방법 논문

양적 응용 프로그램에 대한 균일 MALDI 시료의 제조

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DOI:

10.3791/54409

⸱

2016년 10월 28일

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1Genomic Research Center, Academia Sinica, 2Department of Chemistry, National Taiwan University, 3Department of Chemical Engineering and Biotechnology, National Taipei University of Technology

이 논문에서

요약

샘플 건조 공정 중에 기판의 온도를 조절하여 MALDI 질량 분석기에서 이온 이질성 신호 공간을 감소시키는 프로토콜이 설명된다.

초록

이 프로토콜은 MALDI(matrix-assisted laser desorption/ionization) 질량 분석 중 이온 신호의 공간적 이질성을 줄이기 위한 간단한 샘플 준비를 보여줍니다. 이온 신호의 이질성은 MALDI에서 심각한 문제이며, 이로 인해 데이터 재현성이 떨어지고 MALDI가 정량 분석에 적합하지 않습니다. 시료 준비 중에 시료 플레이트 온도를 조절함으로써 시료 용액 방울 내부의 열 유도 유체역학적 흐름은 이질성 문제를 줄일 수 있습니다. MALDI 시료 플레이트를 고정하는 온도 조절 구리 베이스 블록이 장착된 실온 시료 전처리 챔버는 시료 건조 조건의 정밀한 제어를 용이하게 합니다. 시료 방울을 건조시킨 후 시료 플레이트의 온도를 실온으로 되돌리고 후속 질량 분석 분석을 위해 챔버에서 제거합니다. 샘플의 영역은 MALDI 이미징 질량 분석법으로 검사하여 샘플의 모든 구성 요소의 공간 분포를 얻습니다. 온도 제어 없이 주변 조건에서 샘플을 준비하는 기존의 건조 액적 방법과 비교하여, 본 명세서에서 입증된 방법으로 준비된 샘플은 상당히 우수한 공간 분포 및 신호 강도를 보여줍니다. 탄수화물 및 펩타이드 샘플을 사용한 관찰에 따르면, 건조 공정 중에 주변 온도를 주변 온도로 유지하면서 기질 온도를 낮추면 이온 신호의 이질성을 효과적으로 줄일 수 있습니다. 이 방법은 일반적으로 샘플과 매트릭스의 다양한 조합에 적용할 수 있습니다.

서론

질량 분석법(MS)은 복잡한 샘플의 분자 조성을 분석하기 위한 가장 중요한 분석 기술 중 하나입니다. MS에 사용되는 모든 이온화 방법 중에서 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화(MALDI)는 바이오분석 응용 분야에서 가장 민감하고 널리 사용되는 방법입니다. 1 다른 이온화 기술과 비교하여, MALDI에는 소금 오염물질에 가장 높은 감도 그리고 고단능력이 있습니다. 이러한 분석 특성으로 인해 MALDI는 탄수화물 분석 및 많은 단백질체학 응용 분야에서 첫 번째 선택이 됩니다. 그러나 시료 전처리는 MALDI-MS에서 고품질 데이터를 얻기 위한 중요한 단계입니다.

MALDI-MS에 가장 일반적으로 사용되는 시료 전처리 방법은 건조 액적 방법으로, 시료 액적을 표면에 증착하고 주변 조건에서 건조합니다. 이 건조 방법은 간단하고 일반적으로 효과적입니다. 2-5 그러나 건조 액적 방법의 일반적인 문제는 결과 분석물/매트릭스 결정이 일반적으로 불규칙하게 분포한다는 것입니다. 많은 경우, 결정은 샘플 영역의 주변부에서 응집되어 소위 고리 염색 형성을 초래합니다. 6-8 이질적인 결정 형태는 분석물 분자의 공간적 분포에 영향을 미치며, 이는 샘플 영역에 대한 이온 신호의 심각한 변동을 초래합니다. 이러한 심각한 신호 변동과 낮은 데이터 재현성을 MALDI-MS의 "스위트 스폿" 문제라고 합니다. 9 따라서 MALDI-MS 건조 액적 응용 분야에서 공간적 이질성을 줄여야 할 필요성이 큽니다.

