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방법 논문

탠덤 선호도 태그 방법을 사용하여 구조 연구에 대한 기본 공단의 정화

9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54389

⸱

2016년 7월 27일

 , 
1Department of Biochemistry, Brandeis University, 2Winship Cancer Institute, Emory University School of Medicine

이 논문에서

요약

TAP(Tandem Affinity Purification) 방법은 단백질체학을 위해 주로 진핵생물인 세포 추출물에서 천연 복합체를 분리하는 데 광범위하게 사용되었습니다. 여기에서는 구조 연구를 위한 천연 복합체의 정제에 최적화된 TAP 방법 프로토콜을 제시합니다.

초록

선호도 정화 방법은 단백체 특성에 대한 기본 복합체를 분리에 성공했다. 구조 이질성과 단지의 조성 이질성의 정도는 일반적으로 연구를 수행의 진행을 방해하지 않습니다. 반대로, 구조적 특성을위한 복합 구성물은 구조적으로 균일뿐만 아니라 프로테오믹스에 필요한 것보다 더 높은 농도 인 상태에서 정제한다. 최근 큰 거대 분자 복합체의 구조 결정을위한 전자 현미경의 적용에 상당한 발전이 있었다. 이것은 전자 현미경으로 구조 결정을위한 충분한 품질과 양의 천연 복합체를 정제하는 방법에 대한 관심이 높아지고있다. 탠덤 선호도 정화 (TAP) 메소드가 18 서브 유닛을 추출하고 정제 최적화되었습니다 ~ 신진 효모에서 0.8 MDA의 리보 어셈블리 (사카로 마이 세스 세레 비지)

서론

다수의 주요 세포 과정 큰 단백질 및 단백질 RNA 복합체 (1)에 의해 수행된다. 같은 단지의 생물 물리학 및 구조 연구를 수행에 중요한 병목 현상은 적절한 품질 (즉, 균질성)의 적절한 농도를 얻을 수있다. 기본 소스에서 복합체를 분리하는 것은 서브 유닛의 관련 포스트 전사 및 / 또는 번역 후 변형을 유지하고 적절한 복잡한 어셈블리를 보장 등 많은 장점을 가지고 있습니다. 그러나, 큰 세포 복합체는 낮은 카피 수에서 종종 세포에 존재하고 정화는 고도로 효율적인하고 복잡한 무결성을 유지하기 위해 주변의 생리적 조건에서 발생해야합니다. 진핵 소스에서 복잡한 정제 특별히 도전하고 재정적으로 금지 될 수 있습니다. 따라서, 효율적이고 균일 한 복합체를 수득 전략 또는 방법이 매우 바람직하다.

된 전략초기 특성화 진핵 세포에서 네이티브 단지를 정화에 성공적 탠덤 선호도 정화 (TAP) 방법 2,3입니다. 탭 방법은 처음 인자 (들)이 상호 작용하는 복잡한의 신진 효모 (S. cerevisiae의)에서 천연 단백질을 정제하기 위해 고안되었다. 탭 방식은 두 개의 태그, 동일한 단백질을 코딩하는 유전자 서열과 나란히 융합 각 태그를 이용했다. 타이트 선택적 생리 용액 상태의 가까이 유지하려는 욕구와 친 화성 수지에 결합하기위한 필요성의 균형을하도록 태그를 선택 하였다. 이 균형은 정제 후 특성에 대한 계수 (들)와 상호 작용하는 태깅 된 단백질의 안정한 상호 작용 (들)을 유지하는 역할을한다. 태그가 단지 위에 20 kDa의의 부가 - genomically 혼입 TAP 태그 끝에 배치하고, 단백질 - 코딩 유전자 (단말 C)의 단백질 A 뒤에 펩타이드 (CBP)을 바인딩 모듈 린을 코딩하는 서열로 구성된 단백질. CBP는이 짧다(6) 아미노산 및 의해 인식 ~ 17 kDa의 단백질, 칼 모듈 린 10-9 M의 순서 (4)에 K D와 칼슘의 존재 (CAM). 단백질 A는 ​​태그의 반복 사이에 짧은 링커 잔기의 58 개의 반복 이루어진 크다. 각 58 아미노산 반복은 K D ~ 10 -8 M (5) 면역 글로불린 G (IgG의)에 의해 인식된다. 이 두 태그 사이에 TEV 단백질 분해 효소, 담배 엣지 바이러스 6, 7에서 엔도 펩 티다 제에 대한 인식 사이트를 통합했다. 탭 단백질 태그에있어서의 제 연관 단계에서,도 1에 도시 된 바와 같이 태그 단백질 TEV 단백질 분해 효소, 특히 사이트 사이의 절단의 첨가시 열 절단에 의해 용출 된 단백질 A. 통해 IgG의 수지에 바인딩 두 태그입니다. 이것의 IgG의 상호 작용 등의 필요한 단계 및 단백질 A가 매우 강해에만 적절 변성 용액 조건 교란 될 수있다. 홍보 부족태그 otein 단백질은 칼슘의 존재 캠 수지에 결합 된 금속 이온 킬 레이터의 EGTA (에틸렌 글리콜 테트라 산) (도 1)을 첨가하여이 수지로부터 용출시켰다.

