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방법 논문

신생아 심장 공사장 공중 발판 : 회생 연구 소설 행렬

7.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54459

⸱

2016년 11월 5일

 ,  , 
1Lillehei Heart Institute, University of Minnesota

이 논문에서

요약

이 연구에서 우리는 재생 연구에 사용되는 소설, 신생아, 쥐의 심장 발판을위한 방법론을 제공합니다.

초록

말기 심부전의 유일하고 확실한 치료법은 정형외과성 심장 이식입니다. 매년 미국에서 심장 이식 시술을 위해 100,000개 이상의 기증자 심장이 필요한 것으로 추정됩니다1-2. 기증자의 수가 제한되어 있기 때문에 미국에서는 매년 약 2,400건의 이식 수술만 시행됩니다.2. 세포 치료 연구에서 기계적 보조 장치 이식에 이르기까지 수많은 접근법이 단독으로 또는 조합하여 심장이 스스로 회복하도록 달래거나 고장난 심장을 쉬게 하기 위해 수행되었습니다3. 이러한 노력에도 불구하고 심실 보조 장치는 여전히 이식을 위한 목적으로 주로 사용되고 있으며 세포 치료의 유용성은 일부 치유 가능성을 가지고 있지만 여전히 임상 시험에 국한되어 있습니다. 또한 직접 이종 이식이 시도되었지만 면역 거부 반응으로 인해 성공이 제한적이었습니다. 분명히, 이식을 위한 추가 장기를 생산하기 위해서는 또 다른 전략이 필요하며, 이상적으로는 이러한 장기가 거부 반응 및 평생 면역 억제와 관련된 합병증을 피할 수 있도록 자가 가능해야 합니다. 탈세포화(Decellularization)는 조직에서 상주 세포를 제거하여 천연 세포외 기질(ECM) 또는 골격을 노출시키는 과정입니다. 관류 탈세포화는 조직의 3차원 구조를 완전히 보존하는 동시에 조직의 기계적 특성의 대부분을 그대로 유지합니다4. 이러한 골격은 연구 모델을 생성하고 이식에 필요한 장기를 생성하기 위해 건강한 세포로 재증식하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 놀라운 심장 재생 능력을 유지하는 것으로 알려진 신생아 마우스(P3)의 골격을 세제 매개 탈세포화(decellularization)5-8에 노출시켰고, 이 골격을 쥐 심장 세포로 다시 채웠습니다. 이러한 연구는 신생아 심장 구조물 엔지니어링의 타당성을 뒷받침합니다. 그들은 또한 초기 산후 심장의 ECM이 개선된 재세포화 전략을 초래할 단서를 가지고 있을 수 있는지에 대한 조사를 가능하게 합니다.

서론

심부전은 일반적이고 치명적입니다. 그것은 기관에의 혈류를 저해하고, 신체의 대사 충족 수요를 남긴다 심장의 수축력 저하를 초래 진행성 질환이다. 570 만 미국인들이 심장 마비를 가지고있는 것으로 추정하고 미국 9 입원의 주요 원인이다. 미국에서 심장 마비 환자를 치료 집단 비용은 연간 9-10 당 $ (300) 억 달러를 초과합니다. 말기 심부전 유일한 최종 치료 동소 심장 이식이다. 매년, 10 만 명 이상의 기증자 마음이 미국 1-2에서 심장 이식 절차에 필요한 것으로 추정된다. 때문에 기증자의 제한된 번호 만 약 2,400 이식은 미국이 매년 수행됩니다. 분명히, 이러한 장기 결품 다른 전략 transplanta 추가 기관을 생산하는 데 필요한으로 해결되어야거부 평생 면역 억제와 관련된 부작용을 회피하기 위하여 기 및 이상적으로 이러한 장기자가있을 것이다.

