이 연구에서 우리는 재생 연구에 사용되는 소설, 신생아, 쥐의 심장 발판을위한 방법론을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
말기 심부전의 유일하고 확실한 치료법은 정형외과성 심장 이식입니다. 매년 미국에서 심장 이식 시술을 위해 100,000개 이상의 기증자 심장이 필요한 것으로 추정됩니다1-2. 기증자의 수가 제한되어 있기 때문에 미국에서는 매년 약 2,400건의 이식 수술만 시행됩니다.2. 세포 치료 연구에서 기계적 보조 장치 이식에 이르기까지 수많은 접근법이 단독으로 또는 조합하여 심장이 스스로 회복하도록 달래거나 고장난 심장을 쉬게 하기 위해 수행되었습니다3. 이러한 노력에도 불구하고 심실 보조 장치는 여전히 이식을 위한 목적으로 주로 사용되고 있으며 세포 치료의 유용성은 일부 치유 가능성을 가지고 있지만 여전히 임상 시험에 국한되어 있습니다. 또한 직접 이종 이식이 시도되었지만 면역 거부 반응으로 인해 성공이 제한적이었습니다. 분명히, 이식을 위한 추가 장기를 생산하기 위해서는 또 다른 전략이 필요하며, 이상적으로는 이러한 장기가 거부 반응 및 평생 면역 억제와 관련된 합병증을 피할 수 있도록 자가 가능해야 합니다. 탈세포화(Decellularization)는 조직에서 상주 세포를 제거하여 천연 세포외 기질(ECM) 또는 골격을 노출시키는 과정입니다. 관류 탈세포화는 조직의 3차원 구조를 완전히 보존하는 동시에 조직의 기계적 특성의 대부분을 그대로 유지합니다4. 이러한 골격은 연구 모델을 생성하고 이식에 필요한 장기를 생성하기 위해 건강한 세포로 재증식하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 놀라운 심장 재생 능력을 유지하는 것으로 알려진 신생아 마우스(P3)의 골격을 세제 매개 탈세포화(decellularization)5-8에 노출시켰고, 이 골격을 쥐 심장 세포로 다시 채웠습니다. 이러한 연구는 신생아 심장 구조물 엔지니어링의 타당성을 뒷받침합니다. 그들은 또한 초기 산후 심장의 ECM이 개선된 재세포화 전략을 초래할 단서를 가지고 있을 수 있는지에 대한 조사를 가능하게 합니다.
서론
심부전은 일반적이고 치명적입니다. 그것은 기관에의 혈류를 저해하고, 신체의 대사 충족 수요를 남긴다 심장의 수축력 저하를 초래 진행성 질환이다. 570 만 미국인들이 심장 마비를 가지고있는 것으로 추정하고 미국 9 입원의 주요 원인이다. 미국에서 심장 마비 환자를 치료 집단 비용은 연간 9-10 당 $ (300) 억 달러를 초과합니다. 말기 심부전 유일한 최종 치료 동소 심장 이식이다. 매년, 10 만 명 이상의 기증자 마음이 미국 1-2에서 심장 이식 절차에 필요한 것으로 추정된다. 때문에 기증자의 제한된 번호 만 약 2,400 이식은 미국이 매년 수행됩니다. 분명히, 이러한 장기 결품 다른 전략 transplanta 추가 기관을 생산하는 데 필요한으로 해결되어야거부 평생 면역 억제와 관련된 부작용을 회피하기 위하여 기 및 이상적으로 이러한 장기자가있을 것이다.
포유류 성인 심근 부상에 따라 제한된 재생 능력을 보여하지만 최근의 증거는 포유류의 신생아 마음이 상해 5-8 다음과 같은 놀라운 재생 능력을 유지하는 것이 좋습니다. 특히, 부분적인 수술 적 절제 다음, 회생 창이 출생과 출생 후의 일 사이에 발견되었다 (7)이 회생 기간은 섬유 ....
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프로토콜
모든 마우스 실험은 미국 동물 복지 법에 따라 수행하고 미네소타 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
마우스 심장 격리 1. 방법
- 단일 사용 블레이드 잘린에 의해 신생아 마우스를 안락사.
- 70 % 에탄올로 흉부를 면봉.
- # 5 포셉 한 쌍의 측 방향으로 피부를 당기면서 표준 가위로 가슴 벽에서 멀리 절단하여 가슴에서 피부를 해부하다.
- 복벽을 통해 절단에 의해 가위로 흉골 단지 열등한 복부를 관통. 가위로 가슴의 양쪽에 리브 불구하고 절단하는 동안 # 5 집게와 칼 모양의 프로세스를 파악, 몸에서 rostrally 흉골을 철회. 흉곽은 심장을 표시 할 수있는 집게와 우량 반영됩니다.
- 퉁명스럽게 노출, # 5 집게 측 방향으로 당겨 흉선의 두 가지 주요 로브를 해부대동맥 아치뿐만 아니라 대정맥과 폐정맥.