탭 방식의 도입은 그것이 생성하는 대규모 연구에 사용 된 바로 후에 S. 복잡한 상호 작용 '맵핑' cerevisiae의 8. 중요한 것은 이러한 노력 전체 효모-TAP 태그 오픈 리딩 프레임 (ORF) 라이브러리의 결과뿐만 아니라 개별 TAP로 (9)는 상용 소스에서 사용할 수 개의 ORF 태그. 따라서, 하나는 효모 복잡한에 대한 태그 단백질과 어떤 효모를 얻을 수 있습니다. 상기 탭 방법도 포함 변형 또는 TAP 태그의 변형 가했다 기타 진핵뿐만 아니라 박테리아 세포 10,11에서 착물 정제의 사용; 단백질 A 및 CBP는 다른 단백질 (12)에 배치되는 것을 특징으로 "분할 태그"의 디자인; 그리고 타예컨대 칼슘 또는 EGTA (13) 복합체의 감도, 연구자의 ​​필요를 수용하도록 GS가 바뀌었다.

모두 계측 및 방법론의 최근 발전은 거대 분자 복합체 (14)의 원자 해상도의 이미지에 가까운 높은 주도 한 구조 결정을위한 전자 현미경 (EM)의 응용 프로그램에서 상당한 진보를 주도하고있다. EM에 의해 복잡 얻어지는 해상도는, 그러나, 연구중인 복합물의 품질을 조건으로 유지된다. 이 연구는 S.에서 정화 할 수있는 TAP 태그 방식을 사용하고있다 cerevisiae의 U1 snRNP는 spliceosome (15, 16)의 일부인 18 서브 유닛 (~ 0.8 MDA) 낮은 사본 번호 리보 복잡한. 다수의 단계는 균일하고 적절한 농도가되도록이 복합체를 정제 취해왔다. 정화의 여러 단계에서 발생하는 잠재적 인 문제를 설명하고 전략 chall을 극복하기 위해 촬영enges는 강조했다. 주의 깊게 평가 및 정제 단계를 최적화함으로써, U1 snRNP 정제 품질의 음의 얼룩에 적합 전자 냉동 현미경 (냉동-EM) 연구 양이다. 구조 연구를위한 기본 복합체의 정제를위한 최적화 된 TAP 방식 프로토콜이 설명된다.

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프로토콜

참고 : 다음 프로토콜 세포 배양의 4 L, 세포의 약 40g 습 중량에서 복잡한의 정제를 위해 고안되었다. 일단 준비, 모든 버퍼가 4 ° C에서 보관 및 준비 개월 이내에 사용해야합니다. 환원제와 단백질 분해 효소 억제제는 사용하기 직전에 버퍼에 추가됩니다.

