종양 미세 환경의 모방 : 세포 간 통신을 농축 세포 인구를 생성 및 조사를위한 간단한 방법

Summary

종양 미세환경(TME)을 모방하기 위해 투과성 미다공성 멤브레인 삽입물을 조정했습니다. 이 모델은 혼합 세포 배양으로 구성되며, 형광 태깅 또는 세포 분류를 사용하지 않고 고도로 농축된 개별 세포 집단을 간단하게 생성할 수 있으며, 정상 또는 스트레스 조건에서 TME 내 세포 간 통신을 연구할 수 있습니다.

Abstract

암세포와 주위의 비 - 암성 기질의 초기 이형 작용을 이해하는 것은 실질 활성화 및 종양 미세 환경 (TME) 설립 이어지는 이벤트를 아는데 중요하다. 시험 관내 및 생체 TME 모델 일부는 개발되었다; 그러나, 일반적으로 이러한 모델 용이 추후 연구 비 교란 조건 하에서 각각의 세포군의 분리를 허용하지 않는다. 이러한 어려움을 회피하기 위해 연장 된 공동에 대한 인서트의 멤브레인의 양측에 개별적으로 밀접 성장 고도로 농축 된 세포 집단의 단순 생성하면서도 허용하는 투과성 미다 공막 인서트 이루어진 세포 성장 기판을 이용한 시험 관내 TME 모델을 채용 한 - 문화 회. 이 모델의 사용을 통해, 우리는 정상 이배체 인간 섬유 아세포에서 (CAF) 인구는 다음과 같은 매우 풍부한 암 관련 섬유 아세포를 생성 할 수있다형광 태그 및 / 또는 셀의 정렬을 사용하지 않고 높은 전이성 인간 유방암 세포와 공 배양 (120 시간). 또한, 삽입물의 기공 크기를 조절함으로써, 우리는 개발 근본적인 메커니즘의 조사를 허용하는 두 개의 이형 세포 집단 사이 간 통신 (예를 들어, 갭 정션 통신 분비 인자)의 모드에 대해 제어 할 수있다 갭 접합 투과성의 역할을 포함 TME. 이 모델은 암 기질 개시의 TME의 초기 진화 및 치료제에 대한 암세포의 반응에 기질의 조절 효과로 이어지는 초기 사건에 대한 우리의 이해를 높이는 데 유용한 도구 역할을한다.

Introduction

종양 미세 환경 (TME)을 공존 기질 및 호스트와 함께 진화 암종 세포로 구성된 복잡한 시스템이다. 이 기질 성분은 일반적으로 섬유 아세포, 근육 섬유 모세포, 내피 세포, 다양한 면역 성분뿐만 아니라, 세포 외 매트릭스 ^(1)로 구성된다. 중요한 성분이 기질의 대부분은 종종 활성 섬유 아세포 자주 암 관련 아세포 또는 암 - 관련 아세포 (CAF) ^2,3-라고 칭한다. 정상적인 비 - 활성화 된 섬유 아세포와 달리 CAFs에 유방, 전립선, 폐, 췌장, 피부, 결장, 식도를 포함한 암의 다양한에서 종양의 개시, 진행, 혈관 형성, 침윤, 전이 및 재발 ^4-11에 기여하고, ^5,6,12-17 난소. 그러나, 암 발병에 걸쳐 CAFs에의 기여의 정확한 특성을 제대로 정의 된 상태로 유지됩니다. 또한, 임상 적 증거는 CAFs에의 예후 값을 보여 주었다높은 등급의 악성 종양, 치료 실패 및 전반적인 불량한 예후의 ^10,18,19에 자신의 존재의 상관 관계.

분명히, CAF 개발 개시 이벤트뿐만 아니라 TME 내 역할을 매개 세포 간 통신에 대한 이해를 향상 환자 결과를 향상시킬 수있는 새롭고 흥미로운 치료 대상 향상된 전략을 제공 할 수있다. ....

Protocol

문화 미디어와 세포의 1. 준비

1. 이글의 최소 필수 12.5 % (부피 / 부피)으로 보충 된 배지 열 활성화 된 우 태아 혈청 (FBS), 2 mM의 L- 알라 닐 -L- 글루타민, 페니실린 100 유니트 500 ㎖의 용액 당 스트렙토 마이신 100 μg의 준비.
   주 : 성장 배지 및 보충 (들)을 쉽게 다른 세포 균주 또는 세포주의 성장 조건에 대해 교환 될 수있다.
2. 각각의 인서트 (6 웰 포맷 인서트)를위한 세포 배양 배지 70 ㎕를 준비 : 이글의 최소 필수 배지는 50 % (vol / vol) 열 활성화, FBS 2 mM의 L- 알라 닐 -L- 글루타민, 100 단위로 보충 페니실린과 스트렙토 마이신 ml의 당 100 μg의.
   주 : 배지는 인서트의 바닥면 (즉, 하측)에 세포 부착을 용이하게하기 위해 50 % FBS가 보충된다. 성장 배지 및 보충 (들)을 쉽게 다른 세포 균주 또는 세포주의 성장 조건에 대해 교환 될 수있다.
3. 인서트의 바닥면에 도금 될 운명 세포의 세포 현탁액을 준비한다.
   주 : 여기에서, 결과 AG1522 75 ^㎠로 세포 배양 플라스크에서 배양 정상적인 인간 섬유 아세포를 사용하여 수득하고, 이들 세포 따라서 세포 현탁액의 제조에 대한 ....

