사이트 특정 복제 막힘의 유도 E. 대장균 형광 리프레 운영자 시스템을 사용하여

Summary

여기서는 대장균의 복제 분기점을 멈추고 붕괴시키기 위해 부위 특이적이고 가역적인 생체 내 단백질 블록을 사용하는 시스템을 설명합니다. 복제 블록의 설정은 형광 현미경으로 평가하고 중성 2차원 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 복제 중간체를 시각화합니다.

Abstract

밀접하게 결합 단백질과 다양한 병변을 포함하여 DNA에 존재하는 장애물, 심각한 세포의 복제 기계의 진행을 억제 할 수 있습니다. replisome의 실속 복제 포크의 붕괴로 이어지는 염색체의 어느 부분 또는 전체의 해리가 발생할 수 있습니다. 이 붕괴로부터의 복구는 셀에 정확하게 완전한 염색체 복제 및 이후 분할에 대한 필요성이다. 복제를 DNA 포크를 복원하고 수 있도록 자리를 차지할 붕괴가 발생하면 따라서 세포가 진화하고 다양한 메커니즘은 높은 충실도 완료합니다. 이전에, 박테리아에서 이러한 복제 보수 경로는 알려진 위치에 국소 없다는 단점이 UV 손상을 이용하여 연구되었다. 이 원고 실속 복제 FO 붕괴를 유도 할 수있는 부위 특이 단백질의 블록을 생성하는 형광 리프레 조작 시스템 (FROS)을 이용하는 시스템을 개시대장균에서 RKS. 복제 상태는 형광 현미경 및 DNA 복제 중간체를 사용하여 하나의 살아있는 세포에서 가시화 될 수있는 방법을 프로토콜 세부 2 차원 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 분석 될 수있다. replisome 성분 (예 DnaBts)의 온도 민감성 돌연변이 복제 포크 동기 붕괴를 유도하는 시스템에 포함될 수있다. 더욱이, 이러한 프로세스에 관련된 재조합 단백질 및 헬리의 역할은이 시스템에서 유전자 녹아웃을 이용하여 연구 할 수있다.

Introduction

DNA 복제 동안 replisome 그 진행을 저해 DNA의 장애물에 직면하고있다. DNA 병변과 간격을 포함한 피해뿐만 아니라 비정상적인 구조는 ¹ 진행에서 replisome를 방지 할 수 있습니다. 최근,이 DNA에 결합하는 단백질 포크 진행 ² 복제 장애의 가장 일반적인 원인 인 것으로 밝혀졌다. 핵 단백질 블록과 replisome의 발생에 따라 이벤트의 기술은 이미 공지 된 위치에서 살아있는 세포의 염색체 이러한 블록을 유도하는 무능력에 의해 제한되었다. 시험 관내 분석은 운동 동작에 대한 이해를 강화했다 그것이 핵 단백질 막힘 ^3뿐만 아니라 ^4,5- replisome 자체의 기계적인 세부 사항을 충족하는 활성의 replisome. 복제의 수리 현재 이해는 일반적으로 생체 ^6-8에서 플라스미드 DNA를 사용하여 손상 에이전트로 자외선을 수행하고 연구한다 입니다. 그것은 일반적으로 이러한 연구로부터 이해되는 생체 핵 단백질 블록을 발견 한 후 복제 블록 내의 별개의 원인으로 인해 복구 경로 내에서 분자 수준의 변화가 아직 여전히 존재 여부, DNA의 복구에 관여 할 수있는 단백질 동안 결정한다.

Protocol

1. FROS와 복제를 차단

1. 복제 막힘을 유도
   1. E.의 신선한 야간 문화를 희석 OD를 _{600 ㎚} = 희석 복합 배지에서 0.01로 TETO 어레이 pKM1 ¹⁸ 실시 대장균 (0.1 % 트립 톤, 0.05 % 효모 추출물, 0.1 %의 NaCl이 0.17가 M KH ₂ PO _4, 0.72 MK ₂ HPO ₄₎ 항생제는 필요 선택.
      참고 :이 시스템과 호환되지 않습니다으로 선택을 위해 테트라 사이클린을 추가하지 마십시오. 필요한 샘플 당 10 ml의에 해당 문화의 볼륨을 확인합니다. 예를 들어,도 1의 실험 디자인 배양 부피 60 mL로한다.
   2. OD _{600 nm의} = 0.05-0.1까지 진탕 30 ° C에서 성장. 유도되지 않은 제어 역할을하고 pKM1에서 TetR-YFP의 생산을 유도하기 위해 남아있는 문화를 0.1 % 아라비 노스를 추가하는 10 ml의 샘플을 제거합니다. 유도되지 않은 및 유도 모두 계속 증가문화. 1 시간 후, (섹션 2 참조) 형광 현미경을 이용하여 유도 배양 각 셀 내의 단일 초점의 존재를 확....

Results

FROS는 살아있는 세포의 ^{12, 18} 시각화 복제 중간체 있도록 유도 성, 부위 특이 적 핵 단백질 블록이다. 세포를 채취하는 일반적인 실험 디자인은도 1에 도시된다. 유전 적 배경 샘플링 및 변화의 타이밍이 같은 블록의 복구를위한 연구 다기능 시스템을 만든다. 회로도는 이전에 ¹⁸ 사용 된 같은 dnaB 시액 및 dnaC의 TS 등 온도에 민감한 돌연변이가이 시스템에 이용 될 수있는 방법을 보여줍니다.