- 10 센티미터 봄 가위로 대동맥 궁에서 주요 동맥 및 대동맥 자체를 가로로 쪼개다. 마음의베이스와 팔 머리 동맥과 대동맥을 유지합니다. 기도와 식도에서 분리, 앞으로 마음을 반영하기 위해 #와 함께 5 집게를 절단 혈관의 끝을 잡고.
- 10 센티미터 봄 가위로 심장의 양쪽 폐와 심장 사이에서 절단하여, 폐 혈관 및 기타 주요 정맥을....
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결과
탈세 포화
평균적으로, 이러한 프로토콜을 사용하여 P3 심장 탈세 포화까지의 시간은 약 14 시간이다. P3의 신생아 23 mg의 평균 심장 무게 주어진.
Acellularity
도 3a는 완전히 그대로 P3 신생아 마음을 (전체 마운트). 그림 3b는. 탈세 포화 다음과 같은 마음을 보여줍니다도 4a 및도 각각 손상 및 decellularized 마음의 헤 마톡 실린 및 에오신 염색을 보여 4b는 보여줍니다. 헤 마톡 실린 긍정적 인 핵의 부재와 decellularized 마음에 호산 구조의 감소에 유의하십시오. 또한, decellularized 마음의 DNA 함량이 크게 그대로 마음.......
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토론
마음의 반복 관류에이 기술의 의존도는 색전증을 피하기 성공적인 결과의 중요한 구성 요소를 만든다. 단계 2.8-2.14 사이의 솔루션의 변화 단계 2.2-2.6의 심장의 초기 카테터,에서, 어떤 타협 심근에 관류의 흐름을 기포의 도입을 허용 할 수 있습니다 조작이 있습니다. 때문에 신생아 심장의 소형 크기로, 혈관에 미세한 기포 따라서 불완전 탈세 포화 렌더링, 기술 경색의 원인이 될 수 있습니다. 또한, 나중에 세척 단계에서, 불완전 관류에 부정적인 영향을 생체 적합성 세제 잔류 물이 발생할 수 있습니다. 변화에 용액으로부터의 가스 움직임을 용해 할 때 또한 기포 형성의 원인이 될 수있는 또, 단계 2.14에 제시된 바와 같은 4 ℃로 보관 중 매트릭스를 제거 할 때와 같은 급격한 온도 변화는주의 접근해야 온도입니다. W주입을 위해, 세포 현탁액에 주사기를 준비 할 때, 부가적인 치료가 적용되어야 recellularization로 진행 편 무료 버블 (6.4 공정)이다.
이.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 피규어를 준비한 Ms. Cynthia DeKay에게 감사의 뜻을 전합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
6. pre-plating
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1입니다. 마우스 심장 격리 재료 | |||
| P1 마우스 새끼(그림 참조; 나6; D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J) | Jackson Laboratories | 21577 | 또는 동급 |
| 60mm 배양 접시 | BD Falcon | 353004 | 또는 동급 |
| , 인산염 완충 식염수, pH 7.4(멸균), | Hyclone | SH30256.01 | 또는 동급 |
| , 일회용 블레이드 | Stanley | 28-510 | 또는 동급 |
| 표준 가위 | Moria Bonn(Fine Science Tools) | 14381-43 | 또는 동급 |
| 스프링 가위, 10cm | Fine Science Tools | 15024-10 | 또는 동급 |
| Vannas Spring Scissors - 3mm Cutting Edge | Fine Science Tools | , 15000-00 | 또는 동급 |
| #5 Forceps | Dumnot (Fine Science Tools) | 11295-00 | 또는 동급 |
| 2. 탈세포화 | |||
| 입구 어댑터 | Chemglass | CG-1013 | 오토클레이브 가능 |
| Septum | Chemglass | CG-3022-99 | 오토클레이브 가능 |
| 1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex 튜빙 | Cole-Parmer | EW-06422-10 | 오토클레이브 가능한 |
| 남성 루어에서 1/8" 호스 바브 어댑터 | McMaster-Carr | 51525K33 | 오토클레이브 |
| 가능한 여성 루어에서 1/8" 호스 바브 어댑터 | McMaster-Carr | 51525K26 | 오토클레이브 가능한 |
| Prolene 7-0 수술용 봉합사 | Ethicon | 8648G | 또는 동급 |
| 링 스탠드 | Fisher Scientific | S47807 | 또는 동급 |
| 클램프 | Fisher Scientific | 05-769-6Q | 또는 동급 |
| 클램프 정규 홀더 | Fisher Scientific | 05-754Q | 또는 동급 |
| 60 cc 주사기 배럴 | Coviden | 1186000777T | 또는 동급 |
| Beaker | Kimble | 14000250 | 또는 동급 |
| 22G x 1 주사기 바늘 | BD | 305155 | 또는 동급 |
| 12cc 주사기 | Coviden | 8881512878 | 또는 동급 |
| 3방향 정지 콕 | Smith Medical | MX5311L | 또는 동급 |
| PE50 튜빙 | BD Clay Adams Intramedic | 427411 | 열에 의해 성형될 수 있어야 합니다. 폴리에틸렌 권장. |
| 1% SDS | Invitrogen | 15525-017 | 초순수 등급 권장. 신선한 용액을 만들고 필터는 사용하기 전에 살균하십시오. |
| 1% 트리톤 X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 10% 재고에서 신선한 용액을 만들고 필터는 사용 전에 살균합니다. |