Results

여기서 우리는 생체 내 종양 미세 환경 (도 1)를 모방 한 시험 관내 이형 세포 공 배양 시스템을 개발하는 투과성 미다 공막 인서트 장치. 서로 다른 세포 집단은 (유스에서는, 120 시간 이하) 장시간 동안 삽입물의 다공질 막의 양측에 성장 될 때까지 이러한 시스템은 허용한다. 0.4-, 1-, 3 M-세공 인서트의 윗면에 GFP 표지 된 MDA-MB-231 세포를 도금들이 성장할 수에 의해 결정되는 중요한에있어서, 상기 세포 집단의 순도를 유지할 수 AG1522 세포는 120 시간 동안 상기 인서트의 바닥면에 성장하는 공존 배양. 이 시간 후, 세포는 인서트의 바닥면으로부터 수집하고, 세포 집단 순도의 손실을 표시하는 어떤 GFP 양성 MDA-MB-231 세포의 존재를 확인하기 위해 유세포 분석. 분석은 99.9 %와 99.8 % 폴리 우레탄 밝혀각각 0.4와 1 ㎛ 기공 삽입에서 인구 재; 기공 막에.......

Discussion

여기에 설명 된 프로토콜은 투과성 미다 공막 인서트 이형 세포의 공 배양에서 고농축 개별 세포 집단을 생성하기 위해 이용하는 간단한 시험 관내 절차에 적응 (도 1)이다. 현저하게, 간 모델은 다양한 통신 방식을 연구하기에 적합하다. 중요한 단계는 상단 측에 제 세포군 시드 50 % FBS로 보충 된 배지에서 인서트의 바닥면에 상기 제 세포군 시드 특정 실험이자 (S)에 적절한 기공 크기의 삽입물을 선택하는 것을 포함 삽입하고, 적절한 시간 동안 두 개의 별개의 세포 집단을 공동 배양. 우리는이 시스템은 따라서 분자 표현형을 이해하는 큰 기회를 제공하는 다양한 생체 내 특성을 모방 할 수 있음을 보여 주며, 잠재적 변화는 주요 D를 해결 초기 TME 발전 중에 생기는많은 설립 TME 체외 모델의 isadvantage (그림 2).

모델은 쉽게 암 기질 개발 및 진화 T.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
세포 배양용
AG01522 (i.e., AG1522) 인간 이배체 섬유아세포	Coriell	107661	Passage 8-13
MDA-MB-231-luc-D3H1 유방 선암 세포주	PerkinElmer	119261	부모 라인: ATCC (#HTB-26)
MDA-MB-231/GFP 유방 선암 세포주	Cell Biolabs	AKR-201
독수리의 최소 필수 배지(MEM)	Corning Cellgro	15-010-CV
소 태아 혈청(FBS), 적격	시그마	F6178-500mL
코닝 글루타그로 보충제(200mM L-알라닐-L-글루타민)	Corning Cellgro	25-015-Cl
페니실린 스트렙토마이신 용액, 100x	Corning Cellgro	30-002-Cl
트랜스웰 인서트 (i.e., 투과성 미세다공성 멤브레인 인서트) (0.4 & m pore)	Costar	3450
Transwell Insert (i.e., 투과성 미소다공성 멤브레인 인서트) (1 μ m pore)	Greiner bio-one	657610
Transwell Insert (i.e., 투과성 미소다공성 멤브레인 인서트) (3 μ m pore)	Costar	3452
6-well Culture Plate	Greiner Bio-One Cellstar	657160-01
75 cm2 세포 배양 플라스크	CellStar	658 170
인산염 완충 식염수(PBS), 칼슘	및 마그네슘 미포함	Corning Cellgro	21-040-CV
0.25%(vol/vol) 트립신, 2.21mM EDTA, 1x	Corning Cellgro	25-053-Cl
15ml 원심분리기 튜브	CellTreat	229411
35mm x 10mm 세포 배양 접시	Greiner bio-one	627 160
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
면역형광 현미경 검사용
Mouse anti-Caveolin 1	BD Transduction Laboratories	610406	In situ Immunofluorescence - 1:5,000
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary 항체, Alexa Fluor 488 conjugate	ThermoFisher Scientific	A-11029	In situ Immunofluorescence - 1:2,000
Bovine Serum Albumin - Fraction V	Rockland	BSA-50	면역글로불린 및 프로테아제 무함유
16%(wt/vol) 포름알데히드 용액	ThermoFisher Scientific	28908	)를 사용하여 4%로 희석
	Fisher	12548B
Triton X-100	Sigma	T8787-50ML
Invitrogen	S36938
을 사용한 SlowFade Gold 안티페이드 시약Name	Company	카탈로그 번호	Comments
For Flow Cytometric Analysis
Calcein, AM	Molecular Probes	C3100MP
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14025-076
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
For Western Blot Analysis
Mouse anti-Caveolin 1	BD Transduction Laboratories	610406	Western Blot - 1:1,000
Tween-20	BioRad	170-6531
니트로 셀룰로오스 멤브레인 (0.2 μ m)	BioRad	162-0112
Western Lightning Plus-ECL	PerkinElmer	NEL104001EA
BioRad DC 단백질 분석	BioRad	500-0116
도데실황산나트륨(SDS)	BioRad	161-0302
데옥시콜레이트 나트륨 일수화물(DOC)	Sigma	D5670
IGEPAL CA-630(NP40)	Sigma	I8896
30% 아크릴아미드/비스 용액, 37.5:1	BioRad	161-0158