샘플 액적의 유체역학적 흐름은 건조 액적 방법으로 준비된 샘플의 공간 분포를 결정하는 데 중요한 역할을 합니다. 10-12 용매의 증발은 고리 염색 형성의 원인이 되는 액적 내에서 외부로의 모세관 흐름을 유도하는 것으로 밝혀졌습니다. 7,10 대조적으로, 접선 표면 장력 구배에 의해 유도된 재순환 흐름은 바깥쪽 모세관 흐름을 상쇄할 수 있습니다. 13 재순환 유속이 외향 모세관 유속보다 빠르면 샘플을 효율적으로 재분배하여 이질성 문제를 줄일 수 있습니다. 14

분

이 작업에서는 액적 건조 공정 중에 효율적인 재순환 흐름을 유도하기 위해 간단한 건조 챔버로 샘플을 준비하기 위한 자세한 프로토콜을 보여줍니다. 액적 건조 조건은 샘플 플레이트와 그 주변의 온도, 챔버 내부의 상대 습도를 포함하여 정밀하게 제어됩니다. 모델 분석물에는 말토트리오스(maltotriose)와 브래디키닌 사슬(bradykinin chain)이 포함됩니다(1-7). 시연에 사용된 매트릭스는 2,4,6-트리하이드록시아세토페논(THAP)입니다. TOF(Time-of-Flight) MS로 샘플을 검사하고 데이터를 정량적으로 분석하여 이질성의 감소를 보여줍니다.

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프로토콜

참고 :이 프로토콜은 건조-방울 방법으로 제조 된 말 토트 리오스와 브라 디 키닌 단편 (1-7)의 공간적 이질성을 줄이기 위해 개발되고있다. 프로토콜은 준비 및 전처리 샘플 증착 및 건조하고, 질량 분석 데이터 분석을 포함하여 세 개의 주요 단계로 구성된다. 절차를 요약하고 아래에보다 상세히 설명된다 :

