Method Article

탠덤 선호도 태그 방법을 사용하여 구조 연구에 대한 기본 공단의 정화

DOI:

10.3791/54389

⸱

July 27th, 2016

 , 
1Department of Biochemistry, Brandeis University, 2Winship Cancer Institute, Emory University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TAP(Tandem Affinity Purification) 방법은 단백질체학을 위해 주로 진핵생물인 세포 추출물에서 천연 복합체를 분리하는 데 광범위하게 사용되었습니다. 여기에서는 구조 연구를 위한 천연 복합체의 정제에 최적화된 TAP 방법 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

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선호도 정화 방법은 단백체 특성에 대한 기본 복합체를 분리에 성공했다. 구조 이질성과 단지의 조성 이질성의 정도는 일반적으로 연구를 수행의 진행을 방해하지 않습니다. 반대로, 구조적 특성을위한 복합 구성물은 구조적으로 균일뿐만 아니라 프로테오믹스에 필요한 것보다 더 높은 농도 인 상태에서 정제한다. 최근 큰 거대 분자 복합체의 구조 결정을위한 전자 현미경의 적용에 상당한 발전이 있었다. 이것은 전자 현미경으로 구조 결정을위한 충분한 품질과 양의 천연 복합체를 정제하는 방법에 대한 관심이 높아지고있다. 탠덤 선호도 정화 (TAP) 메소드가 18 서브 유닛을 추출하고 정제 최적화되었습니다 ~ 신진 효모에서 0.8 MDA의 리보 어셈블리 (사카로 마이 세스 세레 비지)

Introduction

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다수의 주요 세포 과정 큰 단백질 및 단백질 RNA 복합체 (1)에 의해 수행된다. 같은 단지의 생물 물리학 및 구조 연구를 수행에 중요한 병목 현상은 적절한 품질 (즉, 균질성)의 적절한 농도를 얻을 수있다. 기본 소스에서 복합체를 분리하는 것은 서브 유닛의 관련 포스트 전사 및 / 또는 번역 후 변형을 유지하고 적절한 복잡한 어셈블리를 보장 등 많은 장점을 가지고 있습니다. 그러나, 큰 세포 복합체는 낮은 카피 수에서 종종 세포에 존재하고 정화는 고도로 효율적인하고 복잡한 무결성을 유지하기 위해 주변의 생리적 조건에서 발생해야합니다. 진핵 소스에서 복잡한 정제 특별히 도전하고 재정적으로 금지 될 수 있습니다. 따라서, 효율적이고 균일 한 복합체를 수득 전략 또는 방법이 매우 바람직하다.

된 전략초기 특성화 진핵 세포에서 네이티브 단지를 정화에 성공적 탠덤 선호도 정화 (TAP) 방법 2,3입니다. 탭 방법은 처음 인자 (들)이 상호 작용하는 복잡한의 신진 효모 (S. cerevisiae의)에서 천연 단백질을 정제하기 위해 고안되었다. 탭 방식은 두 개의 태그, 동일한 단백질을 코딩하는 유전자 서열과 나란히 융합 각 태그를 이용했다. 타이트 선택적....

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Protocol

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참고 : 다음 프로토콜 세포 배양의 4 L, 세포의 약 40g 습 중량에서 복잡한의 정제를 위해 고안되었다. 일단 준비, 모든 버퍼가 4 ° C에서 보관 및 준비 개월 이내에 사용해야합니다. 환원제와 단백질 분해 효소 억제제는 사용하기 직전에 버퍼에 추가됩니다.

탠덤 선호도 정화에 대한 전체 세포 추출물 1. 준비

  1. S.의 성장 cerevisiae의 세포
    1. 킬 원하는 TAP는 S. 태그 cerevisiae의 변형 스토리지에서 (-80 ° C) 효모 펩톤 덱 스트로스 상 (YPD) 판. 효모 세포는 흰색 털이 나타날 때까지 5 일 (30 ° C를) - 3 품어.
    2. 50 ML 원뿔 폴리 프로필렌 원심 분리 관에 10 ml의 YPD 매체로 판에서 신선한 세포의 약 2mm 2의 행진을 접종한다. 분당 180 회전 수 (rpm) 하룻밤 (° C ~ 30m)에서 튜브를 흔들어.
    3. 오버 2 ㎖를 접종2 L의 삼각 또는 삼각 플라스크에 YPD 매체의 리터당 밤 문화. 180 rpm으로 (30 °에 C)에서 흔들어. 24 시간 - 늦은 로그 단계까지 2-1.8의 OD (600), 일반적으로 20을 600 nm의 ....

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Results

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수정 된 TAP 방법 S.로부터 정제 하였다 U1 snRNP, 18 서브 유닛의 리보 핵산 단백질 복합체를 cerevisiae의. 게시 된 프로토콜 2,3 다음 단지의 초기 TAP 정화는 실버 세 밴드는 천연 폴리 아크릴 아미드 겔 (그림 2A)을 염색으로 마이그레이션, 이기종 등장 복합체를 얻었다. 탭 방식의 최적화의 여러 라운드는보다 균일 어셈블리 (그림 2A)를 나타내는 기본 겔로 주로 단일 밴드를 마이그레이션 복합체를 얻었다. 형광 염료를 사용하여 단백질 및 핵산 모두에 대해 염색하기 위해서는 정제 된 복합체가 모두 생체 고분자 본 (도 2b)을 설치 한 것으로 하였다.

정제 된 복합체는 SDS 페이지와 TAP .......

