이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

성인을위한 맛의 기본 설정 분석

9.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54403

⸱

2016년 9월 8일

 , 
1Department of Medical and Molecular Genetics, Indiana University School of Medicine-South Bend

이 논문에서

요약

미각은 유익한 물질에 대한 끌림과 독성 물질의 회피를 용이하게 하는 중요한 감각 과정입니다. 이 프로토콜은 주어진 화합물에 대한 초파리 미각 선호도를 결정하기 위한 간단한 섭취 분석을 설명합니다.

초록

환경에 대한 후각과 미각적 인식은 동물의 생존에 필수적입니다. 이러한 케모센스의 가장 분명한 응용 분야는 좋은 식품 공급원과 잠재적으로 위험한 식품 공급원을 구별할 수 있는 것입니다. Gustation은 뉴런 표면에서 발현되는 미각 수용체를 통해 신호를 보낼 수 있는 화합물과의 물리적 접촉을 필요로 합니다. 곤충의 경우 이러한 미각 뉴런이 동물의 몸 전체에 위치할 수 있어 미각이 다양한 행동에서 중요한 역할을 할 수 있습니다. 곤충은 일반적으로 설탕이 함유된 화합물을 선호하지만 쓴 맛이 나는 것으로 간주되는 화합물은 피합니다. 미각의 기본적인 생물학적 중요성을 감안할 때, 이 감각 양식의 기저에 있는 분자 메커니즘을 이해하는 데 지대한 관심이 있습니다. 우리는 주어진 맛 화합물에 대한 동물의 선호도를 반영하는 성인 Drosophila 맛 분석을 설명합니다. 이 분석은 원하는 용해성 화합물에 대한 미각 선호도를 조사하기 위해 모든 유전적 배경을 가진 동물에 적용할 수 있습니다.

서론

동물 불리한 조건에서 떨어져 유리한 조건을 구별하는 chemosensation를 사용합니다. 이 인식은, 최고의 음식 소스를 결정하는 독성 물질을 피하거나 가장 짝짓기 파트너 일을 결정하는 등의 것들에 대한 중요 할 수 있습니다. 후각의 감각과 미각 감각 : Chemosensation은 종종 두 개의 감각 구성 요소로 나누어 져 있습니다. 이러한 감각의 주요 구별되는 특징은 후각 (냄새) 맛보기 (맛) 비 휘발성 기판과 물리적 접촉을 필요로하는 동안 주위의 가스 화학 환경을 샘플링하는 데 사용되는 것입니다. 두 감각 양식을 처리하고 적절한 매력적인 또는 척력이 동작을 생성하기 위해 뇌에서 디코딩되는 신경 반응을 자극한다. 이 감각은​​ 동물의 생존을위한 따라서 중요합니다.

초파리 비행 열매는 이해에 사용하기 위해 인기가 성장을 계속하고 모델 생물이다곤충은 냄새와 맛을 감지하는 방법을 보내고. 초파리 때문에, 분자 세포, 행동 경로의 해부에 사용할 유전 도구의 재산에 다른 모델 시스템에 비해 엄청난 장점을 제공한다. 지난 15 년 동안 작업은 특정 세포 정체성, 신경 수용체를 특성화하고, 냄새와 맛 모두에 관여하는 메커니즘을 신호에 특히 쓸모있다. 지금, 초파리 유전학의 힘은 더욱 이러한 프로세스는 하나의 신경 세포 및 단일 회로 레벨 3-6에서 코딩하는 방법을 명료하게 사용되고있다. 따라서, 제공하는 분석은 쉽게 감각 경로에 변화의 판독이 분야의 지속적인 사전에 매우 중요 얻었습니다.

많은 코딩 뇌에서 처리하는 방법 후각 신호에 대해 알려져 있지만, 훨씬 덜은 미각 경로와 유사한 메커니즘에 대한 이해된다. 우리는 여기서 맛 preferen을 확인하는 데 사용될 수있는 프로토콜을 설명쓴 맛 화합물 반대로 초파리. 초파리의 CE 마크는 포유 동물처럼, 일반적으로 달콤한 맛 화합물을 선호합니다. 이러한 음식 소스의 조합은 알려진 유전 적 변화가 맛 선택에 영향을 미치는 방법을 결정하기 위해이 실험 설계에 이용 될 수있다. 또한, 약리학 적 개입 전략은 유사 동물의 맛이 환경에 미치는 영향에 대해 평가 될 수있다. 이 분석의 용이성과 유연성 초파리 미각 지각의 특성을 이해하는 것이 유용에게 패러다임을 만든다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