1. 준비 및 전처리

  1. 샘플 플레이트 청소
    1. 니트릴 장갑을 착용하고 세제와 증류수 - 탈 이온수 (DDW)으로 가볍게 샘플 판을 손 씻는다.
    2. 메탄올 (메탄올)과 DDW와 샘플 판을 씻어.
    3. 600 ml의 비이커에 샘플 플레이트를 삽입하고 DDW로 입력합니다.
    4. 초음파 조 (200 W, 40 KHZ)에서 15 분 동안 DDW의 샘플 플레이트를 초음파 처리.
    5. 비커에서 DDW를 제거하고 메탄올로 비커를 입력합니다.
    6. 초음파 욕 (200 W, 40 KHZ)에서 15 분 동안 메탄올에있는 샘플 플레이트 초음파 처리.
    7. 질소 가스와 함께 접시에 용매 방울을 불어 샘플 증착하기 전에 건조 샘플 플레이트를 유지합니다.
  2. 규제 건조 챔버 온도
    참고 :. 건조 챔버는 35 X 20 X 45cm 3 (가로 x 세로 x 높이) 아크릴 챔버 그림 1은 이러한 건조 시스템의 그림을 보여줍니다. 챔버는 건조실 내부에 설치된 보정 습도계 의해 모니터링 낮은 습도 조건을 유지하기 위해 일정한 유량으로 가스 유량계를 통해 실내 온도를 질소 가스로 치환된다. 프로그래밍 항온 순환 장치를 구비 한 건조 챔버에서의 구리베이스 블록 스테인리스 샘플 판을 수용하기 위해 사용된다. 구리베이스 블록은 25 ° C에서 5 샘플 플레이트 온도를 조절 할 수있다. 공기, 구리베이스 블록 및 샘플 플레이트의 온도를 K 형 열전대에 의해 모니터링된다.
    1. 문을 열고 빠르게 구리에 샘플 판을 넣어베이스 블록은 문을 닫습니다.
    2. 수동 10 시간당 표준 입방 피트 (SCFH) 내지 질소 유량을 설정하는 가스 유량계를 조정한다.
    3. 상대 습도는 항상 25 % 이하로되도록하여, 습도계와 미세 조정 가스 유량계에 의해 건조 챔버 내의 상대 습도를 모니터링.
    4. K 형 열전대에 의해 샘플 플레이트의 온도를 모니터링하고 샘플 플레이트는 실험 또는 제어 상온 (25 ° C)에 대한 5 ° C에 도달 할 때까지 수동으로 물 순환 장치의 온도를 조정한다.
      주 : 설계된 온도에서 샘플 판을 안정화시키기 위해서, 물 순환 온도는 일반적으로 설계된 시료보다 낮은 5 ° C를 0으로 설정된다. 예를 들어, 샘플 플레이트에서 5 ° C를 유지하는 물 순환 장치의 설정 온도는 35 ° C 0의 범위이다; 25 ° C에서 샘플 플레이트를 유지하는 물 순환 장치의 설정 온도는 23-25 ​​℃의 범위이다.
    5. 필요한 온도 및 상대 습도가 샘플 증착 이전 (표 1)에 도달되도록.
      주의 : 다른 샘플 플레이트 온도가 건조 공정의 모든 매개 변수뿐만 아니라 설정 값을 표 1에 나타내었다.
      참고 : 챔버 문이 오랜 시간 동안 열려있는 경우 낮은 샘플 플레이트 온도에서 시료 접시에 물 응축이 발생할 수 있습니다. 물 결로가 발생하는 경우, 문을 닫고 물 응축 밖으로 건조 될 때까지 어떠한 샘플을 입금하지 마십시오.
  3. 매트릭스와 분석 대상 솔루션의 준비
    1. 기질 용액의 제조
      1. 50 % DDW 수용액 : 50 % 아세토 니트릴 (ACN)와 0.1 M THAP 솔루션을 준비합니다.
    2. 분석의 준비
      1. DDW 10 -4 M 말 토트 리오스 솔루션을 준비합니다.
      2. 50 % 아세토 니트릴에 10-5 M의 브라 디 키닌 단편을 제조 (1-7) 용액(ACN) : 50 % DDW 수용액.

2. 샘플 증착 및 건조

  1. 프리믹스 0.1 M의 THAP 용액 0.25 μL 및 10-4 M의 말 토트 리오스 또는 10-5 M의 브라 디 키닌 단편 (1-7) 미세 원심 튜브 용액 0.25 μL.
  2. 3 초 동안 혼합 용액을 소용돌이.
  3. 원심 관의 바닥에 상기 용액을 수집하기 위해 2 초 (2,000 XG)에 혼합액을 원심 분리기.
  4. 조심스럽게, 건조실의 문을 열고 피펫으로 시료 접시에 솔루션의 0.1 μl를 입금 즉시 문을 닫습니다.
  5. 샘플 물방울이 건조 할 때까지 기다립니다.
    .주의 : 다른 샘플 플레이트 온도가 전형적으로 관찰 건조 시간은 표 1에 나열된 5 ° C의 시료 판 온도, 평균 건조 시간은 800 초이다 1000; 25 ° C의 샘플 플레이트 온도의 평균 건조 시간은 100 내지 150 S이고EC.
  6. 건조 후에, 건조 챔버의 문을 연다.
  7. 실내 온도 (25 °에 C)에 물 순환 온도를 설정합니다.
    참고 : 샘플 플레이트는 건조 과정에서 실온 (25 ℃로)에서 지속적으로 유지되는 경우이 단계를 건너 뜁니다.
  8. 상온 (25 ° C) 내지 샘플 플레이트 온도 복귀 후, 건조 챔버에서 샘플 판을 제거한다.
  9. 5 배의 실체 현미경에서 샘플 형태를 검사하고 스냅 샷 밝은 필드 이미지를 촬영.
    주 : 액정 모폴로지 같이 예상되지 않는 경우에는 같은 방법으로 새로운 샘플을 준비 할 필요가있다. 일반적인 액정 모폴로지는도 2의 상부 패널에 나타낸다.
    참고 예 5 ° C 낮은 샘플 플레이트 온도와 경우에 따라서는 건조 챔버로부터 복용 ​​전 실온으로 샘플 플레이트를 예열하는 것이 중요하다. 샘플을 증착 할 때, 예 혼합 solutio을 유지하지 마십시오n은 10 초 이상 피펫의 끝에서입니다. 샘플을 증착 한 후 다시 예 혼합 용액을 사용하지 마십시오. 도 2의 상부 패널은 다양한 샘플 플레이트의 온도로 제조 된 샘플의 시야 화상을 나타낸다.