포유류 성인 심근 부상에 따라 제한된 재생 능력을 보여하지만 최근의 증거는 포유류의 신생아 마음이 상해 5-8 다음과 같은 놀라운 재생 능력을 유지하는 것이 좋습니다. 특히, 부분적인 수술 적 절제 다음, 회생 창이 출생과 출생 후의 일 사이에 발견되었다 (7)이 회생 기간은 섬유 성 흉터의 부족, 신생 혈관의 형성, 심장 외막에서 혈관 신생 인자의 방출 및 심근 확산 5-8 특징 11. 시간이 회생 창이 bioartificial 심장의 개발을위한 신규 물질의 공급원으로 신생아 심장을 사용하는 가능성을 제공한다.

세포 외 기질은 cardiomyocyt를 촉진하는 중요한 단서를 제공하는 것으로 알려져E 증식 및 성장. 신생아 및 성인 행렬 (12) 및 재생을 촉진 할 수있는 능력 분자의 가용성에 뚜렷한 차이가 13을 탐구하고있다. Decellularized 성인 매트릭스 셀룰러 다시 채우기위한 ECM 지지체 및 bioartificial 심장의 생성을 제공하는 여러 연구에 사용되었다. 줄기 세포 기술이 연구 및 새로운 발견이 빠르게 발전하고 있지만, 몇 가지 장애물이 충족되어야 아직. 예를 들어, 매트릭스 벽으로 행렬의 기본 구조 셀룰러 통합 보존 한계 및 능력이 접근법의 성공 증식 및 성장은 모든 제한을 지원한다. 회생 특성이 우수 신생아 심장 기인되었지만, 이러한 조직을 사용하는 실용적인 측면은 탐색을 제한하고있다.

신생아 심장의 증명 재생 능력을 바탕으로, 우리는 개발을 통해 새로운 매트릭스를 개발했다P3 마우스 심장 탈세 포화의 기술. 이전에 6 결정하지만 마음 수확, decellularize 및 recellularize에 충분한 크기로는 심장 재생의 창 내에서 그대로 P3의 마음은이 연구를 위해 선택되었다. 이 연구의 목적은 쥐 신생아 심장에서 매트릭스를 생성하는 가능성을 입증한다. 우리의 연구는 ECM의 단백질 구조적 무결성을 유지하면서 분 신생아 심장 decellularizing의 가능성에 대한 증거를 제공한다. 우리는 또한 mCherry 표현 심근이 심장 ECM을 recellularize 할 수있는 능력을 보여 우리는 recellularization 다음과 같은 다양한 심장 마커의 발현이 심근을 조사했다. 이 기술은 bioartificial 심장의 개발 신생아 행렬의 우월성 시험을 허용한다.

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프로토콜

모든 마우스 실험은 미국 동물 복지 법에 따라 수행하고 미네소타 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

마우스 심장 격리 1. 방법

  1. 단일 사용 블레이드 잘린에 의해 신생아 마우스를 안락사.
  2. 70 % 에탄올로 흉부를 면봉.
  3. # 5 포셉 한 쌍의 측 방향으로 피부를 당기면서 표준 가위로 가슴 벽에서 멀리 절단하여 가슴에서 피부를 해부하다.
  4. 복벽을 통해 절단에 의해 가위로 흉골 단지 열등한 복부를 관통. 가위로 가슴의 양쪽에 리브 불구하고 절단하는 동안 # 5 집게와 칼 모양의 프로세스를 파악, 몸에서 rostrally 흉골을 철회. 흉곽은 심장을 표시 할 수있는 집게와 우량 반영됩니다.
  5. 퉁명스럽게 노출, # 5 집게 측 방향으로 당겨 흉선의 두 가지 주요 로브를 해부대동맥 아치뿐만 아니라 대정맥과 폐정맥.
  6. 10 센티미터 봄 가위로 대동맥 궁에서 주요 동맥 및 대동맥 자체를 가로로 쪼개다. 마음의베이스와 팔 머리 동맥과 대동맥을 유지합니다. 기도와 식도에서 분리, 앞으로 마음을 반영하기 위해 #와 함께 5 집게를 절단 혈관의 끝을 잡고.
  7. 10 센티미터 봄 가위로 심장의 양쪽 폐와 심장 사이에서 절단하여, 폐 혈관 및 기타 주요 정맥을 가로로 쪼개다. 혈관은 배수를 제공 할 열려.
  8. 주요 혈관의 잘린 끝을 잡고는 # 5 집게와 종격동에서 마음을 제거합니다. 카테터 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)를 포함하는 60mm 배양 접시에 마음을 놓습니다.