탠덤 선호도 정화에 대한 전체 세포 추출물 1. 준비

  1. S.의 성장 cerevisiae의 세포
    1. 킬 원하는 TAP는 S. 태그 cerevisiae의 변형 스토리지에서 (-80 ° C) 효모 펩톤 덱 스트로스 상 (YPD) 판. 효모 세포는 흰색 털이 나타날 때까지 5 일 (30 ° C를) - 3 품어.
    2. 50 ML 원뿔 폴리 프로필렌 원심 분리 관에 10 ml의 YPD 매체로 판에서 신선한 세포의 약 2mm 2의 행진을 접종한다. 분당 180 회전 수 (rpm) 하룻밤 (° C ~ 30m)에서 튜브를 흔들어.
    3. 오버 2 ㎖를 접종2 L의 삼각 또는 삼각 플라스크에 YPD 매체의 리터당 밤 문화. 180 rpm으로 (30 °에 C)에서 흔들어. 24 시간 - 늦은 로그 단계까지 2-1.8의 OD (600), 일반적으로 20을 600 nm의 (OD 600)의 광학 밀도에서 세포의 성장을 모니터링합니다.
  2. 수확 S. cerevisiae의 세포
    1. 원심 분리하여 수확 세포 15 분 (4 °에 C)에 대한 5,400 XG에.
    2. 빨리 뜨는을 가만히 따르다 4 ° C 또는 얼음에 세포를 유지합니다.
    3. 용해 완충액 차가워 2 mL를 세포 펠렛 각각 리터 일시 (10 mM 트리스 - 염산, pH가 8.0, 300 mM의 염화나트륨, 10 mM의 KCl을 0.2 mM의 EDTA, pH가 8.0, 5 mM의 이미 다졸, pH가 8.0, 10 % 글리세롤; 0.1 % v / V를 NP-40). 소용돌이 및 / 또는 반복 피펫은 10 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용하여 세포를 일시 중단합니다.
      참고 : NP-40의 중요성은 복잡한 품질 및 사후 정화 분석이 아래에 설명되어 관련이있다.
    4. 빈 50 ml의 원추형 폴리 프로필렌 원심 분리 튜브 (K)에 세포 현탁액을 전송얼음에 EPT. 냉각 용해 버퍼의 추가로 2 ㎖로 각각의 원심 분리기 병을 세척하고 50 ML 튜브에 세포 현탁액에 추가 할 수 있습니다.
    5. 튜브를 칭량 빈 튜브의 중량을 감산뿐만 아니라 가산 용해 완충액으로 세포 펠렛의 습윤 중량을 결정한다.
      참고 : OD 1.8 (600)을 갖는 세포 배양의 리터가 약 10 g이다.
    6. 50 ML 원뿔 폴리 프로필렌 원심 분리 관에 액체 질소 목욕을 만듭니다. 5 ML의 주사기에 현탁 세포를 그립니다. 주사기로 16 G 바늘을 연결합니다. 셀 생성하는 주사기 / 바늘을 통과시켜 세포 현탁액을 정지 "액적." 동결의 비율은 약 1 분 / ㎖해야합니다.
    7. 냉동 세포 방울을 저장 (-80 ° C) 또는 용해를 진행합니다.
  3. 용균 세포와 해물 대한 설명
    1. 를 Lyse 커피 분쇄기를 사용하여 효모 세포. 는 C를 흔들어 섞으면 서 25 초, 버스트 연삭과를 Lyse 세포 여덟 아홉 배offee 분쇄기입니다. 사용하기 전에, 액체 질소로 커피 분쇄기 미리 차게. 연삭의 모든 두 라운드는 분쇄기에 액체 질소의 얕은 층을 추가하고이 증발 할 수 있습니다.
    2. 응집으로부터 세포를 유지하기 위해 필요에 따라 액체 질소 냉각 주걱으로 교반 하였다. 세포 응집을 초래할 수 세포의 해동을 방지하기 위해주의하십시오. 세포 용해 다음과 같은 미세한 백색 분말로 나타납니다. 효모 배양 (~ 40g)의 4 L의 최대 세포 펠릿은 시간에 접지 될 수있다.
