자원이 부족한 현재의 환경에서 연구자들이 더 저렴하고 빠르며 정확하게 연구를 수행할 수 있도록 하는 새로운 기술이 등장하고 있습니다. 여기에서는 여러 환경 병원체에 대한 인체 노출을 동시에 측정하기 위한 비드 기반 타액 항체 다중 면역분석법의 개발에 대해 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
병인 및 환경 병원체의 인체 노출의 영향에 따라서, 노출 및 감염을 사용하여 비용 효과적인, 높은 처리량 접근 방식을 평가하는 능력이 필수 불가결 한 것, 전세계 주요 관심사이고. 이 논문은 다수의 병원체를 동시에 인간 타액 항체의 존재를 측정 할 수있는 비드 기반 다중 면역 개발 및 해석을 설명한다. 그것은, 비 침습적 저렴하고 혈청보다 수집하기 쉽기 때문에 침이 응용 프로그램에서 특히 매력적이다. 환경 병원체로부터 항원 카르 미립자 (비드)에 커플 링 비드 기반 용액 상 분석을 이용하여 인간의 타액 샘플의 매우 작은 양의 항체를 측정하는데 사용 하였다. 구슬은 캄 필로 박터 jejuni와, 헬리코박터 파이로리, 톡소 포자충, noroviruses (G I.1과 G II.4)에서 항원과 A 형 간염 바이러스와 결합되었다. 항원이 충분히에 연결되었는지 확인하려면비드가 결합은 비 오티 닐화 항 - 종 차 검출 항체 및 스트렙 타비 딘 - 피코 에리 트린 R 기자 (SAPE)와 인큐베이션 한 후, 종 특이 동물 유래 기본 캡쳐 항체를 사용하여 확인 하였다. 그것은 임의의 항원에 결합되지 않은 것을 제외하고 비특이적 결합을 측정하기위한 대조군으로서, 하나의 비드 세트는 다른 동일하게 처리 하였다. 항원 - 결합 및 제어 비드는 유동 세포 계측법의 원리에 기초하여 높은 처리량 분석기상에서 측정 전진 수집 된 인간 타액 샘플과 함께 배양하고, 각 항원에 대한 항체의 존재는 중간 형광 세기 단위 (MFI)를 측정했다 . 다중화 면역 적은 샘플 이상의 데이터를 포함하는 장점들을 갖는다; 비용 절감과 노동; 과 능력은 관심이 많은 대상에 분석을 사용자 정의합니다. 결과 침 다중 면역 especia가 될 수있는 이전의 노출과 감염을 식별 할 수있는 것을 나타내는큰 인간 집단을 포함하는 감시 연구 에서야 베드로 유용합니다.
서론
설사 관련 질병의 88 %가 전 세계적으로 약 150 만 명이 사망 원인이 오염 된 물에 대한 인체 노출 안전하지 않은 음식, 그리고 가난한 위생 / 위생과 연관되어, 대부분의 어린이 1입니다. 이는 공중 보건 관리 및 정책 결정자에 대한 관심의 주요 원인이다. 수성 및 기타 환경과 관련된 병원체 노출과 질병을 조사하기 위해, 우리는 사람의 샘플 2-4에 대한 항체를 측정하는 다중 면역 분석을 개발 하였다. 이 방법은 이러한 병원체의 인체 노출을 결정하기 위해 더 나은 immunoprevalence 및 사고 감염을 정의하는 역학 연구에 적용 할 수 있습니다.
침은 인간의 바이오 마커 연구를위한 혈청의 대안으로 상당한 약속을 보유하고있다. 타액의 장점 중에서는 비 침입 및 샘플 수집, 저비용의 용이성, 그리고 샘플 아이 쉽게 5-7 <로부터 회수 할 수있다/ SUP>. 혈청 및 타액 샘플 H.에 대한 항체에 대해 광범위하게 연구되어왔다 파이로리 2,3,8, 말라리아 원충 (9), Entamoeba의 아메바 (10),와 포자충 포자충 3,....