3. 질량 분석 데이터 분석

  1. 질량 분석 데이터 수집
    참고 제조 한 후, 샘플을 영상화 질량 분석법을 이용하여 분석 될 수있다. 현재 연구에서, 촬상 MS 실험은 실험실 내장 동기화 이중 극성 TOF를 이용하여 수행된다 (DP-TOF) 촬상 질량 분석계. 촬상 기능 15 상용 MALDI-TOF 질량 분석기는 또한 실험에 적합하다. 질량 분석기는 선형 추출 최적화 추출 지연을 갖는 양 이온 모드에서 동작된다. 이온의 운동 에너지는 20 kV로한다. 레이저 빔 크기는 시료 표면에 직경이 35㎛이며, 각 스폿의 스펙트럼은 AVE이고5 레이저 샷의 분노.
    1. MALDI 질량 분석기에 샘플 플레이트를 삽입합니다.
    2. 단계 2.1-2.9에서 조제한 시료 질량 분광 분석 이미징 수행한다.
    3. 결과 창에 표시된 질량 목록에서 특성 질량 피크를 선택하고 두 차원 이온 이미지를 플롯 "2D"을 클릭합니다.
      참고 : THAP 혼합 말 토트 리오스를 들어, 특성 피크는 말 토트 리오스, 양성자 THAP을 sodiated 및 THAP을 sodiated 있습니다. THAP 혼합 키닌 단편 (1-7)의 경우, 특징적인 피크는 브라 디 키닌 단편 (1-7), 양성자 THAP를 양성자와 THAP sodiated를 포함한다.
    4. 신호 강도의 상한 및 하한을 결정하는 팝업 창 조절 버튼을 클릭하고 "사진 저장 '을 클릭. 이 설정은 이온의 이미지의 콘트라스트를 정의한다.
      참고 : 데이터의 모든 개인 설정에서 금이 지역과 낮은 밝기를 나타내는 널 명소가 제거된다.
    5. 관찰하고 이온을 비교단계 2.9에서 찍은 밝은 필드 이미지와 이미지.
      주 : 질량 분석, 특히 이온의 이미지 구성을 이미징 상업적기구와 함께 달성 될 수있다. 때문에 데이터 수집 및 분석 소프트웨어의 다양한, 사용자는 높은 품질의 이미지를 얻기 위해 장비 공급 업체에서 제공하는 소프트웨어의 지시를 따라야합니다.
  2. 데이터 분석
    참고 : 샘플의 이질성이 정량적으로 분석된다. 이 데모에서는, 모든 샘플은 이온의 공간 분포를 분석하기 위해 자체 개발 한 소프트웨어에 의해 다수의 동심 영역으로 분할된다. 분석은 또한 독립형 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 수행 될 수있다.
    1. 중요하지 않은 부분을 제거하는 결과 창에 표시된 이온 이미지에서 널 명소와 금이 영역을 클릭합니다.
      주 :이 절차는 이온 이미지의 필수 영역을 정의합니다.
    2. 이온 이미지의 최 층을 찾기 위해 버튼 "가장자리를 찾아"을 클릭합니다.
    3. 데이터베이스에 최 층의 이온 풍부한 정보를 저장하고 동시에 이온 이미지에서이 층을 제거하기 위해 "공제"를 클릭합니다. 이 최 층을 나타내는 확인란 결과 윈도우의 "출력 데이터"목록에 표시됩니다.
    4. 이온 이미지의 중심이 정의 될 때까지 반복 3.2.2와 3.2.3 단계를 반복합니다.
    5. 클릭하고 "출력 데이터"목록에있는 모든 확인란을 선택하고 데이터를 내보낼 "내보내기"를 클릭합니다.
    6. 이온의 공간 분포 정보를 획득하기 위해 각 층의 평균 이온 풍부 계산 스프레드 시트 소프트웨어를 사용하여 보낸 데이터를 연다.