랑겐 돌프 관류에 의해 탈세 포화 2. 방법

  1. 사전에 카테터 어셈블리를 준비합니다. 4 센티미터 부분을 그립니다PE의 작은 알코올 불꽃 50 튜브는 작은, 얇은 카테터를 만들 수 있습니다. 측정 기준을 만족하는 날개 끝 손질 (약. 약. 500 μm의 지름의 플랜지 300 μm의 외경 OD)도 1에 도시 된이.이 손잡이의 각각의 측면에서 두 개의 대칭적인 카테터를 제공한다.
  2. 얇은 끝 부분에있는 구멍에 플랜지를 용융, 간단히 불꽃에 튜브의 절단 끝을 가리 킵니다.
  3. PBS로 12 mL를 주사기를 채우고 주사기에 3 방향 스톱 콕을 배치하여 카테터를 조립한다. 꼭지에 22 G × 1 바늘을 추가하고 격막을 통해 바늘을 구동한다. 바늘 (그림. 1)에 그려진 PE 튜브 카테터를 밀어 넣습니다.
  4. 모든 기포가 제거 된 것을 보장 PBS로 조립 부품 관개.
  5. 대동맥 밸브를지나 연장하지, 분리 된 심장의 대동맥으로, 위의 설명과 7-0 봉합사의 한 넥타이와 결찰로 제조 된 카테터를 삽입합니다. t의 플랜지를 휴식그는 꽉 밀봉을하고 카테터를 오는 마음을 방지 넥타이에 근위 카테터.
  6. 부드럽게 PBS가 들어있는 주사기를 사용하여 마음을 관류하면서, 배율 아래 카테터를 관찰한다. 거기에 누수가 시스템에없고 잠재 혈액이 제거 될 때 조직이 균일 blanches 있는지 확인합니다.
  7. 입구 어댑터의 목에 격벽을두고 유리 위에 측면 폴딩하여 밀봉.
  8. 도 20에 나타낸 바와 같이 mmHg의 압력을 발생하는 열을 생성하기 위해 충분한 길이의 선을 통하여 증류수 1 % 소듐 도데 실 설페이트 (SDS) 60 ㎖ (DH 2 O)로 충전 된 저장조에 부착. 1. 1 mmHg에서의 관계에 기초하여 상기 액체 컬럼의 높이의 압력을 계산하면 1.3595 cm의 H 2 O. 같다
    주의 : SDS는 자극 특성을 가진 고도의 응집 분말이다. 접촉은 피해야한다. 적절한 보호 복을 사용하여 분말을 처리합니다.
  9. 14 시간 동안 1 % SDS와 마음을 관류. 마음은 전혀 관찰 나머지 조직과 외관 반투명됩니다.
  10. 나머지 SDS 용액의 콕하도록 시스템을 씻어 내고 10 ㎖의 DH 2 O로 대체 1X 페니실린 스트렙토 마이신 (펜 연쇄상 구균)를 포함하는 60 ml의 PBS 다음 10 ml의 DH 2 O 다음 (증류수에 희석) 10 ml의 1 % 트리톤 X-100과 마음을, 관류.
  11. 4 ° C에서 1 배 펜 연쇄상 구균와 PBS의 마음을 저장합니다. 의도 된 게시물 탈세 포화 응용 프로그램이 다음 대동맥의 카테터가 유지되어야한다 관류를 필요로하는 경우, 그렇지 않으면 봉합 넥타이를 잘라 카테터를 제거합니다.