FROS의 유도는 E.을 실시 하였다 도 1에 도시 된 바와 같이, 대장균 균주 비 온도에 민감한 균주에 대한. 핵 단백질 블록이 설립했다 세포를 0.1 % 아라.......

Discussion

염색체 복제 중에 복제 기계는 진행을 방해하는 다양한 장애물에 직면하게 됩니다. 전체 단일 기원 염색체가 복제되도록 하기 위해 박테리아는 DNA 복구를 위한 수많은 경로를 가지고 있으며, 이를 통해 레플솜을 다시 로드할 수 있습니다^20,21. 병변, 단일 가닥 절단, 이중 가닥 절단 및 DNA에 단단히 결합된 단백질은 각각 전용 경로를 사용하여 처리할 수 있지만 이러한 경로에는 상당한 중복이 있을 수 있습니다. 살아있는 세포에서 레플리좀에 대한 가장 흔한 장애물은 핵단백질 블록²입니다. 그러나 레플리좀과 핵단백질 차단의 충돌을 연구하는 데 있어 두 가지 오랜 어려움은 사건을 염색체의 알려진 위치에 국소화하는 방법과 자세한 분석을 허용할 수 있을 만큼 사건을 자주 만드는 방법이었습니다. 대 장균 이 정체/붕괴된 복제 포크에 어떻게 대처하는지에 대한 지식의 대부분은 UV를 DNA 손상제로 사용하는 것에서 비롯됩니다.

여기에 설.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
트립톤	시그마-알드리치	16922	성장 매체 성분
염화나트륨	VWR	27810.364	성장 매체 성분
효모 추출물	시그마-알드리치	92144	성장 매체 성분
인산칼륨 일염기성	시그마-알드리치	P9791	성장 배지 성분; 칼륨 완충제 성분
산칼륨 이염기성	시그마-알드리치	P3786	성장 매체 성분; 칼륨 완충 성분
L-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256	TetR-YFP 생산 유도용
Anhydrotetracycline hydrochloride	Sigma-Aldrich	37919	복제 블로키지
릴리스 Axioskop 2 형광 현미경	Zeiss	452310	세포
eYFP 필터 세트	Chroma Technology	41028	의 시각화YFP
CCD 카메라의	Hamamatsu	Orca-AG	세포 시각화
MetaMorph  이	SDR Scientific	31282	버전 7.8.0.0
Agarose	Bioline	BIO-41025	아가 로즈 플러그 및 젤 전기 영동
Original Glass Water Repellent (Rain-X)	Autobarn	DIO1470	For agarose plug manufacture
TRIS	VWR	VWRC103157P	TE, TBE buffer component
에틸렌 디아민 테트라 아세트산	Ajax Finechem	AJA180	0.5 M EDTA 디 소듐 염 용액을 NaOH로 pH 8.0으로 조정했습니다.
아지드 나트륨	: 시그마 -알드리치	S2002	정균제
염산	시그마 알드리치	258148	TE 완충 성분
: 나트륨 데 옥시 콜레이트	시그마 -알드리치	D6750	세포 용해 완충 성분
N- 라우로 일 사르코신 나트륨 염 (사르 코실)	시그마 - 알드리치	L5125	세포 용해 및 ESP 완충 성분
Rnase A	Sigma-Aldrich	R6513	세포 용해 완충액 성분
Lysozyme	Amresco	6300	세포 용해 완충액 성분
Proteinase K	Amresco	AM0706	ESP 완충액 성분
Sub-Cell Model 192 Cell	BioRad	1704507	전기영동 시스템
UV transilluminator 2000	BioRad	1708110	DNA
의 시각화에티듐 브로마이드	BioRad	1610433	DNA의 시각화
붕산	VWR	, PROL20185.360	TBE 구성 요소
Hybond-XL, 나일론, memrbane	Amersham	RPN203S	Zeta-Probe, Memrbane (BioRad 1620159)도 사용할 수 있습니다
, 3MM, Whatman 크로마토 그래피 종이	GE Healthcare, Life Sciences,	3030690	Southern blotting
HL-2000, Hybrilinker	UVP	95-0031-01/02	DNA와 혼성화
디옥시리보 핵산	Sigma-Aldrich	31149	혼성화 완충액 성분
수산화나트륨	Sigma-Aldrich	S5881	변성 완충액 성분
구연산 삼나트륨 이수화물	VWR	PROL27833.363	전달 완충액
데실황산나트륨(SDS)	Amresco	227	세척 완충액 성분
소 혈청 알부민	시그마 - 알드리치	A7906	혼성화 완충액 성분
무작위 헥사머 프라이머	Bioline	BIO-38028
Klenow 단편	New England BioLabs	M0212L
dNTP 세트	Bioline	BIO-39025
아데노신 5'- 삼인산 -< sup>32P-ATP	PerkinElmer	BLU502A
스토리지 형광체 스크린	GE Healthcare Life Sciences	GEHE28-9564-76	BAS-IP MS 3543 E 다목적 표준 35cm x 43cm 스크린
Typhoon FLA 7000	GE Healthcare Life Sciences	28-9558-09	블롯
하이브리드화 병	UVP	07-0194-02	35mm x 300mm