      참고 : 용해 방법에 대한 관찰은 아래에 설명되어 있습니다.
    3. 혈구 세포 또는 다른 계산 방법을 이용하여 세포 용해의 정도를 평가한다. 적절한 분석을 제공하기 위해, 다음 샘플을 (1) 용해 전; (2) 용해 네 라운드 후; 및 (3)의 용해를 수행. 이러한 샘플을 확인하려면, 1.5 ML 튜브에 액체 질소 냉각 주걱과 장소 세포의 작은 금액을 가져 가라.
    4. 세포의 세포를 해동되면, 피펫 5 μL495 ㎕의 물을 섞는다. 40 경우 - 세포의 60 % 용해가 관찰, 프로토콜의 다음 단계로 진행합니다.
      참고 : 용해 장기간의 효과에 대한 관찰은 아래에 설명되어 있습니다.
    5. 일단 적절한 용해가 관찰, 저장 용해 세포 (-80 ° C) 또는 다음 단계로 진행합니다.
    6. 1mM의 페닐 메탄 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF), 1 mM 디티 오 트레이 톨 (DTT) 및 프로테아제 억제제의 칵테일 포함 시판 15 ml의 용해 완충액으로 각이 50 ml의 원추형 폴리 프로필렌 원심 분리 튜브를 준비한다.
      주 : 단백질 분해에 중요한 관찰되면, 프로테아제 결핍 균주의 사용을 고려한다.
    7. 준비된 50 ㎖ 튜브에 고정 된 용해 세포 분말을 퍼하기 위해 액체 질소 냉각 주걱을 사용합니다. 환원제 및 프로테아제 억제제 (들) 모두를 함유하는 용해 버퍼 점진적 고체 전지 분말을 추가 /.
    8. 해동로 / 형성되는 거품을 방지 할 세포를 용해하지만, 그래서 부드럽게 RT에서 50 ㎖ 튜브를 회전합니다. 에이셀 분말 / 고체 용해가 추가 세포를 고체 / 분말을 추가에요.
    9. 각각 약 20 세포의 g 또는 추가 된 모든 셀이 될 때까지이 50 ㎖ 튜브를 각각 입력합니다. 50 ml의 튜브에서 관찰 동결 된 세포 덩어리가 없을 때까지 해동 / 용해를 계속합니다. 이 약 50 분 소요됩니다.
    10. 25,000 XG (4 ℃)에서 20 분 동안 현탁 된 세포 용 해물을 원심 분리기. 잘 용해 세포 흑색 침전물을 소량을 나타낼 수있다.
    11. 초 원심 분리기 튜브 (사용 26.3 ml의 튜브) 폴리 카보네이트와 각 전체 튜브에 10 ㎕의 200 mM의 PMSF를 추가하는 상층 액의 50 ㎖를 전송합니다.
    12. 100,000 XG (4 °에 C)에서 1 시간 동안 원심 분리기. 4 층은 아래에서 위로, 볼 수 있어야합니다 : (1) 하드 명확한 펠렛, 리보솜 복합체를 함유 (2) 소프트 지질 과다 펠렛; (3) 세포의 가용성 단백질 및 복합체의 대부분을 함유하는 큰 투명한 황색 띤 층; 및 (4) '비늘'상층 지질 이루어지는.
    13. 모든의를 수행추운 방 (4 ° C)에서 ubsequent 단계. 1 ml를 피펫을 사용하여 가능한 한 최고 '비늘'지질 층의 정도를 제거하고 폐기합니다. 옐로우, 클리어 층의 대부분을 복구하는 데 10 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용합니다.
    14. 아래 두 층을 방해하지 않도록하기 위해 1 ML의 피펫을 사용하여이 계층의 마지막 몇 mL로 복구 할 수 있습니다. 40g 습윤 세포 펠릿에서 중간층의 약 48 ml의 통상적 회수 및 지방층 8 ml를 폐기 / 제거.
      주 : 칼럼 정제 흐름이 크게 후술 또한 복합체의 품질이 저하 될 수 지질의 존재에 의해 방해된다.