3. DNA 결정

  1. 50 mM의 KCl을 200 μg의 / ㎖ 프로 테 K를 사용하여 decellularized ECM 또는 제어 마음의 다이제스트를 준비, 2.5 밀리미터의 MgCl 10 mM 트리스 (산도 8.3) 2, 0.45 % 트윈 20.
  2. 조직이 용해 될 때까지 교반하면서 55 ℃에서 조직을 부화일반적으로 4 ~ 5 시간.
  3. 분석 4,11 바인딩 DNA와 균질의 DNA 함량을 정량.

4. 고정 및 조직의 단면

  1. 실온에서 30 분 동안 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드에 decellularized, recellularized 또는 제어 P3의 마음을 수정합니다.
  2. PBS 배에서 조직을 씻으십시오.
  3. 이 싱크 될 때까지 4 ℃에서 0.1 M 인산 완충액 7.5 % 자당 용액의 조직을 놓는다.
  4. 이 싱크 때까지, 다시 4 ° C에서 0.1 M 인산 버퍼에 15 % 자당의 해결책을 변경합니다.
  5. 37 ° C로 가온 조직을 15 % 수 크로스 및 0.1 M 인산염 완충액 젤라틴 용액 부피의 절반을 교체하고 밤새 평형. 젤라틴의 농도는 1 %, 2.5 %, 5 %를 단계적으로 증가하고 마지막으로 7.5 %를 두 번 있습니다.
  6. 신선한 7.5 % 젤라틴을 사용 cryomolds에서 샘플을 놓습니다. decellularized 샘플의 형상을 회복하기 위해 액체 젤라틴 t로서 챔버로 살포 될 수있다그는 마음이 성형. 액체 질소에 cryomolds 부동으로 고정. -80 ° C에서 보관하십시오.
  7. 그라 이오 스탯으로 잘라 (10 μm의 두께) 섹션. 섹션면에 가까운 슬라이드를 가져오고 섹션 인해 정전 기적으로 처리 된 슬라이드의 전하로 표면에 칼으로부터 이동 관찰합니다. 밤새 슬라이드를 건조 및 향후 분석을 위해 -80 ° C에 저장합니다.
  8. 냉장고에서 슬라이드를 제거, 실내 온도 평형 후 젤라틴을 용해 37 ° C에서 20 분 동안 PBS를 포함하는 코 플린 항아리에 넣습니다.
  9. 헤 마톡 실린 및 에오신와 단계 4.7에서 절단 된 부분을 얼룩. 코 플린 항아리에 넣어 슬라이드. 1.5 분 동안 에이전트 블루 우잉, 1 분 동안 수돗물, 3 분 동안 버퍼, 1.5 분 동안 수돗물, 45 초 동안 헤 마톡 실린에 단계 4.8에서 수화 슬라이드를 노출, 80 % 에탄올 1 분, 알코올 에오신 Y 8 초, 1 분 배 1 분, 1 분 배 100 % 에탄올, 에이전트를 삭제 (크실렌 대체) 80 % 에탄올, 수지와 커버 슬립기반 장착 매체. 현미경 슬라이드를 검사합니다.
  10. 가습 실에서 수화 슬라이드를 배치하여 이러한 콜라겐 IV와 같은 ECM 구조 단백질의 심장 ECM, 얼룩의 ECM 단백질의 반응성의 보존을 확인하고 0.1 % 트리톤과 인산염 완충 식염수에 10 % 정상 당나귀 혈청 (NDS)로 처리하려면 -X100 실온에서 1 시간 (RT)에 대한 (PBST). 조직 섹션을 충당하기에 충분한 볼륨을 사용합니다.
  11. 5 % NDS / PBST에서 경험적으로 결정된 희석 선택의 차 항체와 솔루션을 교체합니다. 예를 들어, 콜라겐 IV 항체를 1로 희석 하였다 : 150. 4 ℃에서 밤새 품어.
  12. PBST 배와 슬라이드를 세척하고 형광 염료와 결합 선택의 차 항체를 적용합니다. 실험적으로 결정된 양으로 항체를 희석. 실온에서 1 시간 동안 품어. PBS 3 배 씻으시오.
  13. DAPI는 DAPI 함유 mounti를 사용하여 세포 핵의 유무를 확인하는 등의 DNA 결합 염료 슬라이드 얼룩커버 슬라이드를 미끄러 때 매체 ng를.
  14. 400X 50에서 형광 현미경 슬라이드를 검사합니다.

