방법 논문

Zebrafish의 배아에서 내인성 수용체의 친화력 레이블 검출

DOI:

10.3791/54405

⸱

2016년 8월 31일

 ,  , 
1Cell and Developmental Biology, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México

이 논문에서

요약

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제브라피시 배아에 존재하는 저농도 내인성 수용체를 검출하기 위한 새로운 기술이 설명됩니다. 우리는 이를 AFLIP이라고 명명했는데, 이는 면역침전과 연결된 리간드에 의한 수용체의 친화성 표지로 구성되어 있기 때문입니다.

초록

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Affinity Labeling과 Immunoprecipitation(AFLIP)의 힘을 결합하여 제브라피시 배아에서 낮은 농도의 수용체를 검출하는 기술이 구현되었습니다. 이 기술은 면역침전의 특이성과 함께 리간드에 의한 주어진 수용체의 친화성 표지에 의해 부여되는 선택성과 민감도를 활용합니다. 우리는 AFLIP를 사용하여 초기 제브라피시 발달 과정에서 베타글리칸으로도 알려진 III형 TGF-β 수용체(TGFBR3)를 검출했습니다. AFLIP는 TGFBR3 morphant 제브라피시 표현형의 효능을 검증하는 데 중요한 역할을 했습니다. 첫 번째 단계에서는 배아 단백질 추출물을 준비하고 사용하여 면역침전으로 정제된 125개의 I-TGF-β2-TGFBR3 복합체를 생성합니다. 나중에, 이러한 복합체는 공유 가교되고 SDS-PAGE 분리 및 자가방사선 촬영 검출을 사용하여 드러납니다. 이 기술은 검출할 수용체에 대해 표지된 리간드와 이에 대한 특정 항체의 가용성을 필요로 하며, 이러한 요구 사항을 충족하는 성장 인자 또는 사이토카인 수용체를 식별하기 위해 쉽게 적응할 수 있어야 합니다.

서론

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RT-PCR 또는 ISH(in situ hybridization)로 동족 mRNA를 측정하여 얻은 발현 프로파일을 검증하려면 배아 발달 중에 발현된 단백질의 특정 검출이 필요합니다. 이는 일반적으로 배아 추출물의 웨스턴 블롯(western blot)을 주입한 후 특정 항체를 검출함으로써 달성됩니다. 그러나 이 접근법은 함량이 매우 낮거나 블로팅(blotting) 중 정량적 전달을 방해하는 특성을 가진 단백질에는 적용하기 어렵습니다. 제3형 형질전환 성장 인자 β(TGF-β) 수용체(TGFBR3)로도 알려진 베타글리칸이 이러한 어려움의 한 예입니다. TGFBR3는 핵심 단백질1을 통해 TGF-β와 결합하는 시간제 멤브레인 프로테오글리칸으로, 다른 TGF-β 결합 단백질2와 구별되는 특성인 동형 TGF-β2에 대한 친화력이 현저히 높습니다. 제브라피쉬의 TGFBR3는 8 hpf 부터 발현되며, mRNA3의 RT-PCR에 의해 검출된 바와 같이 최대 72 hpf에 도달합니다.

그러나 매우 특이적인 항체3을 사용할 수 있음에도 불구하고 웨스턴 블롯으로 번역된 산물을 검출하려는 모든 시도는 성공하지 못했습니다. TGFBR3의 프로테오글리칸 특성과 낮은 함량이 이러한 실패의 원인일 수 있다고 판단하여 TGF-β2에 대한 TGFBR3의 높은 친화도를 활용하는 검출 방법인 AFLIP가 고안되었습니다. 이 방법에서는 풀링된 배아에서 단백질 추출물이 125I-표지된 TGF-β2와 특이적으로 결합할 수 있으며, 수용체-리간드 복합체는 면역침전으로 정제되고 SDS-PAGE에 의한 분리 전에 가교됩니다. 겔의 자가방사선 촬영에 의해 관찰된 이동 패턴은 표지된 수용체 종의 존재와 특성을 보여주었습니다. 이 접근법은 친화성 표지의 리간드 특이성과 특정 항체에 의한 면역침전을 결합하여 검출 범위를 늘리고 TGFBR3의 비효율적인 전달 블로팅을 방지합니다. AFLIP 분석은 고유한 특성으로 인해 정량적 분석은 아니지만 분석된 수용체의 상대적 실험적 차이를 자신 있게 측정하는 데 사용할 수 있습니다.

