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방법 논문

항원 중심의 성 대장염 모델의 개발은 항원이 T 세포에 세포를 제시하여 항원의 프리젠 테이션을 공부하기

8.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54421

⸱

2016년 9월 18일

 ,  ,  , 
1APC Microbiome Institute, University College Cork, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University Hospital Basel, 3Institute of Microbiology and Biotechnology, University of Ulm

이 논문에서

요약

이 항원 주도 대장염 모델에서는 적색 형광 단백질을 발현하는 OT-II CD4+ T 세포를 단핵 식세포(MP)에서 녹색 형광 단백질을 발현하는 RAG-/- 마우스로 채택하여 전달했습니다. 숙주는 청록색 형광 단백질(CFP)에 융합된 오브알부민 단백질(OVA)을 발현하는 대장균(E.coli)에 도전했습니다.

초록

염증성 장 질환(IBD)은 위장관(GIT)에 영향을 미치는 만성 염증입니다. 질병 중에 관여하는 면역학적 메커니즘을 연구하는 가장 좋은 방법 중 하나는 대장염의 T 세포 전달 모델입니다. 이 모델에서는 면역결핍 마우스(RAG-/- 수용자)를 건강한 야생형 숙주에서 유래한 미성숙한 CD4+ T 세포로 재구성합니다.

이 모델을 사용하면 장 염증이 지속되지만 정의된 항원에 의존하지 않는 질병 및 만성 염증으로 이어지는 가장 초기의 면역학적 사건을 검사할 수 있습니다. 질병 진행에서 항원제시세포(APC)의 잠재적인 역할을 연구하기 위해서는 정의된 공생 유래 항원이 대장염을 유발하는 항원 주도 질병 모델을 갖는 것이 도움이 됩니다. 따라서 항원 주도 대장염 모델이 개발되었습니다. 이 모델에서 OVA 단백질의 특정 항원결정기만 인식할 수 있는 OT-II CD4+ T 세포는 CFP-OVA 발현 E. coli에 도전하는 RAG-/- 숙주로 전달됩니다. 이 모델을 통해 lamina propria에서 APC와 T 세포 간의 상호 작용을 검사할 수 있습니다.

서론

대장은 외부 환경에 노출되어 상기 몸체의 큰 표면이다. 상주 균의 광대 한 배열 장내 미생물 (또는 미생물)를 형성하는 인간의 장내 정착. 이는 최대 100 조 미생물 세포로 구성되어 것으로 추정 생물학 1-3에 알려진 가장 인구 밀도가 세균의 서식지 중 하나 구성된다. 망할 놈의 박테리아는 생존과 4를 곱 장내 틈새 시장을 식민지화. 반환에서, 미생물은 유전자 1 인코딩되지 않은 추가 기능 기능 호스트를 부여한다. 예를 들어, 미생물은 상피 세포의 증식을 자극 스스로 호스트가 생성 할 수없는 비타민을 생산하고, 신진 대사를 조절하고 병원균 4-6을 방지합니다. 이 유익한 관계를 감안할 때, 몇몇 저자는 인간이 박테리아와 인간의 유전자 7,8의 혼합이다 "슈퍼 유기체"또는 "holobionts"것을 제안했다. 제 (인간) 호스트에있는 미생물의 수익에 미치는 영향을 감안할 때, 장내 면역 시스템은 루멘에서 자신의 존재를 가능하게뿐만 아니라 내강 측 9-11에서 침입 병원균을 죽일 공생 미생물을 허용 할 필요가있다. 장내 면역 시스템은 무해하고 잠재적으로 유해한 내강 미생물을 구별하는 메커니즘을 개발했다; 그러나 이러한 메커니즘은 아직 잘 (12)을 이해하지 않습니다. 장 무결성을 유지하는 것은 관용과 면역 (13) 사이의 균형을 유지하기 위해 엄격하게 규제 면역 항상성을 필요로한다. 면역 항상성의 불균형은 염증성 장 질환 (IBD) 3,14로 장 질환의 유도에 기여한다.

크론 병 (CD)과 궤양 성 대장염 (UC) : 두 가지 주요 IBD의 유형이있다. 이러한 질병을 가진 환자는 일반적으로 직장 출혈, 심한 설사와 복통 15, 16 겪는다. IBD의 하나의 원인은 아직유전 적 요인, 환경 적 영향 및 조절 이상 면역 반응의 알 수없는,하지만 조합이 질병 개발 (15)의 키 이벤트가 될 수 있습니다.