Recellularization 5. P1 신생아 쥐 심실 심근

  1. 70 % 에탄올로 각각의 강아지 스프레이 단일 사용 블레이드 목을 베다.
  2. 흉부가 흉강을 노출 작은 멸균 가위로 중간 선에서 분할되는 동안 엄지 손가락과 집게 손가락 사이에 각각의 강아지를 잡으십시오. 이 주요 혈관 만 심실 조직을 떠나는 심방의 무료 절단하는 동안 심장이 가슴에서 자유롭게 돌출 할 수 있도록 압력을 적용합니다.
  3. 20 mL의 빙냉 칼슘 모든 하트가 수집 될 때까지 20 mM의 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (CBFHH)과 중탄산염 무료 행크 완충 식염수 용액을 함유하는 50 ㎖ 튜브에 직접 각각의 심장 놓는다.
  4. CBFHH을 기음과 튜브에 신선한 CBFHH (얼음처럼 차가운)의 10 ~ 15 ml에 추가 할 수 있습니다. t의 조직을 소용돌이에 의해 조직을 씻으십시오그는 튜브를 여러 번.
  5. 60 밀리미터 플라스틱 페트리 접시에 마음을 함유하는 용액을 가만히 따르다.
  6. 멀리 봄 가위로 마음에서 그것을 트리밍에 의해 얼음에 확대에 따라 마음에서 어떤 잠재적 인 심방 조직을 해부하다. 균일 크기의 작은 조각으로 심실을 말하다. # 5 집게로 요리에서 어떤 구분이 아닌 심실 조직을 제거합니다.
  7. 멸균 마이크로 교반 막대를 포함하는 작은 멸균 바이알에 조직 조각을 전송할 필요로 CBFHH 용액 많은 피펫.
  8. 조직은 유리 병의 바닥에 침전하고 CBFHH 솔루션을 제거 할 수 있습니다.
  9. CBFHH의 효소 용액 1.75 ㎎ / ㎖ 트립신, 20 μg의 / ㎖의 DNase II 50 ㎖를 확인합니다. 피펫 (5)이 효소 용액 mL 및 자기 교반기 다진 심실 조직과 장소를 함유하는 관에 추가. 8 분 동안 실온에서 일정한 속도 (340 RPM)에서 교반 하였다.
    참고 : 교반 작용이 완만하고 아직 허용해야슬러리의 서스펜션.
  10. 스터 판에서 병을 제거하고 슬러리를 3 분 동안 침전 할 수 있습니다. 그것은 주로 혈액 세포 및 조직 파편을 포함로 피펫은, 초기 소화 상층 액을 버리고.
  11. 피펫 제 5 ㎖의 효소 용액의 분취 량과 소화 뇌실에 추가. 8 분 동안 교반하고 또 다른 3 분 동안 침전 할 수 있습니다. 이전 다이제스트를 시작으로, 두 개의 50 ㎖ 튜브 (1 표지 및 2) 각각의 제조 12 ml를 함유하는 빙냉 소 태아 혈청 (FBS). 각 튜브 꼭대기 40 μm의 셀 스트레이너를 놓습니다. 피펫 관 (1)의 필터를 통해이 뜨는.
  12. FBS가 포함 된 두 개의 튜브의 다이제스트 상등액의 위치를 ​​교대로 소화 공정을 추가로 8 회 반복한다. 각각의 튜브에서 동일한 양을 보장하기 위해 관 (1)과 (2) 사이에 균등 최종 상등액을 분할.
    참고 : 각 컬렉션 튜브는 현재 세포 현탁액의 32.5 ml의 총 부피를 포함합니다.
  13. 튜브가 포함 된 원심 분리기4 ° C에서 6 분의 상층 액 150 XG를 보내고.
  14. 소화 씩을 수집하는 동안, 접시 당 (10 % FBS, 1X 펜 연쇄상 구균, 1 배 L 글루타민과 둘 베코의 변형 이글의 미디어 (DMEM)) 미디어의 6 ㎖로 오 100mm의 조직 배양 플레이트를 준비합니다. 미디어를 평형 30 분 동안 37 ° C, 5 % CO 2에서 이러한 분취 량을 품어.
  15. 모두 수집 튜브에서 세포 결합 된 CBFHH 효소 혼합물 대기음 상기 제조 배양 배지의 30 ㎖로 세포를 재현 탁.
  16. 100 밀리 판의 각 세포 현탁액의 6 mL로 돌아가서 37 ° C에서 45 분 동안 품어.
  17. (섬유 아세포 분획 접시에 접착하기 시작하고, 원하는 경우 별도로 성장 될 수있다) 인큐베이션의 끝에, 5 새로운 요리에 비 부착 세포를 전송하고 45 분 동안 다시 배양한다.
  18. 프리 도금의 두 번째 라운드의 끝에서, 요리의 미디어 및 비 - 부착 세포를 수집하고 (150)에 미디어를 스핀6 분 XG.
  19. (관류 액 100 ㎕의 구조 당 4.0 × 10 5 세포)를 대략 원하는 농도로 세포를 가지고 초과 용지를 그립니다. 계산 및 또는 생존 능력 테스트 (14)에 대한 나누어지는을 제거합니다.