1. 기아

  1. 표준 플라이 유리 병의 하단에 18.2 MΩ 물 목화 공을 포화에 의해 기아 튜브를 비행 준비합니다. 다르게는, 유사 바이알 내의 각도 18.2 MΩ 물 장소 여과지의 작은 조각을 포화.
  2. 준비된 유리 병에 파리를 추가 한 후 CO 2 패드 ~ 100 동물의 세트로 파리를 수집합니다.
    참고 : 최상의 결과 미만 5 일 이전입니다 동물 얻을 수있다. 그러나, 동물의 실제 나이는 시간에 기본 맛의 변화를 결정하는 변수로 실험을 제어 할 수있다.
  3. 유리 병 폐쇄 확보하기 위해 목화 공 또는 거품 스토퍼를 사용합니다. 환경 제어 배양기에서 그들의 편에서 튜브를 놓습니다. 25 ° C의 온도, 70 % 이상의 습도를 유지한다. 24 시간 동안 그대로 튜브를 남겨주세요.

2. 맛 선호도 분석

  1. 같은 날 A의 분석에 대한 모든 tastants 준비의 테스트.
    참고 : 실험 질문에 따라 달라집니다 사용되는 정확한 tastants이 요구된다. 다음은이 프로토콜에서 사용되는 예제 tastants 있습니다. 최적화를위한 부 (4)를 참조하십시오.
    1. 100 밀리미터 자당 용액 10 μL, 붉은 식용 색소의 13 μL, 18.2 MΩ 물 977 μl를 조합하여 제어 tastant (1 mM의 자당)을 준비합니다.
    2. 100 밀리미터 자당 용액 50 μL, 파란색 식용 색소의 10 μL, 18.2 MΩ 물 940 μl를 결합하여 실험 tastant (5 MM의 자당)을 준비합니다.
  2. 다음과 같은 방법으로 제조 된 표준 100mm X 15mm의 플라스틱 페트리 접시를 사용하여 분석을 챔버 :
    1. 12시 방향 판의 가장자리에 가까운 제어 tastant 세 10 μl의 방울, 6시 방향에 다른 3 방울을 배치합니다. 방울 사이의 간격이 유사하다는 것을 확인하십시오.
    2. 3시하고있는 플레이트의 가장자리에 가까운 실험 tastant 세 10 μL 방울을 배치다른 3 9시에 삭제합니다. 방울 사이의 간격이 유사하다는 것을 확인하십시오.
    3. 원하는대로 반복 많은 복제에 대한 2.2.1와 2.2.2 단계를 반복합니다.
  3. 다만 충분히 모든 동물 (약 10 초)를 마취하는 CO 2 패드 상 ~ 100 굶주린 파리의 빈 1 병. 준비된 분석 챔버의 중앙으로 동물을 브러시와 접시의 뚜껑을 커버.
    주 : CO 2 노광 장기간의 공급 동작과 복구 시간 제한 및 간섭을 개선하기 위해 피해야한다. 얼음에 노출 (~ 5 분)의 제한에도 노출로부터 발생하는 CO 2 행동 효과를 피하기 위해 마취를 위해 사용될 수있다.
  4. 불투명 한 골판지 상자에 분석 챔버를 놓습니다. 조건과 유전자형이 테스트되고 함께 상자의 외부에 라벨을해야합니다.
  5. 2 시간 동안 적어도 70 % 습도와 25 ° C 배양기에 전체 설치 (단계 2.4에서 골판지 상자에 포함 된 분석 챔버)를 놓습니다.
  6. 반복 모든 복제 2.5을 통해 2.3 단계를 반복합니다.
  7. 2시간 후, 직접 정량에 대한 준비가 될 때까지 -20 ° C 냉장고에 여전히 골 판지 상자에 포함 된 분석 챔버를 배치합니다.