IBD에 대한 동물 모델은 50 년 이상 사용되어왔다. 지난 수십 년에 새로운 IBD 모델 시스템은 IBD (17, 18)의 발병 기전에 관련된 여러 가지 가설을 테스트하기 위해 개발되었다. 만성 대장염의 가장 특징으로하는 모델은 T 세포의 항상성 (19, 20)의 붕괴를 유도 T 세포 전달 모델이다. 16,21이 모델은 T 및 - (- / SCID 마우스와 같은 RAG 같은) B 세포가 부족 호스트로 면역 된 마우스에서 나이브 T 세포 전사 포함한다. 이 모델에서 질병의 발달은 체중 설사 존재 감소 신체 활동과 손실을 평가 3-10 주 동안 모니터링된다. 이 때문에 낭비 증후군 (16)이라고합니다. 건강한 쥐에 비해 이식 호스트의 대장 조직 thicke입니다R, 짧고 (16) 무거운. T 개의 셀의 전송 모델을 사용하면, T 세포 개체군은 22 IBD의 병인에 기여할 수있는 다른 방법을 이해할 수있다. T 개의 셀 전송 모델은 항원 특이 적 방식으로 질병 과정에 장갑차 및 T 세포 사이의 상호 작용을 분석하지 않는다. 또한 골수 세포 및 림프구 세포 간의 상호 작용은 염증 창자 (23)의 개발을 담당 할 수 있음을 보여왔다. IBD의 많은 부분이 밝혀져 있지만, 질환의 개발로 이어질 초기 사건은 여전히​​ 명확하게 이해되어야한다.

이는 미생물 전송 대장염이없는 것을 도시하고있다 (24)를 확립 할 수 없다. 최근 몇 이론 IBD는 공생 세균 (25)에 대한 면역 반응의 결과 일 수 있음을 시사한다. 저자는 공생 박테리아 말단 부위에 염증을 유발하는 데 필수적인 것이 제안26. 세균 무연 (GF) 동물 장 면역 체계는 일반적으로 (27, 28)을 손상되지만 완전 권한 장 면역계 (29)의 발전에 관련되는 무균 박테리아 결과의 혼합물이 마우스의 집락. 따라서, 미생물은에 걸리기 또는 장내 염증 30, 31의 개발에 대해 보호하는 메커니즘으로 하나, IBD의 발병 기전에 중요한 요소가 될 것으로 보인다. 현재의 이론에서는 유전 적 소인이 IBD 환자 32, dysbiosis 불리는 미생물 불균형의 결과임을 암시하지만, 분명하지 아직 dysbiosis가 원인 또는 병 (12)의 결과 인 경우. IBD의 개발 미생물의 역할을 고려하여, 시험 관내 실험에서 CD4 + T 세포는 장내 세균 (33, 34)와 펄스 장갑차에 의해 활성화 될 수 있음을 보여 주었다.

또한, 항원은 그 도시 된같은 E. 등 다양한 공생 박테리아 종, 대장균, 박 테로이드, Eubacterium 및 테우스는 CD4 + T 세포 (35)를 활성화 할 수 있습니다. 이 세포를 T로 세균의 항원 제시는 IBD의 개발에 대한 중요성을 나타냅니다. 질병 과정에서 미생물에 의해 도출 된 여러 항원의 복잡성을 줄이기 위하여, 대장균 균주은 OVA 항원을 생성하는 생성되었다. - / - 전송 대장염은 RAG에 OVA 특이 적 T 세포를 주입하여 유도 하였다 OVA 동물 발현 E. 집락 대장균.

이 모델은 3 CR1 CX + 의원, 대장 점막 고유 층 (CLP) (36)의 주요 세포 서브 세트가 전송 중에 CD4 + T 세포와 상호 작용하는 것을 암시하는 최근 증거에 기초 37 대장염. 의원은 돌기 (36), (38, 39)를 이용하여 박테리아 등의 미립자 항원 창자 내강, 샘플링. 이전의 연구의원도 40, 41 루멘 장 도입 등의 OVA와 같은 수용성 항원을, 걸릴 수 있음을 보여 주었다. CLP를에 CX (3) CR1 + 의원의 풍요 로움을 감안할 때, 이러한 세포 내강 박테리아를 샘플링하고 CD4 T 세포와 상호 작용할 수있는 가능성이있다. E. 집락 OVA 특이 적 CD4 + T 세포를 이식 한 생쥐의 공 초점 화상 대장균 CFP-OVA는, CX (3) CR1 + 의원은 항원 중심 대장염의 개발 과정 OT-II CD4 + T 세포와 접촉하는 것을 보여준다. 이 모델은 장내 장갑차 만 장내 루멘에 특정 항원을 발현하는 박테리아에 특이적인 T 세포의 항원 제시 공정을 연구 할 수있다.