P3 심장 매트릭스 6. 생물 반응기 Recellularization

  1. 밤새 세포를 첨가하기 전에 배지 (단계 5.15 참조)와 격리 심장 매트릭스를 전처리.
  2. 도에 나타내는 바와 같이 랑겐 돌프 시스템의 요소들을 조립한다. 이. 유리 부를 오토 클레이브 산화 에틸렌 멸균을 보증하기 위해 플라스틱 부품 살균. 시스템의 다양한 서브 유닛이 지지대 상에 장착되기 전에 층류 후드에서 조립 될 수있다. 순환 수조 가열 수류는 명확성을 위해 생략되었다.
  3. 조직 배양 배지 120 ml에 함께 조립 된 시스템을 작성한다 (단계 5.15 참조).
  4. 60 밀리미터 막 다른의 단계 2.14에서 카테터 심장 매트릭스를 배치배율 아래 진짜야 요리 카테터에 단계 5.20에서 세포 현탁액로드 × 1 바늘 22 G와 1 ML의 주사기를 연결합니다. 이 어셈블리는 마음을 embolizing 피하기 위해 기포가 없는지 확인합니다.
  5. 부드럽게 통한 관상 동맥 심장 행렬에 세포 현탁액 100 μl를 관류. 완료되면, 주사기 / 바늘 조합을 분리합니다.
    참고 : 약의 느린 관류. 분당 20 μL가 심장 천이, 정맥 유출 셀을 방지 할 필요가있다.
  6. 생물 반응기 심장 병 뚜껑의 아래쪽에있는 루어 피팅에 고정 된 22g 무딘 스텁으로, 그루터기에 카테터를 밀어 넣습니다.
  7. 연동 펌프를 시작하고 그림 2에 설명 된대로 진행하는 것이 관찰한다. 저수지에서 흐름의 진행 단계 2.5에서 대동맥에 배치 카테터 (그림. 2에서 빨간색 경로)에 버블 트랩을 통해 펌프를 통해. 정맥에서 심장 순환 흐름을 관찰미디어 저장소에 정점, 재순환에서 s와 똑.
    주 : 관류 유량 같은 구조의 혈관 저항 및 심장의 크기이지만 100 μL 내지 50의 비율로 각각의 요인에 의존 / 분 좋은 출발점이다. 중간 시점에서, 관능 평가가 수행 될 수있다. 신생아 recellularized 심장의 크기 규모는 수행 할 수 있지만, 우리는 광학 기반 시스템 그들이 성인 쥐 마음에 사용 된 것처럼 동작을 치고 정량화하는 데 사용할 수있는 것으로 확인의 평가를 제한한다. 4 구조는 확장을 위해 관류 할 수 있습니다 (23 시간까지) 시간의 기간.