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결과

밝은 필드 화상과 시료 판 (5)의 온도가 25 ° C로 제조 토트 리오스 및 브라 디 키닌 단편 (1-7)의 MS 이미지는도 1에 도시되어있다. sodiated 말 토트 리오스, 이온 신호를 중심으로 채워의 경우 샘플 영역의 주변에이를 25 ° C의 샘플 플레이트의 온도로 제조되는 경우. 5 ° C에 샘플 플레이트의 온도를 감소시킴으로써, 신호는 균일하게 전체 샘플 면적에 걸쳐 채워. 5 ° C에서 샘플을 준비하는 유일한 눈에 띄는 단점은 25 ° C에서 제조 된 샘플보다 더 많은 균열이 발생하는 것입니다. 양성자 브래디 키닌 단편 (1-7)의 이온 화상 sodiated 토트 리오스의 것과 유사한 경향을 나타낸다. MS의 촬상 결과는 하위 샘플 플레이트의 온도에 따라 샘플을 제조하는 것이 훨씬 분자 재배포 이질성을 감소시킬 수 있다고 제시한다.

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토론

이전 이론적 예측에 기초하여, 방울 내에서의 온도 - 유도 된 유체 역학적 흐름이 외측으로 용매 증발에 의한 모세관 흐름을 극복 할 수있다. 온도가 증가 액적 내에 그라디언트 때 분자의 내부 재순환 등의 효율이 향상된다. 주위 온도에서 주변을 유지하면서 5 ℃ 하에서 샘플 플레이트의 온도를 유지하는 경우, 예측 결과에 따라, 상기 액적 내의 재순환 흐름의 평균 속도는 외측 모세관 흐름보다 약 4 배 더 빠르다. 샘플 플레이트 온도가 주위와 동일한 경우, 재순환 흐름의 평균 속도는 외측 모세관 유동보다 1800 배 느리다. 이 계산의 결과는 샘플 제조 동안 샘플 플레이트 온도를 낮추면 유리임을 나타낸다. 실험 관찰이 예측에 동의합니다.

샘플 플레이트 성질ature 정확하게 다른 샘플 플레이트 온도에서 시료의 0.1 μL로 샘플 준비 과정. 표 1을 통해 일반적인 방울 건조 시간을 보여줍니다 제어되어야한다. 접시에 시료 용액을 증착하기 전에, 샘플 ...

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공개 사항

저자는 경쟁적인 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 유전체학 연구 센터, Academia Sinica 및 대만 과학기술부(계약 번호 104-2119-M-001-014)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약
세제 분말Alconox242985
메탄올Merck106009
AcetonitrileMerck100003
2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP)Sigma-AldrichT64602 
Bradykinin fragment (1-7)Sigma-AldrichB1651
MaltotrioseSigma-Aldrich47884
피펫 팁Mettler Toledo17005091
Microcentrifuge tubeAxygenMCT-150-C
Equipment
Milli-Q water purification 시스템MilliporeZMQS6VFT1
파우더 프리 니트릴 장갑MicroflexSU-690
600 ml 비커Duran2110648
초음파 세척기DeltaDC300H
습도계Wisewind5330
질소 가스 유량계DwyerRMA-6-SSV
K-type 열전대Digitron311-1670
원심분리기Select BioProductsForce Mini 
피펫Raininpipet-lite XLS
실체현미경OlympusSZX16
온도 조절 가능 건조 챔버이 실험실
, 동기화된 이중 극성, 비행 시간 이미징 질량 분석기(DP-TOF, IMS)이 실험실
, MALDI-TOF, 스테인리스강 시료 대상이 실험실, 이 실험실

참고문헌

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