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프로토콜

마우스는 사육과 울름 대학 (울름, 독일)의 동물 시설에서 특정 병원균이없는 (SPF) 조건에서 보관 하였다. 모든 동물 실험은 지역 동물 사용 및 관리위원회와 국립 동물 복지법의 지침에 따라 수행 하였다.

pCFP - OVA 플라스미드 1. 건설

  1. 플라스미드 PCI-OVA (저항 암피실린) 템플릿으로 42을 사용하여 프라이머 Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 ') 및 Ova_ClaI_rev (3'- GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5') (37)를 사용하여 풀 사이즈 OVA 유전자를 증폭. 특정 OVA 플라스미드를 생성하기 위해 프라이머 및 벡터를 SpeI와 라이터 시험 제한 부위를 사용하여 시판의 파지 미드 벡터 내로 (난자 코딩 서열 IE) PCR 산물을 복제.
  2. 플라스미드 패드 1을 사용하여 강한 구성 적 프로모터 P 하이퍼과 함께 CFP 코딩하는 유전자를 증폭 -cCFP 템플릿 및 프라이머 CFP_SacII_fw (3'-GATCGACCGCGGTTCTTGAAGACGAAAGGGCC-5 ')로 (저항 클로람페니콜) 43 CFP_SpeI_rev (3'-GATCGAACTAGTACCACCACCACCACCACCTTTGTAGAGTTCATCCATGC-5') 37.
  3. 프라이머 및 벡터 (37)의를 SpeI 및 SacI로 제한 부위를 사용하여 특정 OVA-플라스미드 (암피실린 내성)에 CFP 코딩 유전자를 복제. 이 OVA - 코딩 서열에서 CFP 코딩 사이 6 글리신 잔기의 스페이서를 소개합니다.

대장균 pCFP - OVA 2. 건설

  1. 하룻밤 동안 회전 진탕 기에서 37 ℃에서 호기 루리아 베르 타니 (LB) 배지 100 ㎖에 콜라이 균주 DH10B 성장.
  2. -80 ° C에서 글리세롤 주식과 상점을 작성하는 글리세롤의 200 μL와 세균 배양 800 μl를 섞는다.
  3. LB 배지 5ml에 글리세롤 스톡으로부터 대장균 균주 DH10B의 50 μl를 넣고 회전 진탕 비켜 37 ℃에서 호 기적으로 그들을 성장rnight.
  4. 회전 진탕하에 37 ℃에서 LB 배지 250㎖를 가진 당황 1 L 삼각 플라스크에서 배양 전송.
  5. 600 nm에서 광학 밀도 박테리아 성장 (OD 600) 0.5의 다음 30 분 동안 얼음에 문화를 진정. 4 ℃에서 10 분 동안 5,000 XG에서 박테리아를 원심 분리기.
  6. 빙냉 10 % 글리세롤 및 원심 균 100㎖로 4 ℃에서 재현 탁 박테리아에서 10 분 동안 5,000 XG에 빙냉 멸균 H 2 O 원심 균 100㎖로 재현 탁 박테리아를 10 분 동안 5,000 XG에 4 ° C에서. 두 번이 마지막 단계를 반복합니다.
  7. 최종 세척 단계 후, 10 % 글리세롤 700 μL 세균을 재현 탁. -80 ° C에서 액체 질소와 저장소에 50 μL 씩 동결.
  8. 미리 냉장 전기 큐벳 (2mm 전극 거리)에 얼음과 전송에 50 μL 나누어지는을 녹여.
  9. 50 μl의 E.에 플라스미드 DNA (100 NG)의 5 μl를 추가 대장균 aliquoTS. 25 μF, 200 옴 (Ω) 2.5 kV의에 하나의 펄스로 전기를 수행합니다.
  10. 1 ㎖의 사전 가온 SOC 배지 (5g / L의 효모 추출물, 2g / L의 트립 톤, 10 mM 염화나트륨, 2.5 mM의 염화칼륨, 10 mM 염화 마그네슘, 10 mM의 마그네슘 설페이트)에 재현 탁 박테리아 및 37 ° C에서 부화 기적 1 시간 동안.
  11. LB 한천 플레이트에 플레이트 박테리아는 앰피 실린 100 ㎍ / ㎖ (LB 한천의 100 ㎖에 100 ㎎ / ㎖ 암피실린 주식 100 μl를 추가) 하룻밤 호기 37 ° C에서 부화로 보충.
  12. 암피실린 100 μg의 / ㎖로 보충 LB 한천 플레이트에서 하나의 식민지가 다시 행진을 선택합니다. 하룻밤 호기 37 ° C에서 품어.
  13. 단일 콜로니를 선택하고, 플라스미드 아이솔레이션 용 앰피 실린 100 ㎍ / ㎖로 보충 된 LB 배지 10ml에 밤새 그들을 성장. 시중에서 판매하는 플라스미드 미니 준비 키트를 사용하여 30 μl의 DH 2 O (증류수) 제조 업체에 따라 '로 플라스미드 DNA를 용출;의 프로토콜입니다. 제한 분석 및 DNA 시퀀싱 37,42,43하여 플라스미드를 확인합니다.
  14. E.의 긍정적 인 클론의 문화를 설정 LB 배지 100 mL에 대장균 pCFP-OVA는 암피실린 100 μg의 / ㎖로 보충. 회전 진탕 하룻밤에 37 ° C에서 기적 성장.
  15. -80 ° C에서 순수 글리세롤 및 저장의 200 μL와 세균 배양 800 μl를 섞는다.
  16. 실온 (RT)에서 10 분 동안 5,000 XG에서 밤새 배양 나머지 원심 분리하고 인산염 완충 식염수 (PBS)에 펠렛을 재현 탁. 유리 슬라이드에 현탁액의 10 μl를 배치하고, 커버 슬립으로 커버.
  17. CFP-OVA의 발현 형광 (450 nm에서 CFP 여기, 480 nm에서 방출)를 확인하기 위해 표준 형광 현미경으로 샘플을 관찰한다. 배율 400X로 시작하는 박테리아를 분석합니다.
  18. 원심 분리기 10 분, RT 5,000 XG에 하룻밤 문화 박테리아 1 ㎖. 40 μL에 펠렛을 재현 탁PBS 10 분 동안 95 ° C에서 끓인다.
  19. 10 분 동안 30,000 XG에서 샘플을 원심 분리기 및 웨스턴 블롯 분석 (37)의 상층 액을 사용합니다. 400 : 1로 희석 토끼-발생 방지 OVA 폴리 클로 날 항체를 사용합니다.