| 멸균 dH2O | Hyclone | SH30538.02 | 또는 MilliQ 시스템 정제수. |
| 1x 펜/스트렙 | 코닝 CellGro | 30-001-Cl | 또는 동급 |
| 3입니다. DNA 정량화를 위한 물질 | |||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 | >30 U/mg 활성 |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | 또는 이에 상응하는 |
| MgCl2· 6H2O | Mallinckrodt | 5958-04 | 또는 동급 |
| 트윈 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | 또는 동등한 |
| Tris base/hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1503/T5941 | 또는 동등한 |
| Pico-Green dsDNA 분석 키트 | Life Technologies | P7589 | 형광계가 판독해야 합니다 |
| 4. 조직의 고정 및 절편 방법 | |||
| 파라포름알데히드 | Sigma-Aldrich | P6148 | 또는 |
| 돼지 껍질의 동등한 젤라틴 A형 | Sigma-Aldrich | G2500 | 300 블룸 이상이어야 합니다 |
| 5. 조직 조직학 방법 | |||
| Cryomolds 10 x 10 x 5 mm | Tissue-Tek | 4565 | 또는 동등한 |
| Cryostat | Hacker/Bright | Model OTF | 또는 동등한 |
| 현미경 슬라이드 25 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-19 | 또는 동등한 |
| Hematoxylin 560 | Surgipath/Leica Selectech | 3801570 | 또는 이에 상응하는 |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | 또는 이에 상응하는 |
| Define | Surgipath/Leica Selectech | 3803590 | 또는 이에 상응하는 |
| 블루 버퍼 | Surgipath/Leica Selectech | 3802915 | 또는 이에 상응하는 |
| 알코올 중독자 Eosin Y 515 | Surgipath/Leica Selectech | 3801615 | 또는 동등한 |
| Formula 83 Xylene 대체품 | CBG 바이오텍 | CH0104B | 또는 이에 상응하는 |
| Permount Mounting Medium | 피셔 케미컬 | SP15-500 | 또는 동급 |
| Collagen IV 항체 | Rockland | 600-401-106.1 | 또는 동급 |
| α-Actinin 항체 | Abcam | AB9465 | 또는 동급 |
| mCherry 항체 | Abcam | AB205402 | 또는 동급 |
| NKX2.5 항체 | Santa Cruz Biotechnology | SC-8697 | 또는 동급 |
| 의 Donkey anti-mouse AF488 항체 | Life Technology | A21202 | 또는 이에 상응하는 |
| Donkey anti-chicken AF594 항체 | Jackson Immunoresearch | 703-585-155 | 또는 이에 상응하는 |
| 당나귀 안티 염소 CY5 항체 | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | 또는 동급 |
| Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594 | Jackson Immunoresearch | 111-587-003 | 또는 동급 |
| ThermoFisher | P36930 | 또는 동급 | Prolong Gold Antifade Mountant < |
| HBSS (Ca, Mg Free) | Hyclone | SH30031.02 | 또는 동급 |
| HEPES (1 M) | Corning CellGro | 25-060-Cl | 또는 동급 |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | 또는 동급 |
| 50 ml 튜브 | BD Falcon | 352070 | 또는 동급 |
| Primeria 100 mm를 사용하여 신생아 심실 심근세포 분리 Primeria 표면 | 353803 | Corning | 섬유아세포 부착을 강화하여 더 높은 근세포 순도를 촉진합니다 |
| Trypsin | Difco | 215240 | 또는 |
| 동등한 DNase II | Sigma-Aldrich | D8764 | 또는 동등한 |
| DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media) | Hyclone | SH30022.01 | 또는 |
| 동등한 비타민 B12 | Sigma-Aldrich | V6629 | 또는 동등한 |
| Fibronectin 코팅 플레이트 | BD Bioscience | 354501 | 또는 이에 상응하는 |
| 태아 소 혈청 | Hyclone | SH30910.03 | 또는 동급 |
| 심장 생물반응기 유리 제품 | Radnoti Glass Technology | 120101BEZ | 오토클레이브 또는 가스로 멸균할 수 있어야 합니다. |
참고문헌
- Yusen, R. D., et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-second official adult lung and heart-lung transplantation report--2015. J Heart Lung Transplant. 34 (10), 1264-1277 (2015).
- Go, A. S., et al.
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