방법 논문

디자인과 낮은 비용의 사용, 자동 Morbidostat 박테리아의 적응 진화에 대한 항생제 약물 선택에서

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⸱

DOI:

10.3791/54426

⸱

2016년 9월 27일

 ,  ,  , 
1Electrical Engineering, National Tsing Hua University

이 논문에서

요약

약물 농도를 동적으로 조정하여 항생제 약물 내성의 특성을 분석할 수 있는 저비용의 구성 가능한 모비드도스타트를 설명합니다. 이 장치는 다중화된 미세유체 플랫폼과 통합될 수 있습니다. 이 접근 방식은 실험실 항생제 약물 내성 연구를 위해 확장할 수 있습니다.

초록

우리는 항생제 내성의 진화 경로를 특성화 저렴한 비용으로, 구성 morbidostat에 대해 설명합니다. morbidostat 연속적 박테리아 증식을 모니터링하여 동적으로 약물 내성을 획득 진화 항상 세균 도전 약물 농도를 조절하는 세균 배양 장치이다. 이 장치는 ~ 10 ML의 작업 볼륨을 갖추고 있으며, 완전 자동화 및 광학 밀도 측정 및 매체 및 약물 전달 마이크로 펌프가 장착되어 있습니다. 플랫폼의 유효성을 확인하기 위해, 우리는 1655 대장균 MG에서 trimethoprim을 저항의 단계적 취득을 측정하고, 세포 형태 및 항생제 감수성을 조사 할 수있는 멀티 플렉스 미세 유체 플랫폼과 장치를 통합. 접근 방식은 항생제 약물 내성의 실험실 연구를 확장 업 및 대사 공학 및 기타 세균 배양 실험에서 변형 개선을 위해 진화를 적응 적하는 확장 가능한 것입니다 수 있습니다.

서론

최초의 항생제 페니실린의 도입 이후, 미생물의 항생제 내성은 세계적인 건강 문제 (1)로 발전하고있다. 항생제 내성의 획득은 생체 내 향적 연구 할 수 있지만, 이러한 실험의 조건들은 전체에 걸쳐 방출이 제어되지 않는다. 이와 달리, 적응 실험실 진화 항생제 약물 (3)로부터 환경 스트레스 또는 선택 압력 하에서 미생물 종의 분자 적 진화를 공개 할 수있다. 최근 항생제 내성 많은 잘 제어 진화 실험은 항생제 내성 출현을 해명 하였다. 예를 들어, 오스틴의 그룹은 적절하게 설계 미세 유체 복실 환경 4의 급속한 출현을 보여 주었다. 최근에 개발 된 약물 morbidostat 선택 압력 하에서 5,6- 체계적 돌연변이를 유도한다. morbidostat, 미생물 SELEC연속적으로 거의 일정한 집단을 유지하기 위해 항생 물질의 농도를 조절 능 장치는 미생물 7,8에서 사용한 변동 테스트에서 큰 전진한다. 변동 시험에서, 항생제 약물을 고농도로 주입하고, 살아남은 돌연변이 스크리닝하고 계산한다. 대신, morbidostat에서 미생물 끊임없이 도전하고 여러 돌연변이를 획득한다.

morbidostat는 chemostat, 미생물 인구 9 희석 동안 지속적으로 영양분을 공급하여 일정한 인구를 유지하고 1950 년 노빅과 Szliard에 의해 발명 문화 장치와 유사하게 작동합니다. 도입 이후, chemostat는 고급 및 개선되었습니다. 현재 마이크로 유체 chemostats은 나노 리터 및 단일 셀 용량에 도달했습니다. 그러나, 이러한 장치는 많은 돌연변이 이벤트 10, 11와 큰 세포 인구를 필요로 적응 진화 실험에 적합하다. 최근, 미니~ 10 ml로 작업 볼륨이 chemostats는 리터 규모의 생물 반응기 및 마이크로 유체 chemostat (12, 13) 사이의 간극을 채우기 위해 개발되었다.

