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항원 중심의 성 대장염 모델의 개발은 항원이 T 세포에 세포를 제시하여 항원의 프리젠 테이션을 공부하기

DOI:

10.3791/54421

⸱

September 18th, 2016

 ,  ,  , 
1APC Microbiome Institute, University College Cork, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University Hospital Basel, 3Institute of Microbiology and Biotechnology, University of Ulm

In This Article

Summary

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이 항원 주도 대장염 모델에서는 적색 형광 단백질을 발현하는 OT-II CD4+ T 세포를 단핵 식세포(MP)에서 녹색 형광 단백질을 발현하는 RAG-/- 마우스로 채택하여 전달했습니다. 숙주는 청록색 형광 단백질(CFP)에 융합된 오브알부민 단백질(OVA)을 발현하는 대장균(E.coli)에 도전했습니다.

Abstract

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염증성 장 질환(IBD)은 위장관(GIT)에 영향을 미치는 만성 염증입니다. 질병 중에 관여하는 면역학적 메커니즘을 연구하는 가장 좋은 방법 중 하나는 대장염의 T 세포 전달 모델입니다. 이 모델에서는 면역결핍 마우스(RAG-/- 수용자)를 건강한 야생형 숙주에서 유래한 미성숙한 CD4+ T 세포로 재구성합니다.

이 모델을 사용하면 장 염증이 지속되지만 정의된 항원에 의존하지 않는 질병 및 만성 염증으로 이어지는 가장 초기의 면역학적 사건을 검사할 수 있습니다. 질병 진행에서 항원제시세포(APC)의 잠재적인 역할을 연구하기 위해서는 정의된 공생 유래 항원이 대장염을 유발하는 항원 주도 질병 모델을 갖는 것이 도움이 됩니다. 따라서 항원 주도 대장염 모델이 개발되었습니다. 이 모델에서 OVA 단백질의 특정 항원결정기만 인식할 수 있는 OT-II CD4+ T 세포는 CFP-OVA 발현 E. coli에 도전하는 RAG-/- 숙주로 전달됩니다. 이 모델을 통해 lamina propria에서 APC와 T 세포 간의 상호 작용을 검사할 수 있습니다.

Introduction

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대장은 외부 환경에 노출되어 상기 몸체의 큰 표면이다. 상주 균의 광대 한 배열 장내 미생물 (또는 미생물)를 형성하는 인간의 장내 정착. 이는 최대 100 조 미생물 세포로 구성되어 것으로 추정 생물학 1-3에 알려진 가장 인구 밀도가 세균의 서식지 중 하나 구성된다. 망할 놈의 박테리아는 생존과 4를 곱 장내 틈새 시장을 식민지화. 반환에서, 미생물은 유전자 1 인코딩되지 않은 추가 기능 기능 호스트를 부여한다. 예를 들어, 미생물은 상피 세포의 증식을 자극 스스로 호스트가 생성 할 수없는 비타민을 생산하고, 신진 대사를 조절하고 병원균 4-6을 방지합니다. 이 유익한 관계를 감안할 때, 몇몇 저자는 인간이 박테리아와 인간의 유전자 7,8의 혼합이다 "슈퍼 유기체"또는 "holobionts"것을 제안했다. 제 (인간) 호스트에있는 미생물의 수익에 미치는 영향을 감안할 때, 장내 면역 시스템은 루멘에서 자신의 존재를 가능하게뿐만 아니라 내강 측 9-11에서 침입 병원균을 죽일 공생 미생물을 허용 할 필요가있다. 장내 면역 시스템은 무해하고 잠재적으로 유해한 내강 미생물을 구별하는 메커니즘을 개발했다; 그러나 이러한 메커니즘은 아직 잘 (12)을 이해하지....

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Protocol

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마우스는 사육과 울름 대학 (울름, 독일)의 동물 시설에서 특정 병원균이없는 (SPF) 조건에서 보관 하였다. 모든 동물 실험은 지역 동물 사용 및 관리위원회와 국립 동물 복지법의 지침에 따라 수행 하였다.

pCFP - OVA 플라스미드 1. 건설

  1. 플라스미드 PCI-OVA (저항 암피실린) 템플릿으로 42을 사용하여 프라이머 Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 ') 및 Ova_ClaI_rev (3'- GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5') (37)를 사용하여 풀 사이즈 OVA 유전자를 증폭. 특정 OVA 플라스미드를 생성하기 위해 프라이머 및 벡터를 SpeI와 라이터 시험 제한 부위를 사용하여 시판의 파지 미드 벡터 내로 (난자 코딩 서열 IE) PCR 산물을 복제.
  2. 플라스미드 패드 1을 사용하여 강한 구성 적 프로모터 P 하이퍼과 함께 CFP 코딩하는 유전자를 증폭 -cCFP 템플릿 및 프라이머 CFP_SacII_fw (3'-GATCGACCGC....

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Results

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항원 중심 대장염 모델 E.을 설정하려면 콜라이 균주 강한 구성 적 프로모터 P 하이퍼 (도 1a)의 제어 하에서 발현되는 CFP 유전자가 닭 오브 알부민 단백질과 융합 구조체에 대한 코딩 서열에 융합 된 플라스미드를 포함하는 구성되었다. 형광 현미경 보여줍니다 재조합 E. 대장균 pCFP-OVA가 아니라 부모의 E. 대장균 DH10B는 CFP (그림 1B)를 표현한다. E.을 생산하는 CFP-OVA- 대장균은 시험 관내 OT-II 세포를 활성화 및 E. 대조적으로 IFN-γ의 생산을 유도 할 수있다 CFP를 표현하는 대장균 균주 만 (그림 2 참조). 그림 3a는

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Discussion

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다른 모든 모델과 같이, 상술 한 항원 구동 대장염 모델 기술을 수행하는 연구자는 유의해야 할 몇 가지 문제점을 제시 할 수있다. 구약-II 호스트에서 / 레드 + CD4 + T CD62L + 세포를 주입 할 때, 연구자는 복강에 주사 바늘을 ​​삽입하는 것은 매우 온화하고주의해야합니다. 그렇게하지 ​​않으면 사망에이를 수있는 마우스 또는 질병을 유발하지 않습니다 세포의 피하 투여의 소장의 파열 될 수 있습니다.