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결과

탈세 포화
평균적으로, 이러한 프로토콜을 사용하여 P3 심장 탈세 포화까지의 시간은 약 14 시간이다. P3의 신생아 23 mg의 평균 심장 무게 주어진.

Acellularity
도 3a는 완전히 그대로 P3 신생아 마음을 (전체 마운트). 그림 3b는. 탈세 포화 다음과 같은 마음을 보여줍니다도 4a 및도 각각 손상 및 decellularized 마음의 헤 마톡 실린 및 에오신 염색을 보여 4b는 보여줍니다. 헤 마톡 실린 긍정적 인 핵의 부재와 decellularized 마음에 호산 구조의 감소에 유의하십시오. 또한, decellularized 마음의 DNA 함량이 크게 그대로 마음...

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토론

마음의 반복 관류에이 기술의 의존도는 색전증을 피하기 성공적인 결과의 중요한 구성 요소를 만든다. 단계 2.8-2.14 사이의 솔루션의 변화 단계 2.2-2.6의 심장의 초기 카테터,에서, 어떤 타협 심근에 관류의 흐름을 기포의 도입을 허용 할 수 있습니다 조작이 있습니다. 때문에 신생아 심장의 소형 크기로, 혈관에 미세한 기포 따라서 불완전 탈세 포화 렌더링, 기술 경색의 원인이 될 수 있습니다. 또한, 나중에 세척 단계에서, 불완전 관류에 부정적인 영향을 생체 적합성 세제 잔류 물이 발생할 수 있습니다. 변화에 용액으로부터의 가스 움직임을 용해 할 때 또한 기포 형성의 원인이 될 수있는 또, 단계 2.14에 제시된 바와 같은 4 ℃로 보관 중 매트릭스를 제거 할 때와 같은 급격한 온도 변화는주의 접근해야 온도입니다. W주입을 위해, 세포 현탁액에 주사기를 준비 할 때, 부가적인 치료가 적용되어야 recellularization로 진행 편 무료 버블 (6.4 공정)이다.

이...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

저자는 피규어를 준비한 Ms. Cynthia DeKay에게 감사의 뜻을 전합니다.

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재료

6. pre-plating
이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1입니다. 마우스 심장 격리 재료
P1 마우스 새끼(그림 참조; 나6; D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J)Jackson Laboratories21577또는 동급
60mm 배양 접시BD Falcon353004또는 동급
, 인산염 완충 식염수, pH 7.4(멸균),HycloneSH30256.01또는 동급
, 일회용 블레이드Stanley28-510또는 동급
표준 가위Moria Bonn(Fine Science Tools)14381-43또는 동급
스프링 가위, 10cmFine Science Tools15024-10또는 동급
Vannas Spring Scissors - 3mm Cutting EdgeFine Science Tools, 15000-00또는 동급
#5 ForcepsDumnot (Fine Science Tools)11295-00또는 동급
2. 탈세포화
입구 어댑터ChemglassCG-1013오토클레이브 가능
SeptumChemglassCG-3022-99오토클레이브 가능
1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex 튜빙Cole-ParmerEW-06422-10오토클레이브 가능한
남성 루어에서 1/8" 호스 바브 어댑터McMaster-Carr51525K33오토클레이브
가능한 여성 루어에서 1/8" 호스 바브 어댑터McMaster-Carr51525K26오토클레이브 가능한
Prolene 7-0 수술용 봉합사 Ethicon8648G또는 동급
링 스탠드Fisher ScientificS47807또는 동급
클램프Fisher Scientific05-769-6Q또는 동급
클램프 정규 홀더Fisher Scientific05-754Q또는 동급
60 cc 주사기 배럴 Coviden1186000777T또는 동급
BeakerKimble14000250또는 동급
22G x 1 주사기 바늘BD305155또는 동급
12cc 주사기Coviden8881512878또는 동급
3방향 정지 콕Smith MedicalMX5311L또는 동급
PE50 튜빙BD Clay Adams Intramedic427411열에 의해 성형될 수 있어야 합니다. 폴리에틸렌 권장.
1% SDSInvitrogen15525-017초순수 등급 권장. 신선한 용액을 만들고 필터는 사용하기 전에 살균하십시오.
1% 트리톤 X-100 Sigma-AldrichT878710% 재고에서 신선한 용액을 만들고 필터는 사용 전에 살균합니다. 
멸균 dH2OHycloneSH30538.02또는 MilliQ 시스템 정제수.
1x 펜/스트렙코닝 CellGro30-001-Cl또는 동급
 