여기에서 우리는 항생제 약물 내성 연구에 대한 설계 및 저가의 사용, 자동 morbidostat을 제시한다. 제안 된 모듈은 최소한의 하드웨어 요구 사항을 가진 미생물 실험실에서 진탕 배양기에서 사용될 수있다. 오픈 소스 펌웨어는 쉽게 대사 공학 3과 적응 진화의 특정 애플리케이션에 맞게 조정된다. 마지막으로, morbidostat 항생제 감수성 검사 (14)에 대한 멀티 플렉스 미세 유체 플랫폼에 통합되어 있습니다.

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프로토콜

Morbidostat 장치의 1 조립 및 사전 테스트

  1. Morbidostat 조립
    1. 18 G 주사기 바늘 문화 유리 병의 뚜껑에 3 홀 펀치. ~ 길이 7cm를 폴리에틸렌 튜브의 세 가지를 잘라. 캡에 폴리에틸렌 튜브의이 세 가지를 삽입합니다.
    2. 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 혼합물의 주조로 사용하기 위해 캡의 가장자리를 감싸 테이프를 사용합니다. 이쑤시개 수동으로 교반하여 성분 5 g 및 150 ml의 플라스틱 컨테이너에 PDMS의 B 성분의 0.5 g을 혼합한다. 10 ML의 주사기에 혼합로드합니다.
      1. 주사기와 캡의 PDMS 혼합물을 붓고. 70 ° C의 오븐에서 8 시간에 대한 PDMS를 경화 전체 캡을 굽는다.
    3. 납땜 인두와 탄소 저항과 24 게이지 와이어 및 LED 음극과 양극 LED를 납땜. 24 G 와이어와 680 Ω 탄소 저항을 납땜. 전기 테이프를 사용하여 와이어 연결을 절연.
    4. 그래서24 G 선 및 100 kΩ의 탄소 저항기 검출기의 이미 터와 광 검출기의 콜렉터 lder. 전기 테이프를 사용하여 와이어 연결을 절연.
    5. 문화 유리 병 홀더에 발광 다이오드를 배치합니다. 부가도 2의 회로도를 수행함으로써, LED는 IR (예를 들어, 이동 전화 카메라)를 검출 할 수있는 디지털 카메라를 사용하여 작동하도록 5 V.의 전원 공급 다이오드와 전원을 발광 연결한다.
    6. 문화 유리 병 홀더 광 검출기를 배치합니다. 부가도 2의 회로도에 따라, 전자 제어 보드를 가로 지르는 전압을 측정하는 검출기 저항의 양측에 와이어를 연결 5 V.의 전원과 광 검출기 및 전원에 연결.
    7. 교반기 수단 인 냉각 팬의 축에 자석을 붙인다. alignm합니다배양 병에 팬 및 배양 바이알과 자석 사이의 간격의 축부의 엔트 자기 교반 장치의 적절한 기능에 매우 중요하다.
    8. 마이크로 펌프, 중간 병, 폐기물 병 실리콘 튜브의 대응 조각으로 배양 병의 폴리에틸렌 튜브의 각 부분을 연결합니다. 1 시간 동안 펌프를 켜고 전체 볼륨이 펌프 속도를 결정하기 위해 문화 유리 병에 매체 병에서 펌핑되는 측정한다. 일반적인 펌핑 속도가 희석 비율 D = 0.33 시간 -1 문화 유리 병의 볼륨을 작동하는 12 ml의 용에 해당 ~ 4 ㎖ / 시간이어야합니다.
    9. 중간 크기 (34cm X 34cm X 43.5 cm) 진탕 배양기에 전체 어셈블리를 놓습니다.
  2. Morbidostat을 사전 테스트
    1. 5 V로 냉각 팬의 집합 전원 전압은 자기 교반 막대를 테스트하기 위해 그 모터를 시작한다. 교반 작용 육안 검사 할 수 있습니다. 구동 전압냉각 팬 모터는 정확히 펄스 폭 변조 (PWM)에 의해 제어된다 s는.
    2. 야생형 E. 일련의 준비 600에서 광학 밀도를 갖는 대장균 시료는 일반적으로 0.07에서 교정 0.3 nm의 범위. 테스트 E. 배치 배양 병에 대장균 샘플과 검출기 전압을 기록한다.
      1. 장소 ~ 100 플레이트 판독기에서 동일한 샘플 ㎕의 광학 밀도를 기록한다. 검량선을 플롯 광학 밀도 데이터 대 전압 검출기를 사용한다. 일반적으로, 광학 밀도의 1 단위 변화가 여기에 사용되는 바이어스 방식과 광 검출기에서 ~ 7.6 V 변화에 대응합니다.