OT-II의 3 세대 / 레드 마우스

  1. 구약-II / 레드 마우스 (37)을 생성하기 위해 적색 형광 단백질을 발현 여성 / 남성 마우스로 남성 / 여성 OT-II 마우스 (두 균주 시중에서 판매)을 교차.

4. 비장 세포 분리

  1. 어떤 할로겐화 에테르의 흡입 마취 후 자궁 전위에 의해 OT-II / 레드 쥐를 안락사 상업적으로 이용 가능한 (최대 유도 5 %).
  2. 마우스의 왼쪽 우수한 복부 부분을 잘라 가위를 사용합니다. 이 복부 부분에서 비장 (어두운 붉은 색 타원형 모양)이있다. 그것을 제거하기 위해 가위와 핀셋을 사용합니다.
    1. 구약-II / 레드 마우스의 비장의 압축을 해제하고 (100)를 통해 통과μm의 셀 스트레이너는 단일 세포 현탁액을 수득하기 위해 1 mL의 주사기의 플런저를 사용하여 50 ㎖ 튜브에 위치. PBS 중 2 회 10 ㎖의 1 % 열 불 활성화 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 여과기를 세척한다.
  3. RT에서 5 분 동안 390 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기. 적혈구를 용해시키기 위해 예열 용해 완충액 (144 mM의 NH 4 CL, 17 mM 트리스, pH는 7.2) 5 ㎖로 펠렛을 재현 탁. 37 ° C에서 10 분을 품어.
  4. PBS 25 ㎖의 1 % FBS로 보충하여 시료를 세척 하였다. RT에서 5 분 동안 390 XG에 원심 분리기. PBS 10 ㎖의 1 % FBS로 보충 된 상기 펠렛을 재현 탁.
  5. 노이 바 우어 계산 챔버를 사용하여 세포를 계산합니다. 0.4 % 트립 판 블루 용액 10 μL와 세포 현탁액 10 μL를 혼합한다. 1-2 분 동안 품어.
    1. 염색 된 세포의 10 μL와 혈구 챔버를 입력합니다. 사 1 × 1mm 하나의 챔버와 determin의 2 제곱을 현미경으로 세포를 계산평방 당 세포의 평균 수를 전자. 실행 가능한 세포는 흰색, 죽은 세포 파란색 표시가 나타납니다. 세포의 수를 결정 / 희석 인자에 의해 세포 수를 ml로 곱한다. 2 ~ 4 사분면이 계산되는 경우, 사분면의 숫자로 나눕니다.