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프로토콜
승인 (IRB # 08-1844, 노스 캐롤라이나, 채플 힐, 노스 캐롤라이나, 미국의 대학) 케론 비치, 푸에르토 리코,에서 beachgoers에서 자극 열구 타액 샘플의 수집에 대한 미국의 일환으로 임상 시험 심사위원회로부터 얻은 것 환경 보호청 (USEPA) 국립 역학 및 레크리에이션 (NEEAR) 물 연구 (23)의 환경 평가 수영 관련된 노출과 질병을 평가합니다. 연구 주제는 동의를 제공하고 훈련 USEPA 계약에 의해 타액 수집 장치의 사용에 지시했다. 타액 샘플을 수신하면, 그들이 원심 분리 4 바와 같이 -80 ° C에 저장된 얼음에 제공 하였다.
1. 구슬 활성화
- 텍싱 20 초 동안 초음파 처리 및 마이크로 원심 튜브에 주식 비드 (400 μL)의 전송 약 5.0 × 10 (6)에 의해 재현 탁 비드 세트 주식.
참고 : T를그는 12.5 × 106 비즈 / ml의 농도로 공급된다 구슬. - 2 분 동안 10,000 XG에서 원심 분리하여 주식 비드 펠렛.
- 20 초 동안 소용돌이와 초음파에 의해 증류수 (DH 2 O)를 뜨는을 제거하고 100 μL의 펠렛 비드를 ....
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결과
고유 한 비드 세트 다양성을 샘플링 비특이적 결합을 측정하기 위해 제어 및 시료로 하였다. 이러한 비드가 결합 단계에있는 항원과 함께 배양하지 않은 것을 제외하고는 항원 결합 비즈와 동일하게 처리 하였다. 상기 혈청에서 의심 오염으로 인해 분석하고, 나머지 응답은 분산 로그 된 모든 타액 샘플과 함께 배양 제어 비드에서 얻은 MFI 값> (500)는 제거되었다. 잇몸이 수집 장치 나 연구 참가자가 치주 질환이있는 경우 첨부 된 스폰지로 너무 적극적으로 문질러하는 경우 타액은 혈청으로 오염 될 수있다. 로그는 MFI 데이터 평균 플러스 로그 MFI 값의 3 표준 편차에 기초하여 505 MFI의 면역 양성 컷오프 포인트를 계산하기 위해 사용 된 변형. 또한, 항원 - 결합 구슬 DIL 제외한 모든 방식으로 테스트 우물로 처리 된 특정 웰에 첨가 하였다uted 타액은 배경 형광 및 교차 - 반응성을 평가하기 위해 PBS-1 % BSA로 대체 하였다. 이러한 배경 우물에.......
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토론
이러한 결과는 멀티 플렉스 면역 방법은 면역 양성 또는 immunonegative 있습니다 타액 샘플을 구별하는 데 유용 있음을 나타냅니다. 의 면역 반응을 결정하기 위해, 하나의 차단 점 평균 플러스 타액 샘플 모두에서 테스트 제어 비결 비드 로그 변환 MFI 응답의 세 개의 표준 편차를 계산하여 개발되었다. 컷 - 오프 포인트는 단일 또는 다수의 병원체에 노출 immunoprevalence을 평가하는 능력을 수득 하였다. 이 차별적 전력은 환경과 다른 병원균에 대한 노출과 관련된 건강 위험을 조사 인구 연구에 유용 할 수있다.
상기 MFI의 분포, 비 결합 제어 어떤 연구가 응답하도록 설계 문제에 따라 컷오프 포인트를 결정하는데 사용될 수있는 몇 가지 다른 방법이있다. 컷 - 오프를 결정하기위한 몇 가지 예는, 유한 혼합 모델링 24-26을 포함 뜻 플러스 3컨트롤에 대한 응답의 표준 편차는 컨트롤에 대한 응답의 2 표준 편차 및 컨트롤 27,.......