2. Morbidostat 실행

  1. 데일리 실험을 시작하기 전에 준비
    1. 입구 부에서와 같이 장치를 형성하기 위해 내경이 1/32 인치 외부 직경 3/32 인치 세 울트라 화학성 타이곤 호스와 배양 병을 준비1.1 및 보충 그림 1인치
    2. M9 최소 배지 (0.2 % 포도당) 및 트리 메소 프림 (TMP) 약물 함유 배지를 준비합니다. 121 ℃에서 오토 클레이브 배지, 배지 병, 약물 매체 병, 폐기물 용기 및 배양 병을 소독.
      주 : TMP 나중에 표 1의 농도 및 배지를 함유하는 약물 TMP가 멸균되지을 달성하기 위해 사용되는 원액이다.
  2. Morbidostat 실행
    1. 실험 첫날, 냉동 야생형 1 ml의 E. 해동 실온 전송 함유 배양 병에 120 μL 세포에서 5 분간 콜라이 MG1655 ~ M9 세포 성장 배지 12 mL로. 1 일 이후에, 냉동 E. 1 ㎖를 해동 대장균 5 분 및 전송이 포함 된 새로운 문화 유리 병에 세포 120 μL의 전날 셀 ~ M9 성장 배지 12 ml를.
    2. 진탕 배양기를 켜고 템피을 설정 전혀 흔들림 30 ° C에 rature.
    3. 마이크로 펌프, 자기 교반 장치 및 광학 밀도 측정 켜서 morbidostat 동작을 시작한다.
      주 : 동작 동안, 임계 값 피드백 알고리즘은 약물 주입을 제어하기 위해 사용된다. 측정 된 광학 밀도가 미리 설정된 임계 값을 초과 할 경우, 약물 주입 펌프를 턴온 될 것이고, 매체 펌프가 턴 오프된다. 그렇지 않으면, 약물 주입 펌프는 꺼진 상태로 유지하고, 매체 펌프가 켜져 있습니다.
    4. 미생물 성장이 있는지 확인하기 위해 수시로 전압을 모니터한다.
      참고 : 때문에 동결 및 해동주기, E.의 대장균 세포는 매일의 성장시 ~ 4 시간의 지연을 나타낸다.
    5. ~ 23 시간 후, 그것의 공급 전압을 해제하여 마이크로 펌프를 중지하고 문화 유리 병을 꺼내. 문화 유리 병에 15 % 글리세롤을 추가하고 저장을 위해 -80 ° C에서 샘플을 동결.
    6. 반복 2.2.5에 2.2.1 단계를 반복합니다.
제작 "> 3. 항생제 감수성 측정 96 음 형식으로

주 : 항생제 내성 수준을 결정하기 위해 96 웰 포맷 플레이트 리더에서 성장 속도 측정을 수행한다.