2. 열 정제 단계 1 : IgG의 크로마토 그래피

  1. 수지 평형 및 바인딩
    1. 세포 펠렛 40 g을하는 300 μL의 IgG 세 파로스 슬러리를 준비한다. 슬러리 피펫을 용이하게하기 위해 1 ml의 피펫 팁의 끝 부분을 잘라. 워시 / 5 ml의 IgGD150 Buffe와 IgG의 수지 세 번, 매번 평형R (10 mM 트리스 - 염산, pH가 8.0, 150 mM의 NaCl을 150 밀리미터의 KCl, 1 mM의의 MgCl 2, 5 mM의 이미 다졸, pH가 8; 0.1 % V / V의 NP-40 1 mM의 DTT 50 당 단백질 분해 효소 억제제 태블릿 ML의 볼륨).
      1. 스핀은 세척 사이 160 XG (4 °에 C)에서 펠렛과 뜨는을 제거합니다.
    2. 2 시간 (4 °에 C)에 대한 적절한 회전을 사용하여, 중간 단계의 상층 액과 세포의 40g 당 두 개의 미니 프로테아제 억제제 정제와 IgG의 수지를 돌립니다. 이 배치의 IgG 용액이다.
    3. 평면 컷을 생성하기 위해 컬럼의 끝을 절단하여 사용이 10 ml의 폴리 준비 열을 준비합니다. 중력 흐름에 의한 열의 포장 및 세척을 촉진하기 위해, ~ 10 ml의 컬럼 당 IgG에 배치 용액 25 ml에 200 포장의 IgG 수지의 μL 또는 최대로드합니다.
    4. 열로 IgG를 배치 솔루션을 붓고 중력에 의해 침전 할 수 있습니다. 침전이 30 분보다 더 오래 걸리는 경우 원심 분리기 t에서 중간 단계를 복구 할 때, 가장 가능성이 지질 오염을 발생했습니다ubes.
    5. IgGD150 버퍼의 네 개의 연속 10 ml의 볼륨으로 충전 탑을 씻으십시오.
  2. 열 TEV 절단에
    1. 칼럼의 바닥을 밀봉 IgGD150 버퍼 1 mL 및 TEV 프로테아제 100 ㎕ 추가 (0.6 ㎎ / ㎖ 주식을, TEV의 돌연변이 변종 S219V는 자체 생산). 칼럼의 상단을 밀봉하고 20 분 (18 ° C를) 750 rpm으로 진탕, 열 믹서를 사용하여 혼합한다. 재현 탁 수지는 1 시간 배양 총 반복, 20 분 동안 다시 한 번 더 혼합.
      참고 : 최소 배양 시간을 유지하는 것이 중요하다.
    2. 4 ° C에 열을 반환하고 중력에 의해 단백질 / 복합을 용출. IgGD150 버퍼의 추가 200 μL와 죽은 볼륨을 용출.

3. 칼럼 정제 단계 2 : 칼 모듈 린 친 화성 크로마토 그래피

  1. 수지 평형 및 바인딩
    1. 셀의 40g 당 칼 모듈 린 친 화성 수지의 200 μl를 준비작은 공. 150 mM의 염화나트륨, 10 mM의 KCl을 5 ml의 칼 모듈 린은 버퍼 (10 mM 트리스 - 염산, pH가 8.0 바인딩과 수지 세 번, 매번 세척 1 ㎜의 MgCl 2, 5 mM의 이미 다졸, pH가 8; 2 mM의 CaCl2를 0.1 % v / V를의 NP-40 10 MM의 β-머 캅토 에탄올), 160 XG (4 ° C)에서 원심 분리는 각각의 세척을위한 펠렛합니다.
    2. 각 1 ml의 IgG의 용출에, 버퍼 바인딩 칼 모듈 린의 3 볼륨을 추가합니다. 일정 칼슘 수준을 유지하기 위해, 염화칼슘 (2) 및 β-머 캅토 에탄올은 IgG의 용출에 이러한 성분의 부족을 고려하여 추가 할 수 있습니다. 최종 농도는 2 mM의 염화칼슘이 10 MM의 β-머 캅토 에탄올해야합니다.
    3. 칼 모듈 린 수지에 샘플을 추가하고 튜브 회를 사용하여 1 시간 (4 °에 C)에 대한 결합한다.
  2. 포장 및 칼 모듈 린 수지에서 용리
    1. 평면 구멍을 만드 럼의 끝을 절단하여 100 ㎕의 칼 모듈 린 슬러리 당 2 ml의 폴리 준비 열을 준비합니다. 공동마다 더 이상 100 ㎕의 칼 모듈 린 슬러리를로드하지시료 수지의 양을 최소화 lumn 용출시에 접촉.
    2. 중력에 의해 열을 포장하고 5 ml의 칼 모듈 린 바인딩 버퍼로 열 세 번 수지를 씻는다.
    3. 150 mM의 염화나트륨, 10 mM의 KCl을 1 밀리미터의 MgCl 2, 5 mM의 이미 다졸, pH가 8.0, 4 mM의 EGTA, pH가 8.0, 0.08 %의 V 200 μL 모듈 린 용출 완충액 (10 mM 트리스 - 염산, pH가 8.0을 첨가하여 단백질을 용리 / V NP-40 10 MM의 β-머 캅토 에탄올). 칼 모듈 린 용출 버퍼 200 μL의 6 배 추가를 반복합니다.
    4. 용리 1 내지 3의 경우, 컬럼에 볼륨을 적용하고 즉시 용출액을 수집한다. 용출 4 칼럼의 바닥을 밀봉하고 2.5 분 동안 용출 완충액으로 부화 후 개봉 및 중력에 의해 용출 할 수있다. 용출 5, 5 분 동안 배양 한 후 봉인을 해제하고 용출. 용출 6, 10 분 동안 배양 한 후 봉인을 해제하고 용출.
      참고 : 복잡한의 무결성 용리 다릅니다 / 분획 (대표 결과 섹션 참조) <./ 리>
    5. 용리 2 개별적 밤새 적절한 마이크로 투석 법을 이용하여 투석을 6. 투석 버퍼에 대한 분수 투석 (10 mM 트리스 - 염산, pH가 8.0, 150 mM의 NaCl을 10 밀리미터의 KCl을 1 밀리미터의 MgCl 2, 5 mM의 이미 다졸, pH가 8; 10 MM의 β-머 캅토 에탄올).
      참고 : NP-40은 투석막을 통해, 모든 경우에, 상당히 전달하지 않습니다.

