 (카스-1) (A) 및 카테터의 비교를 보여 스케일. 막대 = 101; m. 참조 ^6에서 적응.

중합체	단량체 (1)	단량체 (2)	단량체 (3)	단량체의 비율
PA465	MEMA	DEAEMA	HEA	8	1	1
PA475	MEMA	DEAEA	HEMA	6	1	삼
PA513	MEMA	DEAEMA	MMA	8	1	1
PA515	MEMA	DEAEA	MMA	6	1	삼
PA13		DMAA	-	9	1	-
PU1	PEG2000	HDI	-	4.9	5.2	-
PU16	PEG2000	MDI	-	4.9	5.2	-
PU161	PEG2000	MDI	BD	2.5	5.2	2.3
PU7	PEG900	비히	-	4.9	5.2	-
PU83	PEG900	HMDI	BD	2.5	5.2	2.3
PU227	PPG-PEG-1900	HDI	-	4.9	5.2	-
PU129	PPG425	비히	DMAPD	2.5	5.2	2.3
PU10	PTMG2000	비히	-	4.9	5.2	-
PU179	PTMG2000	HDI	NMAPD	2.5	5.2	2.3
PU20	PTMG2000	MDI	-	4.9	5.2	-
PU5	PTMG2000	HDI	-	4.9	5.2	-

표 1 : 박테리아의 구성 비는 결합 그림 2 중합체를 '히트'.

토론

표면에 세균이 부착 세균 종에 의존하는 다양한 요소에 의해 결정되는 복잡한 공정이며, 표면 주변 매체 및 물리적 환경의 특성. 특정 화학 그룹이 세균 결합 영향을주는 것으로 알려져 있지만 도전 특정 기능을 위해 중합체의 합리적인 설계를 만드는 화학적 구조를 갖는 중합체의 생물학적 영향을 상관 (폴리 글리콜을, 예를 들면, 일반적으로 부착 ^{11 레지스트)} 어렵다. 상세한 부착 메커니즘이없는 경우, 다른 연구는 길고 광범위한 최적화 ²¹ 프로세스 자연 발생 발수 표면을 모방하기 위해 시도했다. 여기에 제시된 소형 높은 처리량 방법은 연구를 위해 리드를 식별하는 폴리머의 수백의 병렬 검사를 용이하게하여 이러한 문제를 극복한다.

마이크로 어레이 방법의 결과는 주로 IDE하는 역할을. 가능성이 리드 후보를 ntify 그림 3은 용량 결합의 명확한 감소를 보여줍니다 동안 2, 적어도 하나의 종의 낮은 바인딩 22 후보를 보여줍니다. 그림 2에 표시된 모든 22 낮은 결합 중합체는 (반발 및 코팅 특성의 관점에서) 가장이 PU83, PA13 및 PA515로 결정했다 동안 스케일 업 실험에 앞으로 데려 가게되었다 (그림 4, 5). 폴리 아크릴 레이트는 중합 방법의 관점에서 유연성을 제공하며, 따라서 낮은 결합 폴리 아크릴 레이트, PA13은 카테터 코팅 연구를 위해 선택 하였다 (도 6 및도 7). 다른 후보에 대한 자세한 추가 작업을 실시하고, 다른 곳에서 ^{6보고되었다.}

실험의 반복 수를 통해 우리는 작은 단계의 수는 성공과 재현성의 핵심이었다 발견했다. 뿐만 아니라의 부착을 용이아가로 오스는 세균성 식민지에 대한 높은 내성으로, 깨끗 한 배경을 제공에서 코팅 아가로 오스를 사용하여 유리 슬라이드에 폴리머,. 마찬가지로, 중합체의 일관성은 동일한 배열 내에서 어레이 사이 모두 자신 스폿 중요하고, 따라서 어레이의 인쇄가 심하게 제어되어야한다. 상기 인쇄 헤드 핀과 384 웰 플레이트의 또한 균일 한 충전의주의 깊은 조정이 균일 안보를 보장하기 위해 필요합니다. 우리가 사용하는 폴리머의 일부로서 세균 배양이 중요되기 전에 각 슬라이드 배경 형광 데이터를 가지고, 자기 형광의 정도를 나타내었다. 변동을 고려하고 마이크로 어레이의 강력한 데이터 복제가 좋습니다 얻었다.

여기에 사용 된 염색 (DAPI)는 DNA에 비 특이 적으로 결합 박테리아 종에 대한 선택성이 없습니다. 오염 물질이 들키지 수 있으므로 세균 문화가 interpre 혼란 도입되면 따라서, 좋은 무균 기술이 필수적이다결과 테이션. 동일한는 봉과 구균 구별하지만 속에 또는 종하지 만 가능 주사 전자 현미경을 사용하여 나중에 실험 사실이다.