5. CD4 + CD62 L + T 세포 농축

  1. 제외 또는 선택의 원리를 이용하여 자기 분리 키트를 통한 CD4 + CD62L + T 세포, 비장 세포를 풍부. 여기서, CD4 + T 세포를 분리하고, 상기 CD4 + T 세포의 풀 내의 CD62L + 인구 풍부 양성 선별을 사용하여 음성 선별을 사용한다.
    주 : 음의 선택 과정에서 고립되지는 않습니다 세포, (여기에 모든 CD4 음성 세포가) 자기 마이크로 비드과 함께 특정 항체로 표시되어 있습니다. 컬럼 세척 단계에서 그들이 EASI 수 있도록 CD4 + T 세포가 컬럼을 통해 통과 할 것이다LY 수집. 긍정적 인 선택 절차 세포에 자성 마이크로 비드과 함께 적절한 항체로 표시되어 격리된다. 열 세척 단계 동안 표지 세포는 열에있을 것입니다 그리고 그들은 자기 분야에서 열을 제거하고 버퍼로 세척하여 수집 할 수 있습니다.
  2. 음 선택 절차를 들어, 0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA)이 보충 된 차가운 PBS에 40 ㎕의 10 7 전체 비장 세포를 재현 탁. (비 CD4 + T 세포를 특이 적으로 결합하는 항체) (10) 자기 분리 키트와 함께 제공 비오틴 표지 된 항체 칵테일의 μl를 추가하고 얼음에 15 분을 품어.
    1. 차가운 PBS 30 ㎕를 0.5 %의 BSA 및 안티 비오틴 마이크로 비드의 20 μL를 추가로 보충. 얼음에 20 분을 품어.
    2. PBS 10 ml를 5 분 동안 390 XG에 0.5 % BSA와 원심 보충 샘플 추가. 두 번이 단계를 반복합니다. 0.5 % BS 보충 차가운 PBS 1 ml의 세포를 재현 탁에이.
    3. 자기장의 음성 선별 과정의 특정 열을 배치하고 차가운 PBS 3 ㎖로 세정 칼럼에 0.5 % BSA로 보충. 차가운 PBS 3 ㎖로 3 차례 칼럼에 세포 현탁액을 추가 세척은 0.5 % BSA로 보충.
    4. 5 분 390 XG에 유출의 원심 분리기 세포. 컬럼을 통해 유출 통과는 레이블이없는 CD4 + T 세포가 포함되어 있습니다. 0.5 % BSA로 보충 된 1 ml의 PBS에 펠렛을 재현 탁하고, 세포를 계산.
    5. 노이 바 우어 계산 챔버를 사용하여 세포를 계산합니다. 0.4 % 트립 판 블루 용액 10 μL와 세포 현탁액 10 μL를 혼합한다. 1-2 분 동안 품어.
      1. 염색 된 세포의 10 μL와 혈구 챔버를 입력합니다. 사 1 × 1mm 하나의 챔버의 2 제곱을 현미경으로 세포를 세어 평방 당 세포의 평균 수를 결정합니다. 실행 가능한 세포는 흰색, 죽은 세포 파란색 표시가 나타납니다. 세포 / ㎖ CEL 곱셈의 수를 결정희석 요인에 의해 리터 번호. 2 ~ 4 사분면이 계산되는 경우, 사분면의 숫자로 나눕니다.
  3. 긍정적 인 선택 절차는 107 미리 풍부한 CD4 + T 세포 분획 당 CD62L 마이크로 비즈의 10 μl를 추가합니다. 얼음에 15 분을 품어.
    1. PBS 10 ml를 5 분 동안 390 XG에 0.5 % BSA와 원심 보충 샘플 추가. 두 번이 단계를 반복합니다. 차가운 PBS 500 μL에 재현 탁은 0.5 % BSA로 보충.
    2. 자기장에 부정적인 선택 과정에 대한 구체적인 럼 놓고 칼럼에 0.5 % BSA로 보충 된 차가운 PBS 500 μL로 헹군다. 차가운 PBS 500 ㎕를 3 회 칼럼에 세포 현탁액을 추가 세척은 0.5 % BSA로 보충.
    3. 자기장에서 열을 제거하고 적절한 포집 관에 놓습니다. 컬럼에 0.5 % BSA와 보충 PBS 1 ㎖를 추가하고 CD4 + CD62L + T 세포를 세척단단히 열에 플런저를 밀어 열에 s의 유지.
      참고 : 격리 된 CD4 + CD62L + T 세포는 이제 생체 실험 등 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 준비가되어 있습니다. CD4 + CD62L + T 세포 분리 키트 제조업체의 지시에 따라, 마이크로 비드 독성 아니다. 작은 크기 (약 50 ㎚)으로 인해, 그들은 세포를 활성화하지 않는 그들은 세포 표면 항원 결정기를 포화되지 않습니다. 따라서, 분리 된 세포는 대장염 37,44,45을 유도하는 면역 결핍 쥐에 전달 될 ​​수있다.
    4. 노이 바 우어 계산 챔버를 사용하여 세포를 계산합니다. 0.4 % 트립 판 블루 용액 10 μL와 세포 현탁액 10 μL를 혼합한다. 1-2 분 동안 품어.
      1. 염색 된 세포의 10 μL와 혈구 챔버를 입력합니다. 사 1 × 1mm 하나의 챔버의 2 제곱을 현미경으로 세포를 세어 평방 당 세포의 평균 수를 결정합니다. 가능한 세포의 appea흰색, 죽은 세포 파란색 나타납니다 r에. 세포의 수를 결정 / 희석 인자에 의해 세포 수를 ml로 곱한다. 이 경우 - 4 사분면이 계산되고, 사분면의 숫자로 나눕니다.