4. 후 정화 분석은 복잡한 품질을 평가하는

  1. 기본 젤과 실버 염색
    1. 제조업체의 지침에 따라 단지의 분석을 위해 16 % 프리 캐스트 기본 젤 - 4를 준비합니다. 젤 위에 투석 칼 모듈 린의 용출 / 분수의 각각의 적절한 분자량 단백질 표준 및로드 15 μl를 사용합니다.
    2. 약 3 시간 (4 °에 C) 150 V에서 젤을 Electrophorese.
    3. 실버 여섯 용리 각각의 품질을 평가하는 젤을 염색. 또는, 동등하게 중요한 상업을 사용형광 염색 (들). 이 단계에서, 착물의 농도는 쿠마시 블루 염색의 검출 레벨 이하 대부분이다.
  2. 추가 젤 분석 방법
    1. 웨스턴 블로 팅에 의해 단백질을 감지하기 위해, SDS 또는 기본 PAGE에 의해 복잡한을 해결 한 후 제조업체의 지침에 따라 같은 TAP 태그 항체를 사용하여 칼 모듈 린 바인딩 펩타이드 (CBP) 에피토프의 젤을 조사.
    2. 특정 형광 염색 (들)을 사용하여, 정제 TAP 컴플렉스의 존재하에 단백질 및 / 또는 핵산의 무결​​성을 확인한다. 더 스펙트럼 중첩이 얼룩 사이에 감지되지 않도록주의하십시오.
  3. 네거티브 얼룩 전자 현미경 시각화
    1. 복잡한 응용 프로그램의 30 분 이내에, 글로우 방전 30 초 동안 -15 mA에서 연속 탄소 격자를 사용합니다.
    2. 그리드에 (일반적으로 1 nm의 농도) TAP 정제 단지의 3 μl를 적용합니다. 분 동안 품어. 오 F여분의 버퍼를 제거하는 격자의 측면 ROM.
    3. 탈 이온수 20 μl의 방울 두 번 씻으십시오. 세척과 측면 오.
    4. 50 μl의 부정적인 얼룩 드롭에 그리드를 적용하고 분 동안 품어. 우라 닐 아세테이트 (2 %) 또는 우라 닐 포르 메이트 (0.75 %)와 염색을 권장합니다.
      주의 : 우라 닐 염 및 솔루션은 약하게 방사성하고 중금속이 포함되어 있습니다. 이러한 관심과 제도적 권장 폐기물 지침에 따라 폐기해야합니다 이러한 솔루션과 접촉하는 모든 물질로 처리해야합니다.
    5. 블로 팅하지 않고, 신선한 50 μl의 부정적인 얼룩 드롭에 그리드를 적용합니다. A 최소, 다음 측 오 부화, 그리고 마지막으로 건조 공기 및 시각화.
  4. 극저온 전자 현미경 (극저온 EM) 시각화
    1. 최적화해야 할 수도 있지만 제조 업체의 프로토콜에 따라, TAP 정제 복합체 냉동-EM을 수행합니다.
      참고 : 세제의 존재를 높은 농도의 엄마에Y 진행을 방해하고 아래에 설명되어 있습니다.