3. 맛 특혜 분석의 정량화

  1. 하나의 분석 챔버는 실온 (약 5 분)을 따뜻하게 할 수 있습니다.
  2. 빨강, 파랑, 보라색 또는 클리어 (그림 1) : 해부 현미경, 브러시 또는 집게의 쌍을 사용하여, 그룹 동물 자신의 복부의 색상에 따라.
  3. 각 그룹에서의 동물의 수를 기록한다. 어떤 계산에 포함하지 않는 때문에 분석에 참여하지 않은 명확한 동물을 고려합니다.
  4. 하기 식 중 어느 한 항에있어서, 상기 선호 지수를 계산한다 :
    1. + N 블루 +의 N의 purpl 관심의 실험 tastant가 붉은 염료에 추가되면, 사용 (N 빨간색 + 0.5N 보라색) / (N 레드전자).
    2. 실험 tastant가 파란색 염료에 추가되면, 다음 (N 블루 보라색 + 0.5N) / (N 블루 + N 빨간색 + N 보라색)에 식을 조정합니다.
  5. 모든 실험 조건 및 복제에 대한 계산을 반복합니다.

맛의 기본 설정 분석 4. 최적화

  1. 경험적 식용 색소가 맛이 분석의 결과에 영향을주지 않도록 다음과 같이 사용되는 식용 색소 지표의 농도를 결정 :
    1. 단계 2.1로 표시된 동일한 염기 화합물 (예, 5 mM의 크로스)를 사용하여 4 tastants 준비했지만 식용 색소를 생략.
    2. tastants 중 하나에 1.3 % 붉은 식용 색소를 추가합니다. 각 튜브에 다양한 농도의 파란색 식용 색소 (예 : 0.6 %, 1 %, 1.3 %)와 나머지 3 tastants합니다.
    3. 전체 프로토콜은 각 tastant 쌍 3.4을 통해 2.2 단계 : 0.6 % 청색 1.3 %, 적색 대; 1.3 % 빨간색 대 1 % 파란색과1.3 % 빨간색 대 1.3 % 파란색.
    4. 선호 지수 평균 때까지 파란색 식용 색소의 다른 비율을 0 (그림 2)의 값이 단계를 반복 4.1.1-4.1.3.
      참고 : 시작 지점으로, 1 % 파란색 식용 색소와 결합 1.3 % 빨간색 식용 색소는 일반적으로 좋은 결과를 얻을 수 있습니다. 파란색 식용 색소의 만족스러운 농도가 1.3 % 염료와 일치 할 수없는 경우, 4.1.3을 통해 4.1.1이 붉은 색과 파란색 식용 색소의 일정한 농도의 다양한 농도로 반복 될 수있다 단계.
    5. 같은 최적화 된 식용 색소의 농도 테스트 할 모든 조건을 분석합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

맛을 선호 분석에서 몇 가지 전형적인 결과는 다음과 같습니다. 대부분의 실험에서 복부 색상의 강도에 약간의 변화는 (그림 1) 볼 수 있습니다. 강한 또는 약한 여부 복부의 모든 색상이 양의 섭취로 간주됩니다. 잠재적 인 편견을 제한하기 위해 연구자들은 실험 조건에있는 동안 블라인드 동물을 득점하는 것은 그러므로 것이 좋습니다.

환경 분석의 결과에 영향을 미치지 않는 식품 염료의 농도를 선택하는 것도 중요하다. 각종 식용 색소 농도를 사용의 결과의 일례는도 2에 도시 푸른 식품 색소의 양이 변화하는 동안,이 실시 예에서, 적색 식품 색소의 양이 1.3 %로 유지 하였다. 0.6 %, 1 % 및 1.3 %. 각각의 염료는 분석에서 참가자의 높은 비율을 보장 5mM의 자당을 첨가 하였다. 맛의 prefe...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