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프로토콜

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동물에서 수행 모든 실험은 CICUAL 프로토콜 번호로, 실험 동물 관리 및 멕시코의 자치 대학교 (UNAM)의 사용을위한위원회의 승인을했다 : FLC40-14. (CICUAL "Comité Institucional 파라 엘 Cuidado y를 USO 드 로스 짐승 같은 드하기 Laboratorio 델 연구소의 드 Fisiologìa Celular, 대학교 나시 오날 자치시 드 멕시코").

배아 단백질 추출물 1. 준비

  1. 각 조건은 예를 들어 72 시간 포스트 수정 (HPF)를 위해, 원하는 단계에서 (morphants 대 야생형)을 비교하기 위해 200 배아 - (100)를 수집합니다.
  2. 물고기의 물을 함유하는 배양 접시에 장소 배아는 (표 1 참조) 수동 뾰족한 집게를 사용하여 배아를 dechorionate. 이 대상 수용체을 소화 수 있으므로이 단계 (또는 프로토콜을 통해 다른 단백질 분해 효소) 동안 프로 나제​​를 사용하지 마십시오.
  3. 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 넣어 배아 및 배아 TW 씻어1X 인산 완충 용액 (PBS)와 얼음 (표 1 참조).
  4. deyolk 버퍼 500 μL를 추가 (표 1 참조).
  5. (- 40 배 30) 용액에 배아를 부드럽게 아래로 피펫 팅에 의해 노른자의 대부분을 놓습니다. 72 HPF, 48 HPF의 배아를 들어 각각 파란색과 노란색 피펫 팁을 사용합니다. 노란색 끝은 약간 배아를 파괴하지 않도록 절단해야 할 수도 있습니다. 성공적인 노른자 자료는 현미경으로 배아를 관찰하여 확인할 수 있습니다.
  6. 15 초 동안 600 XG에서 원심 분리하여 배아를 수집합니다.
  7. 피펫을 사용하여 조심스럽게 상층 액을 버린다.
  8. 워시 배아 회 500 ㎕의 세척 완충액으로 부드럽게 최저 속도 텍싱하여 (표 1 참조).
  9. 15 초 동안 600 XG에서 원심 분리하여 배아를 수집합니다.
  10. 여기에서 시작, 4 ° C에서 절차를 계속합니다.
  11. 피펫을 사용하여 조심스럽게 상층 액을 버린다.
  12. 용해 완충액 350 μL에 재현 탁 배아 (표 1 참조)과 플라스틱 유봉을 사용하여 균질화한다.
  13. 4 ° C에서 테스트 튜브 로커에 용해 배아를 교반하면서 30 분을 품어.
  14. 원심 분리하여 불용성 잔사를 제거하기 위해 15 분 동안 11,000 XG에서 배아를 용해.
  15. 전송 신선한 튜브에 피펫을 이용하여 상층 액을 깨끗이 밀어 냈습니다.
  16. 브래드 포드 (Bradford) 단백질 분석 (4), 또는 다른 적절한 방법에 의해 전체 단백질을 결정한다. 브래드 포드 분석법이 사용되는 경우가 4 표준 단백질의 과소 원인으로, 용해 버퍼에 세제 선물 동등한 농도의 존재 검량선을 수행한다.