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Discussion

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탭 방식 꽉 선택적 생리 용액 상태의 가까이 유지하려는 욕구와 친 화성 수지에 결합하기위한 필요성의 균형을 두 개의 태그를 이용한다. 이 균형은 정제 후 특성에 대한 계수 (들)와 상호 작용하는 태깅 된 단백질의 안정한 상호 작용 (들)을 유지하는 역할을한다. 또한, 개별 TAP 한 어떤 효모 복잡한에 대한 태그 단백질과 어떤 효모를 얻을 수 있도록하는 ORF는 상용 소스에서 사용할 수있는 태그. 복합체의 무결성 및 정제에 대한 복소 상이한 태그 된 단백질 서브 유닛의 사용을 테스트 할 수있는 자원의 가용성을 보존하는 천연 복합체를 정제 용 TAP 방법을 이용하는 두 가지 장점이있다. 그러나 원래 TAP 방식 프로토콜은 복잡한 정제가 구조적으로 그리고 구조적으로 균일하도록 고안되지 않았다. 이 목표를 달성하기 위하여, 위에서 설명한 바와 같이 TAP 방식은 따라서 수정되었다.

여러TAP 방법의 단계는 조성 및 구조 균일 한 복합체를 정화 할 수있는 최적의 방법과 조건을 설정하.......

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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저자는 니콜라우스 그리고리에프의 지원과 조언에 감사하고 있습니다. 유용한 토론과 EM 안내에 대해 Anna Loveland, Axel Brilot, Chen Xu 및 Mike Rigney에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립과학재단(National Science Foundation)의 자금 지원을 받았으며, Award No. 1157892. Brandeis EM 시설은 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 보조금 P01 GM62580의 지원을 받습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
S. cerevisiae TAP 태그 균주Open BiosystemsYSC1177TAP 프로토콜을 개발하는 데 사용되는 1차 효모 균주입니다. 배경은 S288C입니다 : ATCC 201388 : MATa, his3 & Delta; 1, leu2Δ 0, met15Δ 0, ura3 &델타; 0, SNU71::TAP::HIS3MX6
커피 그라인더Mr. CoffeeIDS77세포 용해
혈구계에 사용, Bright LineHausser Scientific3120세포 용해 평가에 사용
JA 9.100 원심분리기 로터 벡크만 쿨터, Inc.효모 세포 채취에 사용
JA 20 고정각 원심분리기 로터Beckman Coulter, Inc.불용성 세포 물질
Ti 60 고정각 원심분리기 로터.용해성 세포 추출물을 더욱 투명하게 하는 데 사용됩니다
. ThermomixerEppendorfR5355온도 조절 쉐이커
Novex 젤 시스템Thermo Fisher Scientific 
IgG 수지GE 헬스케어17-0969-01Sepharose 6 고속 흐름
칼모듈린 수지Agilent Technologies, Inc.214303친화성 수지
프로테아제 억제제 칵테일, 미니 정제Sigma Aldrich589297Mini cOmplete ultra EDTA
억제제 칵테일, 대형 정제Sigma Aldrich5892953cOmplete ultra EDTA free 정제
페닐메탄설포닐 플루오라이드(PMSF)이소프로판올
2ml Bio-spin columnBio-Rad에 용해 연구소, Inc.7326008를 포장하고 세척하는 데 사용됩니다
.7311550포장하고 세척하는 데 사용됩니다
. 로드 7.5 μ L 실버 스테인드 젤 및 5 μ SYPRO 루비 스테인 젤
Precast SDS PAGE Bis-Tris 젤Life TechnologiesNP0321Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% 프리캐스트 폴리아크릴아미드 젤 
PageRuler 단백질 표준물질Thermo Fisher Scientific26614에 사용되는 염색되지 않은 단백질 표준물질
Life TechnologiesNP00011x NuPAGE MOPS SDS 버퍼
TAP 항체Thermo Fisher ScientificCAB1001CBP 태그에 대한 1차 항체
2차 항체Thermo Fisher Scientific31341염소 항-토끼 알칼리 인산가수분해효소 결합
BCIP/NBTThermo Fisher Scientific340425-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium 
투석 장치Thermo Fisher Scientific88401Slide-A-Lyzer 미니 투석 장치
원심 필터 장치, 100kDa MWCOEMD MilliporeUFC5100008Amicon Ultra-0.5 Ultracel-100 멤브레인 세제 흡수 비드가 있는 원심 필터 장치
Bio-Rad Laboratories, Inc.1523920Bio-bead SM-2 absorbants
SYBR Green IIThermo Fisher ScientificS-7564핵산 염색용 형광 염료, SYPRO Ruby 존재로 검출 시 488 nm의 excitation 파장 및 532 nm의 방출 파장 사용
SYPRO RubyMolecular ProbesS-12000단백질 염색을 위한 형광 염료, SYBR Green II가 존재하는 상태에서 검출 시 457nm의 여기 파장과 670nm 구리 그리드의 방출 파장을 사용합니다
.전자 현미경 과학G400-CP
의 세포 추출물을 제거하는 데 사용됩니다, Calmodulin 수지 10ml poly-prep column Bio-Rad Laboratories, Inc. IgG 수지 프리캐스트 네이티브 PAGE Bis-Tris 젤 Life Technologies BN1002 Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% 프리캐스트 폴리아크릴아미드 겔 NativeMark 단백질 표준물 Thermo Fisher Scientific LC0725 네이티브 PAGE에 사용되는 염색되지 않은 단백질 표준물을 웨스턴 블로팅 SDS 러닝 버퍼

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
  2. Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Seraphin, B.

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Tandem Affinity PurificationNative Complex PurificationStructural Homogeneity AssessmentYeast Cell LysisIgG Sepharose BindingTEV Protease CleavageCalmodulin Affinity BindingNegative Stain EMSDS PAGE AnalysisMass Spectrometry Identification

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