5. 복잡한 스토리지

  1. 스토리지에 대한 복잡한 준비
    1. 필요한 경우 복합체에 대한 적절한 분자량 컷 - 오프를 갖는 원심 필터를 사용하여, 상기 복합체를 농축시킨다. 원하는 농도에 도달 할 때까지 1 분 간격으로 14,000 XG 스핀.
      참고 : 필터도 투석 막을 통과하지 않는 NP-40 농도는 집중하는 동안 농도가 증가 할 것이다.
    2. 플래시는 액체 질소 나 드라이 아이스에 30 μL 씩의 복잡한 에탄올 욕을 냉각 동결하고 -80 ° C에 저장합니다.
  2. 세제의 선택 후 정제 제거

참고 사항 : NP-40 및 방해 또는 일부 애플리케이션에 대한 진행을 억제 할 수는 임계 미셀 농도의 상기 농도의 세제의 존재. 프로토로부터 제거의 결과다른 첨가제 또는 공용 매와 ​​COL뿐만 아니라 교체는 아래에 설명되어 있습니다. 더 NP-40가 요구되지 않는 경우, 옵션은 예 바이오 비드, 제거를위한 상용 프로그램을 사용하는 것이다.

  1. 투석 버퍼에 미리 평형 시판 세제 흡수 구슬. (일반적으로 10 nM의 농도에서) 단지의 30 μL에 5 구슬을 섞는다.
  2. 얼음에 15 분 동안 TAP 정제 단지와 단계 5.2.1에서 평형 구슬을 품어. 세제의 제거 다음 몇 시간 내에 복잡한을 사용합니다.

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결과

수정 된 TAP 방법 S.로부터 정제 하였다 U1 snRNP, 18 서브 유닛의 리보 핵산 단백질 복합체를 cerevisiae의. 게시 된 프로토콜 2,3 다음 단지의 초기 TAP 정화는 실버 세 밴드는 천연 폴리 아크릴 아미드 겔 (그림 2A)을 염색으로 마이그레이션, 이기종 등장 복합체를 얻었다. 탭 방식의 최적화의 여러 라운드는보다 균일 어셈블리 (그림 2A)를 나타내는 기본 겔로 주로 단일 밴드를 마이그레이션 복합체를 얻었다. 형광 염료를 사용하여 단백질 및 핵산 모두에 대해 염색하기 위해서는 정제 된 복합체가 모두 생체 고분자 본 (도 2b)을 설치 한 것으로 하였다.

정제 된 복합체는 SDS 페이지와 TAP ...

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토론

탭 방식 꽉 선택적 생리 용액 상태의 가까이 유지하려는 욕구와 친 화성 수지에 결합하기위한 필요성의 균형을 두 개의 태그를 이용한다. 이 균형은 정제 후 특성에 대한 계수 (들)와 상호 작용하는 태깅 된 단백질의 안정한 상호 작용 (들)을 유지하는 역할을한다. 또한, 개별 TAP 한 어떤 효모 복잡한에 대한 태그 단백질과 어떤 효모를 얻을 수 있도록하는 ORF는 상용 소스에서 사용할 수있는 태그. 복합체의 무결성 및 정제에 대한 복소 상이한 태그 된 단백질 서브 유닛의 사용을 테스트 할 수있는 자원의 가용성을 보존하는 천연 복합체를 정제 용 TAP 방법을 이용하는 두 가지 장점이있다. 그러나 원래 TAP 방식 프로토콜은 복잡한 정제가 구조적으로 그리고 구조적으로 균일하도록 고안되지 않았다. 이 목표를 달성하기 위하여, 위에서 설명한 바와 같이 TAP 방식은 따라서 수정되었다.