항원 중심 대장염 6. 유도

  1. - / - 생쥐 CX 3 CR1 GFP / + X RAG에 복강 3 × 105 OT-II / 레드 CD4 + CD62L + T 세포를 주입한다. 항원 특이 대장염의 유도, E. 관리 대장균 pCFP-OVA 앞니 뒤에 위관 또는 구두 점안하여 동물 당 PBS 100 ㎕의 1 × 10 8 콜로니 형성 단위 (CFU)의 용량에 모든 둘째 날.
  2. 일주일에 두 번 몸에 이식 된 쥐의 체중과 임상 조건 (마우스의 대변, 대변 일관성과 활동에 혈액의 존재)를 모니터링합니다.

조직 병리학 적 검사 7. 조직 샘플

  1. 일에서 조직 샘플을 채취이전 36, 46 설명 된대로 마우스의 전자 대장은 파라핀에 중성 완충 포르말린 (10 %) 및 embed에 고정합니다.
  2. 제 마이크로톰에 파라핀 샘플은 슬라이드에 장착하고, H & E 염색 (47, 48)을 수행합니다.
  3. 이전에 (47, 48)이 공표 한 대장의 조직 학적 분류 : 일반 (0 점수); 가벼운 대장염 (1 득점), 중간 대장염 (2 득점)과 중증 대장염 (3 득점).

대장 얇은 판의 propria 세포의 8. 분리

  1. 시중에서 판매하는 자궁 경부 전위 어떤 할로겐화 에테르의 흡입 마취 후 (유도 최대 5 %)에 의해 이식 된 쥐를 안락사.
  2. 배면이 위를 향하도록하여 동물을 놓습니다. 요도 개구부에 전방으로 피부를 잡아 집게를 사용합니다. 가슴에 사타구니에서 복부 정중선을 따라 피부를 잘라 가위를 사용합니다. 측면에 피부를 뒤로 잡아 당깁니다.
  3. 투명 복막 근육 벽을 통해 잘라체강을 개방. 맹장 (49) 항문에서 진행 대장을 확인합니다. 2 사지를 절단하고 지방에서 조직을 확보.
  4. 길이 방향 해부 가위를 사용하여 대장을 엽니 다. PBS 25 ml에 포함 된 배양 접시에서 파편과 점액을 제거하기 위해 1 % FBS와 보충 결장 조직을 흔들 핀셋을 사용합니다. 8mm 조각 - 5로 결장을 잘라.
  5. 워시 완충액 20 ㎖를 함유하는 50 ㎖ 튜브에서 결장 세그먼트를 배치했다. 세척 버퍼 500 ML의 DPBS, 10 mM이 헤 페스 mm로 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)가 포함되어 있습니다.
  6. 최대 속도에서 30 초 동안 튜브를 소용돌이.
  7. 200 rpm으로 10 분간 진탕하면서 37 ℃에서 수욕에서 대장 세그먼트 튜브 부화.
  8. 배양 후, 최대 속도에서 30 초 동안 튜브를 소용돌이.
  9. 상청액을 폐기하고, 세척 완충액 20 ㎖를 함유하는 새로운 50 ㎖ 튜브에서 조직 샘플을 놓는다. 반복 6-9 세 번 단계
  10. 의 S 폐기upernatants와 PBS의 25 ml에 포함 된 배양 접시에서 조직 샘플을 배치합니다. 몇 초 잔여 상피 세포를 제거하는 페트리 접시에 부드럽게 조직 샘플을 흔들 핀셋을 사용합니다. 이 단계를 세 번 반복합니다.
  11. 2 × 2mm 2 조각으로 결장 조직을 잘라 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 클로스 트리 디움 histolyticum 0.5 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제 타입 VIII 및 DNaseI 10 ​​U / ㎖와 매체의 10ml에 배양을 소화.
  12. 최대 속도에서 30 초 동안 튜브를 소용돌이.
  13. 200 rpm으로 35 분간 진탕하면서 37 ℃에서 수욕에서 대장 단편 부화 최대 속도에서 30 초마다 5 분간 튜브 소용돌이.
  14. 배양의 마지막에, 최대 속도에서 30 초 동안 튜브를 소용돌이.
  15. 새로운 50 ML 튜브에 위치 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 전달하여 소화 조각을 수집합니다.
  16. 5 분간 400 g에서 20 DPBS ml의 원심 분리를 첨가하여 시료를 세척 하였다. 그런 다음에 resuspend tDPBS 1 ㎖에서 그는 세포.
  17. 노이 바 우어 계산 챔버를 사용하여 세포를 계산합니다. 0.4 % 트립 판 블루 용액 10 μL와 세포 현탁액 10 μL를 혼합한다. 1-2 분 동안 품어.
    1. 염색 된 세포의 10 μL와 혈구 챔버를 입력합니다. 사 1 × 1mm 하나의 챔버의 2 제곱을 현미경으로 세포를 세어 평방 당 세포의 평균 수를 결정합니다. 실행 가능한 세포는 흰색, 죽은 세포 파란색 표시가 나타납니다. 세포의 수를 결정 / 희석 인자에 의해 세포 수를 ml로 곱한다. 2 ~ 4 사분면이 계산되는 경우, 사분면의 숫자로 나눕니다.