마이크로 어레이 검사 후, 유망 중합체는 더 확인을 위해 선택해야합니다. 여기에 제시된 실시 예에서, 관심 일곱 중합체 마이크로 어레이에 형광 그들의 명확한 감소에 의해 식별하고, 부착 그 억제는 큰 표면을 코팅하여 확인 하였다. 4 및도 5는 커버 글라스, A의 달성 결합의 감소를 보여 실용적인 수단은 대량 코팅 등이 아닌 마이크로 어레이 명소와 폴리머의 동작을 테스트합니다. 그 후,이 폴리머는 완전히 세균 부착 감소를 정량화하는 의료 기기에 코팅 하였다. 용매 (여기 카테터)이 코팅 연구에 원하는 기판에 양성 (프로토콜 8 항 참조) 유지하면서 선택하는 것이 중요합니다코팅을 허용하기 위해, 관심있는 중합체를 용해하는 능력을 보내고. 여기에서는, 속성 언급뿐만 아니라, 낮은 비점을 갖는 균일 한 코팅을 남겨 빠르게 증발 아세톤을 사용 하였다.

특정 응용 프로그램에 따라 다릅니다 선택한 검증의 수단이 연구되고. 전자와 형광 현미경으로 세포를 관찰 개별 세포 부착을 직접 정량화 할 수 있습니다, 우리는 대량 염색 마이크로 어레이 분석에 대한 보완이 기술을 선택했다. 결과는 무료 검증 방법의 중요성을 입증도 6 및도 7에 표시됩니다. 주사 전자 현미경 여기에 부드럽고 균일 한 고분자의 표면의 평가를 허용하는 추가 혜택을 가지고있는 동안 그림 6의 공 촛점 이미지는 개별 세포의 매우 선명한 이미지를 제공합니다. 이러한 방법에 사용되는 현미경의 시야가 제한하고, 그러므로 importa되어있다NT는 결과에 대한 확신을 가지고 일련의 스냅 샷을 촬영합니다. 상기 한 방법은 단지 소 영역의 번호로부터 유추 따르면, 전면 박테리아 부착을 정량화 할 수 없습니다. 우리는이 기술 응용 프로그램에 대한 충분하다 생각합니다. 세균 결합의 감소는 다른 ²² 바와 같은 방법을 사용하여 전체에 코팅 된 코팅 카테터 편에 표면 부착 박테리아를 열거하여 평가 될 수있다. 그러나 이러한 방법은 분석은 종종 복잡한 형상을 의료 기기로 수행 될 때 유지하기가 어렵다 균일 한 표면 영역을 갖도록 선별 바이오 물질의 표면을 필요로한다.

분명히, 임상 사용하기위한 모든 장치는 인간의 안전성과 유효성을 보장하기 위해 상당한 추가 테스트를 통과해야합니다. 여기에 제시된 방법은 생체 내 활성의 확인을 포함해야이 과정과 향후 작업의 시작을 나타냅니다. 이 경우, 정맥 C 공부atheters 초기 연구는 혈액 성분과 중합체 전체 세포의 결합을 조사 할 수있다. 세균 결합 혈액 성분의 효과는 아마도 비활성화 혈청 디 fibrinated 혈액 ^(23)의 존재하에 결합 분석을 반복하여, 고려되어야한다. 기술의 최종 테스트는 피하 이식 감염 모델 ^(24)로 생체 내 모델에있을 것입니다.

우리는 표면 변질 중합체의 스크리닝 중합체 마이크로 어레이에있어서의 전위를 보여준다. 이러한 중합체는 (모두 저항과 결합 세균을 촉진)이 방법을 의미하는 것은 연구의 많은 분야에서 유용 할 수 있습니다, 의학, 식품 산업 및 생명 공학에 응용 프로그램의 큰 숫자가 있습니다. 일이있어 박테리아를 사용하지만,이 방법은 다른 유형의 세포와 마찬가지로 화학 마이크로 어레이에 적용 할 수있다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아가로스	시그마	05066
실란 준비 슬라이드	Sigma	S4651
Polymers	Synthesised In-house	해당 없음
NMP	Sigma	494496
LB Broth	Oxoid	CM1018
DAPI	Thermo Fisher	D1306
Tetrahydrofuran	Sigma	401757
(3- 아미노프로필) 트리에톡시실란 코팅 유리 슬라이드	시그마	실란-프렙
카코딜레이트 완충액	시그마	97068
카테터 1	Arrow International	CS12123E
카테터 2	박스터 헬스케어	ECS1320
오스뮴 테트록사이드	시그마	201030
Equipment
접촉식 프린터	Genetix	Qarraymini
Microarray 현미경	IMSTAR	Pathfinder
Spin Coater	Speedline Technologies	6708D
컨포칼 현미경	Leica	SP5
이미지 분석 소프트웨어	미디어 사이버네틱스	Image-Pro Plus
주사 전자 현미경	필립스	XL30CP
스퍼터 코터	Bal-Tec	SCD050