일반적으로 마우스는 셀 전송 후 첫 주 동안 체중이 증가 할 것이다. 연구자는 각각 중량 시점에서 동시에 마우스 무게 및 전체 공정에 걸쳐 동일한 무게 저울을 사용한다. 때로는 실험 쥐 실험의 시작에서 그 무게가 18g 이하이며, 특히 낭비 증후군의 징후를 개발하지 않는다. 그러나 이러한 동물 might는 여전히 거시적 평가에서 중요한 장내 염증을 개발한다.

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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JHN은 스위스 국립 재단(SNSF 310030_146290)의 지원을 받습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
LB 국물, 밀러 (Luria-Bertani)Difco244620
로타리 쉐이크레이스 Laborbedarf e. K.모델 3020 GFL
2mm 갭 쿠벳 Peqlab Biotechnologie GmbH71-2020
글리세롤시그마-알드리치G5516-100ML
유전자 펄서 Xcell 시스템 BioRad Laboratories GmbH1652660
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)Difco244510
AmpicillinSigma-AldrichA9393-5G
SOC MediumSigma-AldrichS1797-100ML
고순도 플라스미드 분리 키트Roche11754777001
AgaroseCarl Roth GmbH & Co3810.1
EDTASigma-AldrichE9884-100G
Tris-HClSigma-AldrichT5941
빙하 아세트산Sigma-Aldrich537020 
젤 챔버 PEQLAB Biotechnology GmbH40-0708
로딩 염료Thermo FisherR0611
GeneRuler 1 kb DNA 래더 Thermo FisherSM0312
에티듐 브로마이드 용액Carl Roth GmbH & Co. KG2218.3
사진 문서화 시스템 Decon Science Tech GmbHDeVision G 
DNA 염기서열분석 MWG-Biotech GmbH
인산염 완충 식염수(PBS)BiochromL182-50
형광 현미경 ZeissHBO 100
Mini-PROTEAN Tetra SystemBio-Rad Laboratories GmbH1658005
PageRuler Prestained Protein Ladder Fermentas, St. Leon-Rot, 독일
IstanBlue SolutionExpedeon, Cambridgeshire, 영국
니트로셀룰로오스 멤브레인 Macherey-Nagel GmbH & Co. KG741280
전기 블로터 Biometra GmbH846-015-600
소 혈청 알부민 (BSA)Sigma-AldrichA6003-25G
항-오브알부민 항체 Abcamab181688
안티-토끼 IgG  HRP시그마-알드리치A0545 
Pierce ECL Plus 웨스턴 블로팅 기질Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc32132
ForeneAbbott2594.00.00
FBSInvitrogen10500-064
Falcon Cell StrainersFischer Scientific 08-771-2
암모늄 클로라이드Sigma-Aldrich254134-5G
Tris 베이스Sigma-Aldrich10708976001
CD4+ CD62 L+ T 격리 키트 Miltenyi Biotec130-093-227 
MACS LS 열 Miltenyi Biotec130-042-401
MACS MS 컬럼 Miltenyi Biotec130-042-201
MidiMACS 분리기Miltenyi Biotec130-042-302
MiniMACS 분리기Miltenyi Biotec130-042-102
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
Feeding Needle 20GSouthPointe Surgical Supply, IncFN-7903
포르말린 용액, 중성 완충, 10%시그마-알드리치HT501128
파라핀시그마-알드리치1496904
헤마톡실린시그마-알드리치H9627
에오신 Y시그마-알드리치230251 
디티오트레이톨시그마-알드리치D9779 
콜라겐분해효소 VIII 타입시그마-알드리치C-2139
로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트 (RPMI) 매체AppliChemA2044, 9050
소듐 아지드시그마-알드리치438456
마우스 BD Fc 블록BD 파밍겐553141
FITC-conjugated mAb 결합 Vß 5.1, 5.2 BD Pharmingen553189
APC-conjugated mAb binding CD4 GK1.5 eBioscience17-0041-83
FACS 칼리버 BD Biosciences
FCS Express V3 소프트웨어DeNovo
Meta 스캐닝 컨포칼 현미경 자이스LSM 710 
자이스 워크스테이션자이스LSM 7
자이스 ZEM 소프트웨어 Zeissv4.2.0.121
Maxisorp 면역 플레이트 NUNC, Roskilde442404
Streptavidin conjugated alkaline phosphataseJackson Immuno Research016-050-084
알칼리성 인산가수분해효소 기질 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrateSigma-Aldrich71768-5G
mAb R4-6A2BD Biosciences551216
mAb XMG1.2 BD Biosciences554410
TECAN 마이크로플레이트-ELISA 리더Tecan
EasyWin 소프트웨어Tecan
DNase I 재조합4536282001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 307, 1915-1920 (2005).
  2. Cario, E., Podolsky, D. K. Intestinal epithelial TOLLerance versus inTOLLerance of commensals. Mol Immunol. 42, 887-893 (200....

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