  1. 실온에서 5 분 동안 매일 샘플을 냉동 및 해동 ~ 15ml의 M9 배지를 함유하는 바이알에 배양 세포의 15 μl를 옮긴다. 그들을 ~ 0.1에 도달 내지 600 nm에서의 광학 밀도까지 성장 할 수 있습니다. 1 ㎖의 병에 15 mL로 분할하고, 표 1에 나타낸 바와 같이 원하는 약물 농도를 얻기 위해,이 단계에서 TMP 약물을 추가한다.
  2. 플레이트 리더에서 잘 각으로 단계 3.1과 장소에서 샘플 200 μl를 가지고 그들을 12 시간 5 성장할 수 있습니다. 파장 600 nm에서의 광학 밀도를 측정하는 동안 자동으로 기록된다.
    주 : 각 데이터 포인트에 대해, 삼중 측정 기록 된 데이터의 일관성을 보장하기 위해 평균화된다. 시간에 대한 광학 밀도의 데이터는 수 bE는 성장 속도를 얻기 위해 사용된다.
  3. IC (50)를 획득하기 위해 상기 약물 농도 대 성장 속도 데이터를 플롯. IC (50) 성장 속도가 최대 성장 속도 (5)의 50 %가되는 약물 농도로서 정의된다합니다.

미세 유체 장치 4. 단일 세포 형태와 항생제 감수성 측정

  1. 다른 곳에서 15 설명한 바와 같이 PDMS에서 다층 소프트 리소그래피를 통해 미세 유체 장치의 제조를 수행합니다.
    1. 제어 및 흐름 층의 포토 레지스트 몰드를 만들기 위해 포토 리소그래피를 사용합니다. 제어 층에 베어 실리콘 웨이퍼 상에 몰드를 생산하는 네가티브 포토 레지스트 (~ 15㎛의 높이) 및 포지티브 레지스트 (~ 8 ㎛의 높이)를 사용할 수 있습니다.
    2. 각각의 제어 층과 유동 층, 1 : 1 내지 20 : 5의 비율 가교와 PDMS 혼합물을 준비한다. 모든 거품을 제거하기 위해 진공하에 데시 케이 터에 혼합물을 넣어1 시간 동안.
    3. (TMCS) 증기 트리메틸 위해 실리콘 웨이퍼 상에 포토 레지스트 층 제어 금형 노출. PDMS의 혼합물을 캐스팅하여 ~ 6mm 두께의 제어 층을 (가교 비율 5 : 1) 제어 층의 포토 리지 스트 몰드에 실리콘 웨이퍼. 오븐에서 1 시간 동안 80 ° C에서 40 분 동안 제어 층을 굽는다.
    4. (1, 회전 속도가 60 초 동안 3,000 RPM 가교 율 20)와 유동 층 포토 리지 스트 몰드에 PDMS 혼합물을 스핀 코팅에 의해 유동 층을 만든다. 오븐에서 1 시간 동안 80 ° C에서 30 분 동안 유동 층을 굽는다.
    5. 원하는 칩 사이즈로 제어 층 (통상 3cm X 2cm)을 절단 수동 제어 층을 박리 면도날을 사용한다. 유동 층의 상부에 상기 제어 층을 올려 놓고 입체 현미경을 정렬. 오븐 하룻밤에 80 ° C에서 정렬 된 어셈블리를 치료. 그 후, 잔류 TMCS을 용해하는 5 시간 동안 플라스틱 용기에 탈 이온수 250 ㎖에 조립체를 침지.
    6. 이어서, 20 G 바늘 유입 구멍을 펀치 (PDMS 간 비율이 5 링크 : 회전 속도 2000 rpm으로 30 초를 들면, 1) 빈 PDMS 층으로 코팅 된 유리 슬라이드를 엘라스토머 전체 접합 40 초에서 공기 플라즈마 처리하여 1.2 토르 공기압.
    7. PDMS의 세포 독성 효과를 감소시키기 위해 80 ℃에서 36 시간 동안 광범위한 베이킹을 수행. 이러한 베이킹 단계는 상기 세균 세포에 독성을 최소화하는 것이 중요합니다.
  2. 칩 성장 실험에
    1. 미세 유체 장치에 넣기 전에 1 시간 동안 1 시간과 M9 매체에 대한 탈 이온수로 세척합니다.
    2. 실온에서 5 분 동안 매일 샘플을 동결 해동 신선한 M9 배지로 새로운 시험관에 접종. 하룻밤 37 ℃에서 진탕 배양기에서 샘플을 놓습니다.
    3. M9 매체와 미생물 샘플 10 배 희석하고 5 psi에서 미생물 시료 용기를 압박하여 미세 유체 장치에로드합니다. 그런 다음 TMP 약물을로드5 psi에서 약물 매체 컨테이너를 압박하여 칩에 매체. 15 분 동안 마이크로 유체 칩에 두 개의 챔버 사이에 마이크로 기계식 밸브를 작동하여 미생물 및 약물의 혼합을 실행합니다.
    4. 거꾸로 현미경에 장착 된 현미경 인큐베이터에있는 마이크로 유체 칩을 놓습니다. CCD 카메라와 8 시간마다 시간이 도립 현미경에 장착 된 성장 챔버 내의 셀 화상을 취득.
    5. 셀의 영상 데이터 (18)상의 임계 알고리즘을 통하여 세포 수를 계산하기 위해 사용자 정의 프로그램 스크립트를 사용한다. 셀 번호 데이터는 일반적으로 위에 세 미세 유체 챔버 평균을합니다.