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공개 사항
연구 개발의 오피스를 통해 미국 환경 보호국 (EPA)이 자금을 지원하고 여기에 설명 된 연구 관리. 이 기관의 관리 검토를 실시하고 게시 승인되었습니다. 상품명 또는 상용 제품에 대한 언급은 사용 승인 또는 추천을 구성하지 않습니다.
감사의 글
Clarissa Curioso는 미국 에너지부와 미국 EPA 간의 기관 간 협정을 통해 Oak Ridge Institute for Science and Education이 관리하는 미국 환경 보호국의 연구 참여 프로그램에 임명되어 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
Antigens
비드 Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch를 assay 실행하는 업체 에 결합됨 제거하기 위해 세척 버퍼에 사용됩니다**
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Equipment and Software | |||
| microcentrifuge | Thermo Electron Corporation | 75002446 | 시료를 원심분리하는 데 사용 |
| Vortex Mixer | VWR | G560 | 시료 혼합에 사용 |
| Sonicator (mini) | Fisher Scientific | 15-337-22 | 분리하는 데 사용됩니다 |
| . | Capp | 다양한 | |
| 혈구계 (Bright Line) | Housser Scientific | 3200 | 결합 비드를 계수하는 데 사용 |
| 멀티스크린 진공 매니폴드 | Millipore | MSVMHTS00 | 상등액을 제거하기 위한 세척 단계에 사용 |
| MicroShaker | VWR | 12620-926 | 배양 중 비드를 교반하는 데 사용 |
| 튜브 랙(1.5ml 및 0.5ml)(모듬) | VWR | 30128-346 | |
| 계량 저울 | Mettler 또는 기타 | 완충액 제조를 위한 세척 시약을 측정하는 데 사용됨 | |
| Dynabead Sample Mixer | Invitrogen | 947-01 | 커플링 배양 단계에서 사용됨 |
| MatLab (R2014b) | The MathWorks, Inc. | 항체 반응 데이터를 분석하는 데 사용됨 | |
| Microsoft Excel 2014 | Microsoft Corporation | 항체 반응 데이터를 분석하는 데 사용됨 | |
| xPonent 3.1 소프트웨어를 사용한 | Luminex Analyzer Luminex Corporation | LX200-XPON3.1 | |
| GI.1 Norwalk 바이러스를 | 데 사용되는 기기 및 소프트웨어 Jiang (CCHMC)* | NA | *신시내티 아동 병원. 최종 conc. 5 µg. |
| GII.4 노로바이러스 VA387: p-입자 | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Cincinnati Childrens' Hospital. 최종 conc. 5 µg. |
| A형 간염 바이러스: 세포 배양에서 2등급 농축 | 액 Meridian Life Sciences | 8505 | 항원 100 &마이크로에서 결합; g |
| Helicobacter pylori: 용해물 | Meridian Life Sciences | R14101 | 25 µ에서 결합된 항원; g |
| Toxoplasma gondii: recombinant p30 (SAG1) | Meridian Life Sciences | R18426 | 25 µ에서 결합된 항원; g |
| Campylobacter jejuni: 열이 사멸된 전체 세포 | KPL | 50-92-93 | 50 µ에서 결합된 항원; g |
| Primary Antibodies | |||
| Guinea pig anti-Norovirus | (CCHMC)* | NA | 커플링 확인에 사용 |
| 마우스 anti-Hepatitis A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | 커플링 확인에 사용 |
| 마우스 anti-Hepatitis A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | 커플링 확인에 사용 |
| BacTraceAffinity Helicobacter pyloriKPL에 대한 정제 항체 | 01-93-94 | Goat | |
| pAb to Toxoplasma gondii | Abcam | Ab23507 | 결합 확인에 사용 |
| BacTrace Goat anti-Campylobacter 종 | KPL | 01-92-93 | 결합 확인 |
| 에 사용Secondary 항체 < / strong> | |||
| Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H + L) | Jackson | 705-065-149 | 커플 확인에 사용 |
| Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H + L) | KPL | 16-13-06 | 커플 확인에 사용 |
| Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H + L) | KPL | 16-18-06 | 커플 링 확인 |
| 에 사용Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | KPL | 176-1506 | 커플 링 확인에 사용 |
| Consumables | |||
| 1.5 ml 공중 합체 미세 원심 분리기 튜브 | USA Scientific | 1415-2500 | 저 결합 미세 원심 분리기 튜브 |
| 10 µ로 사용; l 피펫 팁 리필 | BioVentures | 5030050C | |
| 200 µ l 피펫 팁 리필 | BioVentures | 5030080C | |
| 1,000 µ l 피펫 팁 리필 | BioVentures | 5130140C | |
| 알루미늄 호일 | 다양한 공급 | 사용 배양 중 어둠 속에 구슬 보관 | |
| 딥 웰 플레이트 | VWR | 40002-009 | 타액 샘플 희석에 사용 |
| 멀티 스크린 필터 플레이트 | Millipore | MABVN1250 | 분석을 실행하는 데 사용 |
| Oracol 타액 수집 시스템 | Malvern Medical Developments Limited | 타액 채취에 사용 | |
| <강>시약 | |||
| 카르복실화 미세구(비드) | Luminex Corporation | 비드 세트에 의존 | 항원은 미세구체 |
| EDC(1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필] 카르보디이미드 염산염) | Pierce | 77149 또는 22980 | 비드 활성화 |
| 에 사용Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosoxynimide) | Pierce | 24510 | 비드 활성화에 사용 |
| Steptavidin-R-phycoerythrin (1 mg/ml) | Molecular Probes | S-866 | 리포터로 사용 |
| MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma | M-2933 | |
| Tween-20(Polyoxyethylenesorbitan monolaurate) | Sigma | 결합에 사용P-9416 | 비특이적 결합 |
| Protein Buffers | |||
| PBS-TBN 차단/ 저장 버퍼 (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)를 | 필터는 4°C에서 멸균하고 보관합니다. C | ||
| PBS, pH 7.4 | 시그마 | P-3813 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl |
| BSA | 시그마 | A-7888 | 0.1% (w/v) |
| 트윈-20 | 시그마 | P-9416 | 0.2% (v/v) |
| 아지드화나트륨 (0.05% 아지드)** | 시그마 | S-8032 | **<강>주의: 아지드화나트륨은 급성 독성이 있습니다. 피부와 눈과의 접촉을 피하십시오. 적절한 PPE를 착용하십시오. 관련 법률에 따라 폐기하십시오. |
| MES/커플링 버퍼(0.05m MES, pH 5.0) | |||
| MES(2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma | S-3139 | |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| 분석 버퍼(PBS, 1% BSA, pH 7.4) | Filter 4°C에서 살균 및 보관; C | ||
| PBS, 1% BSA, pH 7.4 | 시그마 | P-3688 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA |
| Activation 버퍼 (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) < / 강력 > | 필터 : 살균 및 4도에서 보관하십시오. C | ||
| NaH < 이하 > 2 < / sub> PO < > 4 < / sub > (인산 나트륨, 일 염기 무수) | 시그마 | S-3139 | 0.1 M NaH < 2 >< / > < > 4< / > |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| < 강력 > 세척 버퍼 (PBS, 0.05 % Tween-20, pH 7.4) < / 강력 > | 필터 4 °C에서 살균 및 보관; C | ||
| PBS, 0.05% 트윈-20, pH 7.4 | 시그마 | P-3563 | 138mM NaCl, 2.7mM KCl, 0.05% 트윈 |
참고문헌
- Prüss-Üstün, A., Gore, F., Bartram, J. Safer water, better health: costs, benefits and sustainability of interventions to protect and promote health. , World Health Organization. Geneva. (2008).
- Augustine, S., et al.
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재인쇄 및 허가