FCM 분석 9. 세포 외 염색

  1. 원심 분리기 390 × g으로의 CLP 세포 5 분. FACS (A)의 1 ml의 세포를 재현 탁 (PBS에 1 % BSA 및 0.1 % 아 지드 화 나트륨으로 보충)
    주 : 아 지드 화 나트륨은 매우 독성이다. 그것은 저혈압, 냉증, 두통 발작이나 사망의 원인이 될 수 있습니다. (0, 아 지드 화 나트륨의 희석액0.1 % ~ 1.0) 일반적으로 사용자에게 특별한 위험을 제시하지만, 그들은 눈과 피부에 자극을하지 않습니다. 실험실 코트와 일회용 니트릴 장갑의 두 쌍을 입고있는 동안 따라서, 단지 화학 후드에서 아 지드 화 나트륨을 사용합니다.
  2. FACS A에 희석 FcγRIII / II CD16 / CD32에 대한 감독 단일 클론 항체 (단클론 항체) 2.4G2 (0.5 μg의 단클론 항체 / 10 6 세포)로 실온에서 15 분 동안 세포를 품어
  3. 390 X g에서 세포를 원심 분리기 5 분에 FACS (A)의 200 μl를 추가합니다. 두 번이 단계를 반복합니다. 0.5 4 ° C에서 20 분 동안 관련 단클론 항체의 / 10 6 세포를 ng를 가진 세포를 품어. FACS A의 항체 희석
  4. 390 X g에서 세포를 원심 분리기 5 분에 FACS (A)의 200 μl를 추가합니다. 두 번이 단계를 반복합니다. FACS의 A. 100 ㎕의 샘플을 재현 탁
  5. CX (3)으로부터 T 세포를 분석 CR1 GFP / + X RAG - / - OT-II / 37 흐름 cytometer 적색 CD4 T 세포로 재구성 쥐.
    6. 상용 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석 할 수 있습니다.

10. 공 초점 현미경 분석

  1. OT-II / 레드 CD4 + CD62L + T 세포로 재구성 여부 CX (3) CR1 GFP / + 마우스의 결장을 분석하고 E. 1 × 10 8 CFU로 모든 둘째 날 구두로 공급 대장균 균주 DH10B pCFP-OVA.
  2. 가위와 핀셋을 사용하여 마우스의 결장을 제거합니다. 이 길이 방향으로 해부 가위를 사용하여 엽니 다.
  3. 가위를 사용하여 대장 샘플의 5-8mm 조각을 잘라 유리 슬라이드에 넣고 된 커버와 커버.
  4. 40 / 1.30의 확대에 공 초점 현미경으로 대장 샘플을 분석 할 수 있습니다.
  5. 509 nm에서 488 nm에서 여기 및 방출 세트 필터를 사용하여 녹색 형광 단백질 (GFP)이 표시된 CX (3) CR1 + 의원을 감지합니다.
  6. 58에서 554 nm에서의 여기 및 방출 세팅 된 필터를 사용하여 적색 단백질을 발현하는 CD4 + T 세포를 검출6 나노 미터.
  7. 480 nm에서 450 nm에서 여기 및 방출 세트 필터를 사용하여 대장균 pCFP-OVA를 감지합니다.
  8. 관심 영역을 정의하고, 이전에 공동 위치 파악 분석을 수행하기 위해 50 바와 같이 분산도를 생성한다. 은 Manders와 피어슨의 계수에 따라 중첩 계수 : 2 개의 다른 공식을 사용합니다.

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결과

항원 중심 대장염 모델 E.을 설정하려면 콜라이 균주 강한 구성 적 프로모터 P 하이퍼 (도 1a)의 제어 하에서 발현되는 CFP 유전자가 닭 오브 알부민 단백질과 융합 구조체에 대한 코딩 서열에 융합 된 플라스미드를 포함하는 구성되었다. 형광 현미경 보여줍니다 재조합 E. 대장균 pCFP-OVA가 아니라 부모의 E. 대장균 DH10B는 CFP (그림 1B)를 표현한다. E.을 생산하는 CFP-OVA- 대장균은 시험 관내 OT-II 세포를 활성화 및 E. 대조적으로 IFN-γ의 생산을 유도 할 수있다 CFP를 표현하는 대장균 균주 만 (그림 2 참조). 그림 3a는

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토론

다른 모든 모델과 같이, 상술 한 항원 구동 대장염 모델 기술을 수행하는 연구자는 유의해야 할 몇 가지 문제점을 제시 할 수있다. 구약-II 호스트에서 / 레드 + CD4 + T CD62L + 세포를 주입 할 때, 연구자는 복강에 주사 바늘을 ​​삽입하는 것은 매우 온화하고주의해야합니다. 그렇게하지 ​​않으면 사망에이를 수있는 마우스 또는 질병을 유발하지 않습니다 세포의 피하 투여의 소장의 파열 될 수 있습니다.