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결과

상술 morbidostat은도 1에 도식화한다. 실험 진화 항생제 감수성 시험 및 세포 형태 검사를 포함하는 일반적인 동작을 morbidostat, E.에서 검증 된 (TMP) trimethoprim을 노출 대장균 MG1655 문화, 일반적으로 사용되는 항생제 약물 5,6. TMP는 약물 내성이 매우 독특한 단계적 증가를 유도하고, 돌연변이 디 하이드로 리덕 타제 (DHFR) 유전자 클러스터를 해결한다. 따라서, TMP는 morbidostat 동작을 검증하기위한 매우 효과적인 표준 약물이다. 매일, 상기 미생물은 소정의 광학 밀도가 임계치를 초과하여 증가하고도 2a에 도시 된 바와 같이, 약물 주입을 유발하는 것으로 예상된다. 약물 주입 성장을 억제 할 것으로 예상 결과, 광학 밀도가 감소된다. 몇몇 시험 런은 최적의 약물 농도를 결정하기 위해 필요할 수있다...

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토론

저가의 구성 요소에서 낮은 풋 프린트 morbidostat 장치가 설명된다. 장치 등록 약제 내성 수준의 증가는 이전보고 5의 것과 일치한다. 약물 내성의 진화 연구를 위해 설계된 장치는 다른 많은 실험에 잠재적으로 적용 할 수있다. 첫째, 약물 - 유도 된 돌연변이의 광범위한 데이터베이스 임상 적 항생제의 큰 세트에 설정 될 수있다. 예를 들어 다제 내성의 진화 경로 단순히 실험에 사용 된 약물의 수를 증가시킴으로써 조사 될 수있다. 여기에보고 모듈의 주요 장점은 다양한 실험 조건 하에서 대규모 병렬 실험 있도록 유연한 구성 가능성이다.

개념은 마이크로 유체 측정에서 설명되었다하더라도, 조사 파워는 유체 기술은 마이크로 유체 (23)를 결합함으로써 개선 될 수있다. 당 비용측정 (규모의 경제)이 극적으로 감소 시약 소비 감소 노동에 의해 감소된다. 여기서, 하나의 세포 형태 데이터는 미세 유체 플랫폼으로부터 추출 될 수있다. 최근에, ...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