3입니다. DNA 정량화를 위한 물질
Proteinase KFisherBP1700>30 U/mg 활성
KClSigma-AldrichP9333또는 이에 상응하는
MgCl2· 6H2OMallinckrodt5958-04또는 동급
트윈 20 Sigma-AldrichP1379또는 동등한
Tris base/hydrochlorideSigma-AldrichT1503/T5941또는 동등한
Pico-Green dsDNA 분석 키트Life Technologies P7589형광계가 판독해야 합니다
4. 조직의 고정 및 절편 방법
파라포름알데히드Sigma-AldrichP6148또는
돼지 껍질의 동등한 젤라틴 A형Sigma-AldrichG2500300 블룸 이상이어야 합니다
5. 조직 조직학 방법
Cryomolds 10 x 10 x 5 mmTissue-Tek4565또는 동등한
CryostatHacker/BrightModel OTF또는 동등한
현미경 슬라이드  25 x 75 x 1 mmFisher Scientific12-550-19또는 동등한
Hematoxylin 560 Surgipath/Leica Selectech 3801570또는 이에 상응하는
EthanolDecon Laboratories2701또는 이에 상응하는
DefineSurgipath/Leica Selectech 3803590또는 이에 상응하는
블루 버퍼 Surgipath/Leica Selectech 3802915또는 이에 상응하는
알코올 중독자 Eosin Y 515 Surgipath/Leica Selectech 3801615또는 동등한
Formula 83 Xylene 대체품 CBG 바이오텍 CH0104B또는 이에 상응하는
Permount Mounting Medium 피셔 케미컬 SP15-500또는 동급
Collagen IV 항체Rockland600-401-106.1또는 동급
α-Actinin 항체AbcamAB9465또는 동급
mCherry 항체AbcamAB205402또는 동급
NKX2.5 항체Santa Cruz BiotechnologySC-8697또는 동급
의 Donkey anti-mouse AF488 항체Life TechnologyA21202또는 이에 상응하는
Donkey anti-chicken AF594 항체Jackson Immunoresearch703-585-155 또는 이에 상응하는
당나귀 안티 염소 CY5 항체Jackson Immunoresearch 705-175-147또는 동급
Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594Jackson Immunoresearch111-587-003또는 동급
ThermoFisherP36930또는 동급Prolong Gold Antifade Mountant <
HBSS (Ca, Mg Free)HycloneSH30031.02또는 동급
HEPES (1 M)Corning CellGro25-060-Cl또는 동급
Cell StrainerBD Falcon352340또는 동급
50 ml 튜브BD Falcon352070또는 동급
Primeria 100 mm를 사용하여 신생아 심실 심근세포 분리 Primeria 표면353803Corning섬유아세포 부착을 강화하여 더 높은 근세포 순도를 촉진합니다
TrypsinDifco215240또는
동등한 DNase IISigma-AldrichD8764또는 동등한
DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media)HycloneSH30022.01또는
동등한 비타민 B12 Sigma-AldrichV6629또는 동등한
Fibronectin 코팅 플레이트 BD Bioscience354501또는 이에 상응하는
태아 소 혈청 HycloneSH30910.03또는 동급
심장 생물반응기 유리 제품Radnoti Glass Technology120101BEZ오토클레이브 또는 가스로 멸균할 수 있어야 합니다.
, , , , 의 , 의 용 재료 는 은 의 , , 의 , 의 , 의 의 DAPI 의td colspan="4"> 플레이트는 . 의

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