2. 감지 내인성 수용체 단백질의

  1. 선호도 라벨링 및 면역 침전 (모든 단계 4 O를 C에서)
    1. 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 총 배아 단백질의 500 μg의 버퍼 1 (표 1 참조) 1 μg의 / μL로 희석 - (400)를 배치합니다.
      주 : 약 100 배의 총 단백질 500 μg의 획득하기 위해서 - 200 배아 초기 처리되어야한다. 72 HPF 배아는 정기적으로 betaglycan 검출을위한 충분한 총 배아 단백질의 ~ 5 μg의를 얻을.
    2. 150 오후 최종 농도에 도달하고 4 ° C에서 테스트 튜브 로커 2 시간에 교반 배양 표시 TGF-β2 주식의 충분한 볼륨을 추가합니다. AFLIP이 시작되기 전에 Cheifetz 등. (5)에 의해 설명 된 바와 같이 TGF-β2는 클로라민 T 법에 의해 125 I로 표시해야합니다.
      주의 : 내가 리간드 레이블 (125)를 처리하는 동안 노출을 최소화하기 위해 차폐.
    3. (100) 희석 (배양이 O / N 수있다) 4 ° C에서 또 다른 2 시간 동안 배양을 계속 : 1에 도달하기 위해 관심있는 수용체에 대한 희석 항체의 충분한 볼륨을 추가합니다. 따라서 본 연구에서 사용하고 다른 3을 설명하지만,의 품질에 따라, 항혈청 번호 (31)의 최적의 희석이고tibody, 큰 또는 작은 희석 최적 일 수있다.
    4. 적절한 면역 글로불린 결합 구슬의 50 μl를 추가합니다 (예를 들어, 이전에 TNTE에서 평형 1 재현 탁 G 단백질 세 파로스, : TNTE에서 원래 볼륨의 5)를 4 °에서 테스트 튜브 로커에 교반과 함께 50 분 동안 품어 기음.
    5. 20 초 동안 11,000 XG에서 microcentrifugation으로 구슬을 복구 할 수 있습니다.
    6. 적절한 방사성 쓰레기 용기에 상층 액을 버린다.
    7. 20 초 때마다 11,000 XG에, 텍싱 및 microcentrifugation에 의해 IP 세척 버퍼 (표 1 참조) 1 ㎖로 IP-구슬 세 번 씻으십시오.
    8. 재현 탁 IP-구슬 IP 세척 버퍼 250 μL있다.
    9. (10 ㎎ / ㎖에서 DMSO에 용해 DSS) 숙신 이미 딜 수베의 1.5 μl를 추가합니다. 바로이 단계에서의 사용 전에 DSS 솔루션을 준비합니다.
    10. 교반 4 ° C에서 15 분 동안 품어.
    11. 가교 반응을 종결하기 위해, 500 ㎕의 O를 추가충분히 트리스 - CL pH 7.4의 재고 보충 F IP 세척 버퍼는 25 mM 트리스 - (CL)에 도달한다. 트리스의 유리 아미노산 그룹은 미 반응 DSS를 캡처합니다.
    12. 20 초 동안 11,000 XG에 원심 분리기는 IP-구슬을 수집하고 뜨는을 폐기합니다.
    13. 재현 탁 IP 비드 램리 완충액 30 μL 감소한다.
    14. 삶아 샘플 94 ° C에서 5 분.
    15. 선택적으로, 제조업 자의 프로토콜을 사용하여 감마 계수기에서 샘플을 분석한다.
  2. 샘플 분석
    1. SDS-PAGE를 변성에 따라 샘플. 수용체의 질량에 해당하는 비율로 폴리 아크릴 아미드를 사용하여 표준 절차에 따라 젤을 실행합니다.
    2. 고정 제 용액에서 겔을 담그고 실온에서 30 분 동안 (표 1 참조).
    3. 15 분 동안 증류수로 젤을 씻으십시오.
    4. 이전에 수화 필터 종이에 젤을 놓고 사란 랩 필름 커버.
    5. 1 시간 동안 80 ° C에서 건조 젤.
    6. 흰색은 phosphorimager의 scre에 젤을 노출RT O / N에서 엉.
    7. 제조 업체의 프로토콜을 사용하여은 phosphorimager를 사용하여 노출 된 화면을 검색합니다.