우리는 초파리 취향 우선 순위를 결정하기위한 단순하지만 효율적인 프로토콜을 설명 하였다. 이 분석의 버전은 정기적으로 맛 화합물 (쓴맛, 단맛, 신맛, 짠맛,​​ 감칠맛과) 다른 특성을 지각에 미각 수용체 (GRS)의 기여를 결정하기 위해 실험에 사용된다. 초파리 게놈 대체 접합 8,9에 의해 68 식별 미각 수용체를 인코딩 약 60 유전자가 포함되어 있습니다. 그러나, 이러한 이온 성 글루타메이트 수용체와 TRP 채널과 같은 다른 단백질은 맛 10-13에 중요한 역할을하는 것으로 입증되었다. 따라서, 곤충의 맛의 차별적 전력의 광범위한 다양성이있다. 또한, 냄새 수용체는 달리, 맛 수용체는 모든 비행 위에 위치 세포에서 발현된다. 다른 맛 수용체를 발현하는 신경 세포의 조합을 포함 Sensilla는 labellum, 다리, 날개에 14 산란관 찾을 수 있습니다. 이와 같이,초파리는 구애와 계란 누워 포함 영양 인수 이후...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 원고를 비판적으로 읽고 이 프로토콜을 준비하는 동안 유용한 제안을 해 주신 Tessier 연구실 구성원에게 감사드립니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
블루 식용 색소 (물, 프로필렌 글리콜, FD & C 블루 1 및 레드 40, 프로필 파라벤)McCormickN / A
Cryo / Freezer Boxes w / oDividers Fisher03-395-455
Dumont # 5 ForcepsFine Science Tools11251-20
빙하 아세트산FisherBP2401-500
Leica S6 E 스테레오 줌 0.63X-4.0X 현미경W. Nuhsbaum, Inc.
페트리 접시(100mm x 15mm)BD Falcon351029철저히 세척 및 건조하면 재사용 가능
Quick-Snap MicrotubesAlkali Scientific Inc.C3017
빨간 식용 색소 (물, 프로필렌 글리콜, FD& C Reds 40 및 3, 프로필파라벤)McCormickN/A
자당IBI ScientificIB37160
10446294

참고문헌

  1. Herrero, P. Fruit fly behavior in response to chemosensory signals. Peptides. 38 (2), 228-237 (2012).
  2. Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annu Rev Neurosci. 30, 505-533 (2007).
  3. Harris, D. T., Kallman, B. R., Mullaney, B. C., Scott, K. Representations of Taste Modality in the Drosophila Brain. Neuron. 86 (6), 1449-1460 (2015).
  4. Hong, E. J., Wilson, R. I. Simultaneous encoding of odors by channels with diverse sensitivity to inhibition. Neuron. 85 (3), 573-589 (2015).
  5. Kain, P., Dahanukar, A. Secondary taste neurons that convey sweet taste and starvation in the Drosophila brain. Neuron. 85 (4), 819-832 (2015).
  6. Masek, P., Worden, K., Aso, Y., Rubin, G. M., Keene, A. C. A dopamine-modulated neural circuit regulating aversive taste memory in Drosophila. Curr Biol. 25 (11), 1535-1541 (2015).
  7. Charlu, S., Wisotsky, Z., Medina, A., Dahanukar, A. Acid sensing by sweet and bitter taste neurons in Drosophila melanogaster. Nat Commun. 4, 2042(2013).
  8. Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287 (5459), 1830-1834 (2000).
  9. Scott, K., et al. A chemosensory gene family encoding candidate gustatory and olfactory receptors in Drosophila. Cell. 104 (5), 661-673 (2001).
  10. Kim, S. H., et al. Drosophila TRPA1 channel mediates chemical avoidance in gustatory receptor neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8440-8445 (2010).
  11. Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a clade of ionotropic receptors are candidate taste and pheromone receptors. Neuron. 83 (4), 850-865 (2014).
  12. Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
  13. Zhang, Y. V., Raghuwanshi, R. P., Shen, W. L., Montell, C. Food experience-induced taste desensitization modulated by the Drosophila TRPL channel. Nat Neurosci. 16 (10), 1468-1476 (2013).
  14. Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral coding of taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
  15. Rodrigues, V., Cheah, P. Y., Ray, K., Chia, W. malvolio, the Drosophila homologue of mouse NRAMP-1 (Bcg), is expressed in macrophages and in the nervous system and is required for normal taste behaviour. EMBO J. 14 (13), 3007-3020 (1995).
  16. Tanimura, T., Isono, K., Yamamoto, M. T. Taste sensitivity to trehalose and its alteration by gene dosage in Drosophila melanogaster. Genetics. 119 (2), 399-406 (1988).
  17. Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
  18. French, A. S., et al. Dual mechanism for bitter avoidance in Drosophila. J Neurosci. 35 (9), 3990-4004 (2015).
  19. Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

초파리 미각 분석미각 선호도 검사설탕 농도 분석식용 색소 정량화CO2 마취법페트리 접시 설정배양기 환경 제어냉동 보관 기술해부 현미경 관찰복부 색상 그룹화
성인을위한 맛의 기본 설정 분석
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.