일반적으로 마우스는 셀 전송 후 첫 주 동안 체중이 증가 할 것이다. 연구자는 각각 중량 시점에서 동시에 마우스 무게 및 전체 공정에 걸쳐 동일한 무게 저울을 사용한다. 때로는 실험 쥐 실험의 시작에서 그 무게가 18g 이하이며, 특히 낭비 증후군의 징후를 개발하지 않는다. 그러나 이러한 동물 might는 여전히 거시적 평가에서 중요한 장내 염증을 개발한다.

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공개 사항

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감사의 글

JHN은 스위스 국립 재단(SNSF 310030_146290)의 지원을 받습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
LB 국물, 밀러 (Luria-Bertani)Difco244620
로타리 쉐이크레이스 Laborbedarf e. K.모델 3020 GFL
2mm 갭 쿠벳 Peqlab Biotechnologie GmbH71-2020
글리세롤시그마-알드리치G5516-100ML
유전자 펄서 Xcell 시스템 BioRad Laboratories GmbH1652660
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)Difco244510
AmpicillinSigma-AldrichA9393-5G
SOC MediumSigma-AldrichS1797-100ML
고순도 플라스미드 분리 키트Roche11754777001
AgaroseCarl Roth GmbH & Co3810.1
EDTASigma-AldrichE9884-100G
Tris-HClSigma-AldrichT5941
빙하 아세트산Sigma-Aldrich537020 
젤 챔버 PEQLAB Biotechnology GmbH40-0708
로딩 염료Thermo FisherR0611
GeneRuler 1 kb DNA 래더 Thermo FisherSM0312
에티듐 브로마이드 용액Carl Roth GmbH & Co. KG2218.3
사진 문서화 시스템 Decon Science Tech GmbHDeVision G 
DNA 염기서열분석 MWG-Biotech GmbH
인산염 완충 식염수(PBS)BiochromL182-50
형광 현미경 ZeissHBO 100
Mini-PROTEAN Tetra SystemBio-Rad Laboratories GmbH1658005
PageRuler Prestained Protein Ladder Fermentas, St. Leon-Rot, 독일
IstanBlue SolutionExpedeon, Cambridgeshire, 영국
니트로셀룰로오스 멤브레인 Macherey-Nagel GmbH & Co. KG741280
전기 블로터 Biometra GmbH846-015-600
소 혈청 알부민 (BSA)Sigma-AldrichA6003-25G
항-오브알부민 항체 Abcamab181688
안티-토끼 IgG  HRP시그마-알드리치A0545 
Pierce ECL Plus 웨스턴 블로팅 기질Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc32132
ForeneAbbott2594.00.00
FBSInvitrogen10500-064
Falcon Cell StrainersFischer Scientific 08-771-2
암모늄 클로라이드Sigma-Aldrich254134-5G
Tris 베이스Sigma-Aldrich10708976001
CD4+ CD62 L+ T 격리 키트 Miltenyi Biotec130-093-227 
MACS LS 열 Miltenyi Biotec130-042-401
MACS MS 컬럼 Miltenyi Biotec130-042-201
MidiMACS 분리기Miltenyi Biotec130-042-302
MiniMACS 분리기Miltenyi Biotec130-042-102
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
Feeding Needle 20GSouthPointe Surgical Supply, IncFN-7903
포르말린 용액, 중성 완충, 10%시그마-알드리치HT501128
파라핀시그마-알드리치1496904
헤마톡실린시그마-알드리치H9627
에오신 Y시그마-알드리치230251 
디티오트레이톨시그마-알드리치D9779 
콜라겐분해효소 VIII 타입시그마-알드리치C-2139
로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트 (RPMI) 매체AppliChemA2044, 9050
소듐 아지드시그마-알드리치438456
마우스 BD Fc 블록BD 파밍겐553141
FITC-conjugated mAb 결합 Vß 5.1, 5.2 BD Pharmingen553189
APC-conjugated mAb binding CD4 GK1.5 eBioscience17-0041-83
FACS 칼리버 BD Biosciences
FCS Express V3 소프트웨어DeNovo
Meta 스캐닝 컨포칼 현미경 자이스LSM 710 
자이스 워크스테이션자이스LSM 7
자이스 ZEM 소프트웨어 Zeissv4.2.0.121
Maxisorp 면역 플레이트 NUNC, Roskilde442404
Streptavidin conjugated alkaline phosphataseJackson Immuno Research016-050-084
알칼리성 인산가수분해효소 기질 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrateSigma-Aldrich71768-5G
mAb R4-6A2BD Biosciences551216
mAb XMG1.2 BD Biosciences554410
TECAN 마이크로플레이트-ELISA 리더Tecan
EasyWin 소프트웨어Tecan
DNase I 재조합4536282001

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