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결과

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그림 1은 AFLIP 얻은 대표적인 결과를 보여줍니다. 125 I-리간드에서 온 레인 1 신호는 공유 (150 kDa의 마커 아래 BG 코어) 제브라 피쉬 betaglycan 핵심 단백질 또는 글리코 사 미노 글리 칸의 첨부 파일 (GAG, 도말하여 프로테오글리칸 형태로 처리 된 BG 코어 중 하나에 연결된 ) 170 kDa 내지 겔의 상단까지. 마이그레이션이 패턴 날카로운 코어 단백질 플러스 (GAG 때문에 사슬의 길이 이질성)를 도말 프로테오글리칸은 TGFBR3이 특징이다. DSS에 공유 결합 매 리간드 - 수용체 복합체 형성에 연결되지 않기 때문에, 겔 (125 I-TGF-β2)의 이동 앞에 나타나는 125 I-리간드 무연있다. 이 유리 리간드가 수용체에 결합하고, 결합 된 면역 중에 남아 있지만 공유 결합 부착되지 때문에, SDS-PAGE 과정에서 분리....

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토론

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관심의 단백질에 대한 특이 항체와 서양 말의 사용은 배아 발생 동안 발현 7을 연구하는 유용한 도구입니다. 그러나, 높은 당화 단백질의 면역 인해 자신의 비효율적 인 전송 및 니트로 셀룰로오스 또는 PVDF 막 8,9 약한 결합을 매우 성공적으로되지 않았습니다.

프로테오글리칸 때문에 음전하를하고 폴리스티렌 표면 또는 소수성 블로 팅 막 중 하나에 잘 결합하지 않는 자신의 공유 부착 글리코 사 미노 글리 칸 체인 (GAG)으로, 이러한 단점의 좋은 예이다. 또한, GAG 사슬의 크기 이질성 효과적으로 오의 면적당의 양을 감소 겔의 섹터에 걸쳐 단백질을 "확산". 관심의 단백질 발현 수준이 낮은 경우뿐만 아니라, 정기적 인 웨스턴 블랏에 의해 그 검출은 어려운 작업이다. 수용체 (TGFBR3) 또는 betaglycan β 유형 III 형질 전환 성장 인자(BG), 제브라 피쉬 3 개의 GAG의 부착 포유...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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저자는 물고기 관리 및 유지 관리에 대해 Gilberto Morales에게 감사하고, 토끼 예방 접종에 도움을 준 Claudia Rivera 박사와 Hector Malagòn 박사(IFC-UNAM Animal Facility)에게 감사를 표합니다. 이 작업은 CONACYT 131226와 PAPIIT-DGAPA-UNAM IN204916의 보조금으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
디숙시니미딜 수산염 (DSS)ThermoFisher Scientific21555
단백질 G 세파로스 4 빠른 흐름GE 헬스케어 생명과학17-0618-01
젤 건조기 모델 583 BIO-RAD1651745
Typhoon 9400GE Healthcare Life Sciences63-0055-78
Cobra II 자동 감마 카운터Packard
노출 카세트분자 역학63-0035-44
NaClJ.T. Baker3624
KClJ.T. Baker3040
Na2HPO4J.T. Baker3828
K2HPO4J.T. Baker3246
CH3OHJ.T. 베이커9070
CH3COOHJ.T. 베이커9508
HCHOJ.T. 베이커2106
SDS시그마-알드리치L4509
EDTA, 시그마-알드리치ED
, 트리톤 X-100시그마-알드리치T9284
CaCl2시그마-알드리치C3306
, NaHCO3Fisher ScientificS233
PMSF, 시그마-알드리치P7626
크리스탈 씨 마린 믹스해양 기업 국제http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix
, , ,

참고문헌

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  4. Bradford, M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
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