여러TAP 방법의 단계는 조성 및 구조 균일 한 복합체를 정화 할 수있는 최적의 방법과 조건을 설정하...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

저자는 니콜라우스 그리고리에프의 지원과 조언에 감사하고 있습니다. 유용한 토론과 EM 안내에 대해 Anna Loveland, Axel Brilot, Chen Xu 및 Mike Rigney에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립과학재단(National Science Foundation)의 자금 지원을 받았으며, Award No. 1157892. Brandeis EM 시설은 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 보조금 P01 GM62580의 지원을 받습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
S. cerevisiae TAP 태그 균주Open BiosystemsYSC1177TAP 프로토콜을 개발하는 데 사용되는 1차 효모 균주입니다. 배경은 S288C입니다 : ATCC 201388 : MATa, his3 & Delta; 1, leu2Δ 0, met15Δ 0, ura3 &델타; 0, SNU71::TAP::HIS3MX6
커피 그라인더Mr. CoffeeIDS77세포 용해
혈구계에 사용, Bright LineHausser Scientific3120세포 용해 평가에 사용
JA 9.100 원심분리기 로터 벡크만 쿨터, Inc.효모 세포 채취에 사용
JA 20 고정각 원심분리기 로터Beckman Coulter, Inc.불용성 세포 물질
Ti 60 고정각 원심분리기 로터.용해성 세포 추출물을 더욱 투명하게 하는 데 사용됩니다
. ThermomixerEppendorfR5355온도 조절 쉐이커
Novex 젤 시스템Thermo Fisher Scientific 
IgG 수지GE 헬스케어17-0969-01Sepharose 6 고속 흐름
칼모듈린 수지Agilent Technologies, Inc.214303친화성 수지
프로테아제 억제제 칵테일, 미니 정제Sigma Aldrich589297Mini cOmplete ultra EDTA
억제제 칵테일, 대형 정제Sigma Aldrich5892953cOmplete ultra EDTA free 정제
페닐메탄설포닐 플루오라이드(PMSF)이소프로판올
2ml Bio-spin columnBio-Rad에 용해 연구소, Inc.7326008를 포장하고 세척하는 데 사용됩니다
.7311550포장하고 세척하는 데 사용됩니다
. 로드 7.5 μ L 실버 스테인드 젤 및 5 μ SYPRO 루비 스테인 젤
Precast SDS PAGE Bis-Tris 젤Life TechnologiesNP0321Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% 프리캐스트 폴리아크릴아미드 젤 
PageRuler 단백질 표준물질Thermo Fisher Scientific26614에 사용되는 염색되지 않은 단백질 표준물질
Life TechnologiesNP00011x NuPAGE MOPS SDS 버퍼
TAP 항체Thermo Fisher ScientificCAB1001CBP 태그에 대한 1차 항체
2차 항체Thermo Fisher Scientific31341염소 항-토끼 알칼리 인산가수분해효소 결합
BCIP/NBTThermo Fisher Scientific340425-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium 
투석 장치Thermo Fisher Scientific88401Slide-A-Lyzer 미니 투석 장치
원심 필터 장치, 100kDa MWCOEMD MilliporeUFC5100008Amicon Ultra-0.5 Ultracel-100 멤브레인 세제 흡수 비드가 있는 원심 필터 장치
Bio-Rad Laboratories, Inc.1523920Bio-bead SM-2 absorbants
SYBR Green IIThermo Fisher ScientificS-7564핵산 염색용 형광 염료, SYPRO Ruby 존재로 검출 시 488 nm의 excitation 파장 및 532 nm의 방출 파장 사용
SYPRO RubyMolecular ProbesS-12000단백질 염색을 위한 형광 염료, SYBR Green II가 존재하는 상태에서 검출 시 457nm의 여기 파장과 670nm 구리 그리드의 방출 파장을 사용합니다
.전자 현미경 과학G400-CP
의 세포 추출물을 제거하는 데 사용됩니다, Calmodulin 수지 10ml poly-prep column Bio-Rad Laboratories, Inc. IgG 수지 프리캐스트 네이티브 PAGE Bis-Tris 젤 Life Technologies BN1002 Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% 프리캐스트 폴리아크릴아미드 겔 NativeMark 단백질 표준물 Thermo Fisher Scientific LC0725 네이티브 PAGE에 사용되는 염색되지 않은 단백질 표준물을 웨스턴 블로팅 SDS 러닝 버퍼

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