저자는 이론적 분석과 수치 시뮬레이션에 유용한 토론과 도움을 주신 Sze-Bi Hsu 교수님과 Zhenzhen 씨에게 감사드립니다. Y. T. Y.는 과학기술부(Ministry of Science and Technology)로부터 보조금 번호 MOST 103-2220-E-007-026 및 MOST 104-2220-E-007-011로, 국립 칭화대학교(National Tsing Hua University)로부터 보조금 번호 103N2042E1로 자금 지원을 받았음을 감사드리며, 104N2042E1 및 105N518CE1.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
환경 셰이커 인큐베이터BioSanES-20
Arduino Leonardo 보드ArduinoLeonardo
680 옴 탄소 저항기Digikey바이어스 저항기 LED
용 100k 옴 탄소 저항기Digikey바이어스 저항기 광 트랜지스터 용 바이어스 저항기
940nm 발광 다이오드밝은 LED 전자BIR-BM13E4G-2광학 밀도 측정
940 nm 광 트랜지스터Kodenshi ST-2L2B광학 밀도 측정
Darlington 쌍 IC 토시바마우저ULN2803APG이 IC는 마이크로 펌프와 자기 교반 장치를 구동
5 V DC 브러시리스 팬ADDAAD0405LX-G70사양: 5 V 공급 전압 및 80  엄마; 사용 가능한
www.jameco.com 압전 마이크로 펌프CurieJetPS15I-FT-5L압력 > 3  kPa; 흐름률 >5 ml/min
Tygon 3350 튜닝Saint GobainABW00001ID: 1/32" OD: 3/32" L:50' 
자석 젓는 막대COWIE테이퍼드 모양 희미한: 10  mm x 4 mm
유리 섬광 20 ml 바이알DGSPyrex 유리 28 mm (지름) x 61 mm (높이)
문화 바이알 홀더폴리포름알데히드로 맞춤 제작 
유리 바이알 중간 병을 밀봉하는 데 사용되는실리콘Dow CorningSylgald 184
VWR66022-065
Difco M9 최소 소금 5xBD중간
카다미노 산BD중간
포도시그마
한천 한천 BateriologicalOxoid
Luria Bertani 매체
도립 현미경Leica MicrosystemsLeica DMI-LED미세유체 측정에 사용 40X 대물렌즈 NA = 0.55
현미경 인큐베이터세유체 측정에 사용되는라이브 셀 기기CU-109
솔레노이드 밸브PneumadyneS10MM-31-12-3평상시 열림 1.3와트 12Vdc
USB 인터페이스 카드취미 엔지니어링USBIO24-R 디지털 I/O 모듈 미세유체 측정용
공기 압축기Rocker ScientificROCKER 440미세유체용 압력 소스; 최대 압력 80psi
미세유체 제어에 사용되는1/8" 미늘ValuePlastics.comMTLL230-1
1/8" 미늘 10-32 나사산 포트ValuePlastics.comB-1미세유체 제어에 사용되는
10-32 나사산 포트에대한 암 루어락 피팅ValuePlastics.comKFTL-1미세유체 제어에 사용됩니다
NPN darlington 트랜지스터 500 mA, 40  V (2N6427)DigiKey.com2N6427GOS-ND는 미세유체 제어에 사용됩니다
10 kOhm, 탄소 필름 저항기, 0.25 WDigiKey.comP10KBACT-ND는 미세유체 제어
탄탈륨 커패시터에 사용됩니다, 10  &뮤; F, 25 V, 10%DigiKey.com478-1841-ND는 미세유체 제어에 사용되며
Andor CCD 카메라는AndorZyla 4.2 Plus SCMOS가 미세유체 이미징에 사용됩니다
ELISA 플레이트 리더
두 구성 요소 실리콘 MomentiveRTV 615미세유체 칩 제조에 사용
SU-8 포토레지스트MicrchemSU8 2015미세유체 칩 제조에 사용
AZ4620 포토레지스트ClariantAZ 4620미세유체 칩 제조에 사용
플라즈마 클리너Harrick PlasmaPDC 32G미세유체 칩 제조에 사용
20 게이지 주사기 바늘BD마이크로플루이드 칩 제작에 사용됩니다.
LabcyclerSensoquestLabcyclerPCR
DNA 중합효소ToyoboKDO PlusPCR 증폭
TrimethoprimSigma Plate
readerBiotekSynergy H1 hybrid 항생제 레지스테인 측정
합니다. 기 당 사용 미에 대한 수 루어락 피팅은 . .

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